Методическая статья

Биолюминесценция изображений из иммунокомпетентных животной модели для глиобластомы

16.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/53287

⸱

15 января 2016 г.

 ,  ,  , 
1Department of Neurological Surgery, University of California San Francisco, 2Department of Neurological Surgery, Northwestern University Feinberg School of Medicine, 3Biochemistry and Molecular Genetics, Northwestern University Feinberg School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

Клетки глиомы

GL261 обеспечивают полезную иммунокомпетентную животную модель глиобластомы. Целью данного протокола является демонстрация надлежащих методов мониторинга внутричерепного роста опухоли с использованием биолюминесцентной визуализации in vivo, а также проверка полезности модифицированных люциферазой клеток GL261 для изучения иммунологии опухолей и иммунотерапевтических подходов к лечению глиобластомы.

Аннотация

В отличие от широко известных животных моделей ксенотрансплантатов глиомы человека, ксенотрансплантаты мышиной глиомы GL261 повторяют почти все соответствующие клинические и гистопатологические особенности заболевания человека. Когда клетки GL261 имплантируются внутричерепно сингенным мышам C57BL/6, модель имеет дополнительное преимущество в поддержании интактного иммунного микроокружения. Стабильная экспрессия люциферазы в клетках GL261 позволяет проводить неинвазивный экономически эффективный биолюминесцентный мониторинг роста внутричерепных опухолей. Недавно мы продемонстрировали, что экспрессия люциферазы в клетках GL261 не влияет на свойства роста опухоли, экспрессию иммуномодулирующих цитокинов опухолевых клеток, инфильтрацию иммунных клеток в опухоль или общую выживаемость животных, несущих внутричерепную опухоль. Таким образом, представляется, что модель люциферазной глиомы GL261 может быть полезна при изучении новых химиотерапевтических и иммунотерапевтических методов. В этой статье мы расскажем о методе генерации стабильной экспрессии люциферазы в клетках GL261 и о том, как изучать рост опухолевых клеток in vitro и in vivo с помощью биолюминесцентной визуализации.

Введение

Злокачественная глиома — самая распространенная и самая смертельная опухоль мозга человека. Даже при максимальном хирургическом лечении, лучевой терапии и химиотерапии, медиана выживаемости остается 15-20 месяцев в специализированных центрах по лечению основных опухолей головного мозга1, 2, 3. Наиболее агрессивная форма злокачественной глиомы – глиобластома – характеризуется митотическими фигурами, неоваскуляризацией, инвазией в соседний мозг и псевдопалисадным некрозом. Ортотопические ксенотрансплантаты опухолей головного мозга с использованием клеток опухоли головного мозга человека сыграли важную роль в исследованиях в области нейроонкологии и облегчили доклиническую трансляцию для тестирования новых агентов до начала клинических испытаний на людях. В то время как большинство моделей ксенотрансплантатов человека повторяют многие особенности заболевания человека, фундаментальным ограничением всех модельных систем ксенотрансплантатов на основе человека являетсяиспользование животных с иммунодефицитом.

Отсутствие интактного ответа хозяина явно изменяет рост опухоли как с точки зрения морфологии опухоли, так и с точки зрения эффективности приживления. В то время как некоторые предположения приемлемы при интерпретации результатов ксенотрансплантированных моделей, достижение соответствующих выводов в области терапевтической оценки является сложной задачей. Некоторые фундаментальные биологические особенности, вероятно, схожи у иммунодефицитных и иммунокомпетентных животных, но другие, такие как опухолеассоциированное воспаление, инвазия тканей, реакция на травму, вероятно, сильно отличаются. В отличие от этого, GL261 представляет собой химически индуцированную линию клеток глиомы мышей, которая точно повторяет глиому при имплантации в мозг иммунокомпетентных сингенных мышей C57BL/6. Как и при заболевании человека, быстрый и воспроизводимый рост внутричерепной опухоли приводит к неврологическим симптомам и гибели животных6-10.

Рост подкожной опухоли можно измерить напрямую. Рост внутричерепной опухоли можно измерить только с помощью жертвоприношения животных или с помощью дорогостоящих визуализирующих исследований. Стабильная экспрессия фермента люциферазы позволяет проводить неинвазивную и экономически эффективную интракраниальную биолюминесцентную визуализацию11. Биолюминесценция трансфицированных люциферазой клеток GL261 хорошо коррелирует с внутричерепным опухолевым ростом. Недавно мы напрямую сравнили GL261 с модифицированными люциферазой клетками GL261 и не продемонстрировали различий в росте и инвазии in vitro, иммунологическом цитокиновом профиле, выживаемости in vivo мышей с внутричерепной опухолью C57BL/6 или инфильтрате иммунных клеток. Этот метод применим к доклиническим исследованиям глиобластомы, которые включают неинвазивный мониторинг роста опухоли.

Протокол

Все процедуры, описанные ниже, были рассмотрены и одобрены Институциональные использования животных и ухода комитета при Северо-Западном университете и были выполнены в соответствии с стерилизованных условиях.

1. Изменение GL261 клеток с Светлячок люциферазы выражая Reporter

Примечание: ВИЧ-1 на основе лентивирусов векторов выражают люциферазы светлячка (Fluc) под контролем селезенки внимание образующего вируса (SFFV) промотора. Ген оптического репортер был клонирован в вектор плазмиды pHRSIN-CSGW-dlNotI.

  1. Поддержание 293-Т-клеток в модифицированной среде Дульбекко Игла (DMEM), дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и GL261 клеток в RPMI среде, дополненной 10% FBS и 1% пенициллина-стрептомицина при 37 ° С в увлажненной атмосфере, содержащей 95 % воздуха и 5% углекислого газа (CO 2).
  2. Когда культура 293-Т-клеток достигает 80% слияния в Т-75 колбу, промыть клетки один раз телosphate буфера солевым раствором (PBS), без Са2 + и Mg2 +, инкубировать клетки с 3 мл трипсина (0,05%) при 37 ° С в течение 5 мин, измельченного в порошок с 5 мл пипетки, удерживая колбу слегка наклонно и собрать все клетки из нижней части колбы. Перенести 3 мл клеточной суспензии трипсином в 15 мл коническую трубку, и добавить 7 мл RPMI среде плоти (в общей сложности 10 мл клеточной суспензии).
  3. Смешайте клеточной суспензии и с 5 мл пипетки. Возьмите 100 мкл клеточной суспензии из трубы и подсчитать количество клеток с использованием гемоцитометра. Для этого смешайте 100 мкл клеточной суспензии с 300 мкл трипанового синий раствор и вставьте 2 мкл смеси в гемоцитометра. Подсчитайте количество клеток без голубого окрашивания от четырех отдельных видах под микроскопом. Нормальное количество клеток из каждой точки зрения, так как это число представляет 10 4 клеток / мл.
  4. Между тем, центрифугирование трубки, содержащей суспензию клеток на 300 мкг в течение 7 минут. Аспирируйте СМИ и ресуспендирования ячейки гранул со свежим RPMI среде, чтобы сделать GL261 клеточной суспензии при плотности 1,0 х 10 6 / мл. Семенной 2,5 х 10 6 GL261 клетки с 2,5 мл RPMI СМИ в колбу Т-175 с 27,5 мл DMEM (1 день).
  5. Через 24 часа, замените носитель с 20 мл свежего DMEM (день 2).
  6. Для получения вектора лентивирусов, смешать 54 мкл реагента для трансфекции с 2 мл бессывороточной среды DMEM в течение 5 мин. Добавить 3 мкг затычки-Pol, 3 мкг вируса везикулярного стоматита G оболочки (VSV-G), и 4,5 мкг Fluc (pSIN-Fluc) в среде DMEM с реагента для трансфекции, и инкубируют в течение 20 мин при комнатной температуре. Отбросьте всю смесь ДНК в 293-Т колбу (трет-175) и инкубируют при 37 ° С во влажной камере, содержащей 95% воздуха и 5% CO 2 в течение 48 ч (день 2).
  7. Добавьте 10 мл свежего DMEM в 24 ч после трансфекции (общий объем клеточной культуральной среды 293-Т должна быть примерно 30 мл) (3 день).
  8. Чтобы разделить GL261 клетки в24-луночный планшет, промыть клетки один раз ЗФР без Са2 + и Mg2 +, инкубировать клетки с 5 мл трипсина (0,05%) при 37 ° С в течение 5 мин, измельченного в порошок с 5 мл пипетки, удерживая колбу слегка наклонены , собрать все клетки из нижней части колбы, и клетки рассчитывать через гемоцитометра, как на стадии 1.2. Между тем, центрифугировать пробирку при 300 х г в течение 7 мин. Аспирируйте СМИ и ресуспендирования ячейки гранул со свежим RPMI среде, чтобы сделать GL261 клеточной суспензии при плотности 2,5 х 10 4 / мл. Семя 2,5 х 10 4 клеток GL261 с 1 мл RPMI СМИ в 24-луночного планшета (день 3).
  9. Сбор 30 мл лентивирусов супернатанта с помощью 10 мл пипетки из колбы 293-Т (Т-175) на 48 ч после трансфекции и передачи супернатант в 50 мл коническую трубку. Аспирируйте 30 мл лентивирусов супернатант с помощью 50 мл шприца, через шприцевой фильтр 0,22 мкм, и аликвоту супернатанта вируса в 1 мл аликвоты (4 день).
  10. Замените 1 мл RPMI среднего GL261 клеток пластины (24-луночные) с 1 мл супернатанта лентивирусов и инкубировать при 37 ° С во влажной камере (4 день).
  11. После 48 ч в лентивирусов инфекции, заменить жидкость с 1 мл свежей RPMI с (6 день).
  12. Через 24 часа, повторить лентивирусов инфекцию GL261 клеток (7 день).
  13. После 2-го 48 ч лентивирусных инфекции, заменить жидкость с 1 мл свежей RPMI с (9 день).
  14. Продолжают расти люциферазы модифицированный GL261 клетки (которые будут называться GL261.luc клеток) и расширить культуры клеток к Т-75 колбу.
  15. Когда культура GL261.luc клеток достигает 70% слияния в Т-75 колбу, урожай клеток трипсинизацией и рассчитывать на гемоцитометра, как в шаге 1.2. Пластина ячейку GL261.luc в 24-луночного планшета на выпускников плотностей (1,0 х 10 6, 5,0 х 10 5 2,5 х 10 5 1,0 х 10 5 5,0 х 10 4 2,5 х 10 4 клеток / лунку) и инкубировать при 37 ° С в увлажняемомFied камеру, содержащую 95% воздуха и 5% CO 2 в течение 3 ч.
  16. Измерьте сотовой активность люциферазы по отношению к люциферазы модифицированный U-87 MG (U87.luc) клеток с использованием биолюминесценции томография (рисунок 1).
    1. Запустите программу изображения (нажмите значок на рабочем столе) и инициализации системы визуализации (нажмите кнопку "Initialize"). Инициализация начнется автоматически и может занять несколько минут для системы проверки и камеры для охлаждения до -90 ° C.
    2. Добавить 25 мкл люциферин (D-люциферин калиевой соли, 150 мг / кг) в каждую лунку.
    3. Инкубируйте клетки с люциферин в течение 1 мин при комнатной температуре и изображения пластины в течение 10 сек. Чтобы настроить систему визуализации, выберите "люминесцентных", "10 сек" время экспозиции, и «средний» биннинга. Поместите 24-луночного планшета на изображения станции и нажмите кнопку "Снимок", чтобы начать изображение.
    4. После того как изображение будет успешно приобрела, вы увидите окно изображения и инструмент годовыхLette на экране. Нажмите "ROI (области интереса) Инструменты» и выберите 6 х 4 с помощью значка щели. Создать 6 х 4 щели, чтобы покрыть площадь сигнала на изображении пластинки 24-а и щелкните вкладку измерений (значок карандаша). Соблюдайте окно с таблицей измерений ROI в качестве единицы фотонов в секунду на стерадиан на квадратный см (фотонов / сек / SR / см 2).
    5. Использование U87.luc клетки, предварительно модифицированный же лентивирусов, используемого здесь модификации GL261 11, в качестве контроля для оценки активности люциферазы в клетках GL261.luc трансдуцированных.

2. Экстракорпоральное пролиферации

  1. Когда клеточные культуры GL261 и GL261.luc до 70% слияния в Т-колбе 75, урожай Обе клеточные линии обработкой трипсином и подсчитать, как на стадии 1.2, и пластинчатые элементы в 96-луночный планшет при плотности 1500 клеток на 80 мкл RPMI среде в хорошо используя многоканальную пипетку, чтобы свести к минимуму время и ошибки пипетирования. Серед каждая клетка линия в общей сложности 20 скважин. Чтобы ограничить испарение в лунках населенных клеток, заполнения пустых лунок 100 мкл свежей RPMI среде.
  2. Оценка клеточной пролиферации с использованием колориметрического анализа клеточной пролиферации. Здесь мы используем клеточной пролиферации МТС. Используя пипетку многоканальный, добавить 20 мкл МТС реагента в каждую лунку 96-луночного планшета, содержащего клетки.
  3. Инкубируйте планшет при 37 ° С во влажной камере, содержащей 95% воздуха и 5% CO 2 в течение 3 ч. Измерить поглощение при 490 нм с использованием микропланшет-ридера. Это повторяется в дни 1, 2, 4 и 7, после посева. Для нормализации значения абсорбции, значения каждый день делятся на соответствующие показания, полученные в 1-й день (рис 2).

3. имплантации опухолевых клеток

Примечание: Автоклав все оборудование. Подготовка хирургического области путем распыления дезинфицирующего (2% раствор хлоргексидина) и накрыть absorbenт. драпировки Для того, чтобы поддерживать стерильные условия, носить стерильные хирургические перчатки во время операции, и разделить хирургическое площадь в двух областях по цвету ленты. Площадь 1 помечен "Чистый" и содержит стерилизованные поставок; Область 2 помечен "Грязные" и содержит использованы материалы.

  1. До операции животных, подготовить клеточную суспензию для инъекций внутричерепного. Урожай клетки от 70% сливной Т-75 колбу обработкой трипсином и подсчитать клетки через гемоцитометра, как на стадии 1.2, и сделать клеточную суспензию при плотности 1,0 × 10 5 клеток / мкл в Хэнкса сбалансированном солевом растворе без Ca 2+ и Mg 2+ (HBSS).
  2. Обезболить мышей интраперитонеальной инъекции 200 мкл смеси, содержащей 100 мг / кг кетамина и 10 мг / кг ксилазина в 0,9% физиологическом растворе. Чтобы подтвердить надлежащее обезболивание, щепотка палец мыши. Если мышь находится полностью под наркозом, мышь не должна реагировать на раздражитель.
  3. Администрирование 0,1 мг / кг бупренорфин с помощью подкожных инъекций, чтобы облегчить послеоперационную боль.
  4. Бритье верхней части головы животных с использованием машинки для стрижки и чистый с хлопком наконечником аппликатором, смоченным в 2% -ном растворе хлоргексидина. Применить глазную мазь, чтобы поддерживать необходимую смазку во время операции.
  5. Сделайте надрез сагиттальной длиной около 1 см от теменно-затылочной кости, используя стерильным скальпелем. Для визуализации брегмы, протрите поверхность черепа с хлопка наконечником аппликатора, смоченной в 3% растворе перекиси водорода.
  6. Дрель череп со стерильным 25-G иглы, чтобы сделать небольшое отверстие 3 мм справа от темени и просто за венечного шва.
  7. Чтобы гарантировать, что внутричерепное месте инъекции на глубину 3 мм от черепа, сократить 3 мм ОТ заостренным концом пипетки 20 мкл с помощью ножниц и вставить шприц в пипетки.
  8. Вставьте шприц перпендикулярно к отверстию созданной ранее и медленно вводить опухолевых клеток SUSпенсии, содержащий 3,0 × 10 5 клеток в 3 мкл HBSS, в течение 1 мин. Оставьте иглу на месте в течение другой минуты, а затем медленно вытяните иглу.
  9. Тампон череп с хлопком-наконечника аппликатора, смоченным в 3% перекиси водорода и 2% раствором хлоргексидина. Высушите поверхность черепа с хлопка наконечником аппликатора. Вырезать из стерильной кости воск приблизительно 3 мм 3 в размере и прикрепить кости воск на торцевой стороне хлопка-наконечника аппликатора. Нанесите воск кости, чтобы покрыть отверстие с хлопка наконечником аппликатора.
  10. Нарисуйте каждую сторону головы вместе над черепом с помощью щипцов, и главный, чтобы закрыть рану. Очистите рану ватным кончиком, смоченным в 2% -ном растворе хлоргексидина.
  11. Контроль всех мышей после операции, пока они не станут амбулаторно и сохранить нормальную деятельность. Как правило, время восстановления составляет приблизительно 30 мин. Не вернуть мышей в клетку с другими животными, пока они не полностью оправился от наркоза.

4. Биолюминесценция Визуализация GL261 опухолевого роста

  1. Спрей щедрое количество дезинфицирующего средства (0,05% раствор диметил хлорида аммония) на чистую бумажным полотенцем. Используйте дезинфицирующее пропитанной бумажной салфеткой, чтобы вытереть тщательно черный лист, конусы и делитель внутри изображения камеры, где животные будут находиться в контакте с устройством. Тщательно протрите все поверхности чистой сухой бумажной салфеткой. Повторите это еще раз и ждать 5 мин.
  2. Инициализация изображения станцию, как в шаге 1.14.1.
  3. Обезболить мышь с 300 мкл смеси, содержащей 200 мкл / ксилазина Кетамин и 100 мкл люциферин (D-люциферин калиевой соли, 150 мг / кг) путем внутрибрюшинной инъекции.
  4. Подождите 10 минут после инъекции и подтвердить, если мышей полностью под наркозом, зажимая хвост. Чтобы настроить систему визуализации, выберите "Люминесцентные", "Auto" время экспозиции, и «средний» биннинга. Поместите мышей на стати изображений, и нажмите кнопку "Снимок", чтобы начать изображение. Убедитесь, что время после инъекции согласуется с каждой сессии изображений.
  5. После того как изображение будет успешно приобрела, должно появиться окно изображения и палитра инструментов. Нажмите кнопку "ROI Инструменты" и выберите "Auto" в виде круга. Чтобы определить трансформирования, окружить площадь сигнала на изображении, а затем проводить измерения ROI в качестве единицы фотонов / сек / SR / см 2.
  6. Возьмите мышей из изображения камеры и контролировать мышей, пока они не стали, передвигающихся и сохранить нормальную деятельность. Обычно время восстановления составляет приблизительно 15 мин. Не вернуть мышей в клетку с другими животными, пока они не полностью оправился от наркоза.
  7. Монитор роста опухоли визуализации биолюминесценции два раза в неделю, пока животные не представляют следующие симптомы: потеря веса (потеря более 20% по отношению к весу до имплантации), отсутствие аппетита (анорексия полная в течение 24 часов), а также отсутствие устойчивого purposefuл ответ на нежной стимулов (слабая попытка встать), и в это время они должны быть умерщвлены. Эвтаназии животных с этими симптомами с использованием СО 2 камеры с последующим смещением шейных позвонков.
    1. Место мышей в камере эвтаназии (не переполнены камеры) и приток сжатого CO 2 в течение 5-6 мин. Заметим, что все животные сознания и не дышит примерно через 5 мин.
    2. Возьмите мышей из камеры. Убедитесь, что сердце не бьется, чувствуя грудь между большим и указательным пальцами и убедитесь, что нет мигают рефлекс.
    3. Задержите мышь в положении лежа на плоской поверхности и понять затылок в основании черепа с одной стороны, и основания хвоста с большим и указательным пальцами другой руки.
    4. Задержите голову и быстро вытащить хвост назад. Убедитесь, что череп отделяется от первого шейного позвонка, используя ваш большой палец и первый палец.
  8. НормаAlize значения люминесценции на каждый день от соответствующих показаний, полученных в первый день съемки биолюминесценции как на этапе 2.3 (фиг.3А).
  9. Для статистического анализа, генерации кривых выживаемости, используя Kaplan-Meier оценивания 12 и сравнить различия между кривыми выживаемости с использованием лог-рангового 13.

Результаты

GL261 клетки были инфицированы люциферазы, содержащей лентивирус, как описано выше в шагах 1. В пробирке биолюминесценции изображений демонстрирует сильную экспрессию люциферазы, похожий на уровнях положительного контроля U87.luc линии клеток глиобластомы человека (рис 1). Как и ожидалось, неинфицированных клеток GL261 не демонстрируют выражение фон люциферазы. Этот шаг является простой, но решающее значение для выполнения до дальнейших исследований с использованием зараженного клеточную линию, чтобы подтвердить стабильную экспрессию люциферазы.

Люциферазы выражение после внутричерепного имплантации.

Перед внутричерепного имплантации, мы не выявили никакой разницы в пробирке темпов роста по сравнению с GL261.luc GL261 клеток (рисунок 2). Для внутричерепного роста и анализа выживаемости клетки вводили в брAINS из мышей C57BL / 6 согласно протоколу Шаг 3. Рост опухоли у мышей, несущих опухоли GL261.luc серийно анализировали изображений биолюминесценции использованием протокола шаг 4 и продемонстрировали обнаруживаемого роста опухоли (фиг.3А). Мыши быстро и последовательно, несущие опухоли GL261.luc стал умирающий и умерщвляли. Важно отметить, что нет никакой разницы в общей выживаемости между GL261.luc и GL261 животных с опухолью (фиг.3В). Поэтому в естественных условиях биолюминесценции изображений может быть использован для мониторинга ответа на экспериментальных процедур глиобластомы. Быстрое надежное рост опухоли и короткий общей выживаемости может дать большие объемы данных в относительно короткий промежуток времени.

figure-results-1
Рисунок 1. Активность люциферазы в клетках GL261.luc. U87.luc, GL261.luc и GL261 (отрицательный контроль) клетки высевали при плотности1.0 х 10 6, 5,0 х 10 5 2,5 х 10 5 1,0 х 10 5 5,0 х 10 4 и 2,5 х 10 4 клеток / лунку слева направо. Люминесценция (фотон / сек / SR / см 2) была измерена с помощью изображений Lumina станции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-2
Рисунок 2. Выражение люциферазы не влияет пролиферацию клеток GL261. GL261.luc клетки не вызывают Разница в пролиферации, как показано на МТС клеточной пролиферации. График показывает кратное увеличение, по отношению к 1 день, а определяется путем сравнения среднее значение оптической плотности (среднее ± SEM) в момент времени thespecified к среднему значению в 1 день (неспаренных значения Т для -test сравнениймежду каждой клеточной линии: Р = 0,7796) 14. Усы представляют собой средние значения (среднее ± SEM) от четырех экземплярах образцов на каждый день. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-3
Рисунок 3. Выражение люциферазы дозы не влияет на в естественных условиях роста опухоли и выживания животного. (А) контроль Биолюминесценция демонстрирует поступательный рост внутричерепного опухоли GL261.luc в C57BL / 6 мышей. (Б) анализ выживаемости Каплана-Мейера не демонстрирует никакой разницы в общей выживаемости для мышей, имплантированных интракраниально либо с GL261 (сплошная линия) или GL261.luc клеток (пунктир).Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Обсуждение

GL261 мышиный Клетки глиомы, при имплантации в сингенных интракраниально иммунокомпетентных мышей C57BL / 6, имеют несколько преимуществ по сравнению с моделями ксенотрансплантата человека животных глиомы. Многие из ксенотрансплантированной опухолей растут в виде инкапсулированных повреждений, которые точно не повторять инвазивный болезни человека. В отличие от этого, опухоли GL261 не только демонстрирует вторжение в соседнее мозга, но и образование новых сосудов, митотических фигур, и глубокое некроза 7. Наиболее важно при изучении иммунологии опухоли или иммунотерапевтических стратегии 15, 16, C57BL / 6 мыши сохраняет нетронутыми иммунной системы 8. Предыдущие исследования показали, надежную экспрессию цитокинов иммуносупрессивной TGF-бета и внутричерепные опухоли содержат иммуносупрессивных Т-регуляторные клетки, похожие на человека глиобластомы 9, 10.

Простой метод, описанный здесь позволяет стабильной экспрессии люциферазы по GL261 клеток. Мы недавно сообщили СимиLAR в пробирке и в естественных условиях роста клеток GL261.luc сравнению с GL261 клеток, в дополнение к аналогичным характеристикам опухоли гистологических и иммунной клетки проникают 17. GL261.luc клетки, стабильно выразить люциферазы, который катализирует окисление субстрата люциферин преобразования химической энергии в фотоны и, следовательно, детектируемого света. Люциферин можно безопасно вводить животным и пересекает гематоэнцефалический барьер после внутрибрюшинного или внутривенного введения. В небольших лабораторных животных, таких как мыши, биолюминесценции могут быть обнаружены снаружи в неинвазивным способом 11. Таким образом, рост опухоли может быть оценена последовательно без необходимости принесения в жертву животных или дорогостоящего МРТ или КТ.

Критические шаги в протоколе включать, не только Lentiviral трансдукции, но и проверку стабильной экспрессии люциферазы в пробирке до начала каких-либо естественных условиях в эксперименты. Потеря трансдукции может requiRe повторного лентивирусом инфекции. Введение гена резистентности к антибиотику в вектор экспрессии также могут быть использованы для отбора экспрессии люциферазы. Тщательное техники требуется для внутричерепного имплантации воспроизводимо место последовательное число клеток в точном анатомической локализации, чтобы позволить сравнение различных группах лечения. Основное различие между текущей и исследования предыдущих исследований люциферазы экспрессирующих клеток GL261 является использование свободного техники рук для имплантации клеток по сравнению с использованием стереотаксической рамки 18. Ранее мы показали стабильные результаты имплантации свободной технике ручной 19. Преимущество свободной технике ручной является возможность выполнить высокую пропускную способность анализ различных агентов обработки. В наших руках, мы можем имплантировать около 60 животных в 1 ч.

После овладения техникой, будущие приложения в технике безграничны. Как GL261 demonstrАтеш повышенные митозы и быстрый рост опухоли похожи на человека глиобластомы, анти-пролиферативные лечения могут быть оценены. Аналогично, анти-инвазивные и антиангиогенные терапии могут быть использованы в качестве GL261 опухоли инвазивных и ангиогенных. С осторожностью следует применять при оценке влияния химиотерапевтических агентов, направленных на человека целей. По сравнению с предыдущими исследованиями с использованием глиобластомы человека, выражающие ксенотрансплантаты люциферазы 20, это будет рассматриваться как ограничение нашей модели. Кроме того, эффект иммунотерапии стратегий роста опухоли могут быть изучены в ксенотрансплантированной модели GL261.

Раскрытие информации

Нет никаких конфликтов интересов, которые можно было бы раскрыть.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить Раджванта Каура за техническую помощь. Мы хотели бы поблагодарить Максвелла Тома за помощь в подготовке лентивируса. Эта работа была поддержана кафедрой хирургии опухолей основания черепа в Калифорнийском университете в Сан-Франциско и профессором и заведующим кафедрой Майкла Дж.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
D-люциферин, калийная соль золотобиотехнологологияLUCK-100хранить вдали от света
Программное обеспечение для живого образаКалипер Науки о жизниКонтакт для котировкинет
КсеногенЛюмина Калипер Науки о жизниКонтакт для котировкинет
24-ну; Стандартная культура тканей; плоскодонныйFalcon353047
CellTiter 96 AQueous One Solution Анализ пролиферации клеток PromegaG3582нет
Synergy 2 Многорежимный считывательBioTekКонтакт для котировкинет
96 скважина Пробирная пластина, черная пластина, Прозрачное дно с крышкой, Культура тканей TretaedCoster3603нет
КетазетPfizerNDC 0856-2013-01Контрольное вещество
КсилазинСигма-Олдрич23076-35-9нет
28G Игла (со шприцем) Рыбак   22-004-270АКА инсулиновый шприц
2% хлоргексидинФишерNC9756995АКА Нолвасан"
3% перекись водородаFisherH312P-4хранить вдали от света
Офтальмологическая мазьCardinal Health1272830AKA " Слезы Аква
25G 1 1/2 иглаBD Becton Dickinson305127нет
Одноразовые скальпелиПеро2975No. 21
МарляФишер22028563Автоклав перед использованием
ГрелкаDunlapHP950нет
Степлер для кожи, скобки, ремуверStoelting59020нет
PDI Подготовка алхолаФишер23-501-711none
Reflex 7 мм Раневые зажимы 100 упаковкаBrain Tree Scientific, INC203 1000Автоклав перед использованием
Reflex 7 мм Аппликатор для раневых зажимовBrain Tree Scientific, INC204 1000Автоклав перед использованием
Reflex 7 мм Раневой зажим для удаления ранBrain Tree Scientific, INC205 1000нет
Односторонний тампон с круглым наконечником и деревянной ручкойQosmedix10107Автоклав перед применением
Сбалансированный солевой раствор Хэнкса без Ca2+ и Mg2+ (HBSS)Gibco14170-112нет
Шприц HamiltonHamilton80300нет
FuGENE 6 Реагент для трансфекцииPromegaE2961нет
Костный воскГарвардский аппарат599864нет
»

Ссылки

  1. Clark, A. J., et al. Neurosurgical management and prognosis of patients with glioblastoma that progresses during bevacizumab treatment. Neurosurgery. 70 (2), 361-370 (2012).
  2. Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. N Engl J Med. 352 (10), 987-996 (2005).
  3. Grossman, S. A., et al. Survival of patients with newly diagnosed glioblastoma treated with radiation and temozolomide in research studies in the United States. Clin Cancer Res. 16 (8), 2443-2449 (2010).
  4. Sughrue, M. E., et al. Immunological considerations of modern animal models of malignant primary brain tumors. J Transl Med. 7 (84), (2009).
  5. Ausman, J. I., Shapiro, W. R., Rall, D. P. Studies on the chemotherapy of experimental brain tumors: development of an experimental model. Cancer Res. 30 (9), 2394-2400 (1970).
  6. Zagzag, D., Zhong, H., Scalzitti, J. M., Laughner, E., Simons, J. W., Semenza, G. L. Expression of hypoxia-inducible factor 1alpha in brain tumors: association with angiogenesis, invasion, and progression. Cancer. 88 (11), 2606-2618 (2000).
  7. Cha, S., et al. Dynamic, contrast-enhanced perfusion MRI in mouse gliomas: correlation with histopathology. Magn Reson Med. 49 (5), 848-855 (2003).
  8. Ksendzovsky, A., et al. Investigation of immunosuppressive mechanisms in a mouse glioma model. J Neurooncol. 93 (1), 107-114 (2009).
  9. Biollaz, G., et al. Site-specific anti-tumor immunity: differences in DC function, TGF-beta production and numbers of intratumoral Foxp3+ Treg. Eur J Immunol. 39 (5), 1323-1333 (2009).
  10. El Andaloussi, A., Han, Y., Lesniak, M. S. Prolongation of survival following depletion of CD4 + CD25+ regulatory T cells in mice with experimental brain tumors. J Neurosurg. 105 (3), 430-437 (2006).
  11. Dinca, E. B., et al. Bioluminescence Monitoring of Intracranial Glioblastoma Xenograft Response to Primary and Salvage Temozolomide Therapy. J. Neurosurg. 107 (3), 610-616 (2007).
  12. Kaplan, E. L., Meier, P. Non-parametric estimation from incomplete observations. J. Am. Stat. Assoc. 53, 457-481 (1958).
  13. Peto, R., Peto, J. Asymptotically efficient rank invariant procedures. J. R. Stat. Soc. Ser. A. Stat. Soc. 135, 185207(1972).
  14. Armitage, P., Berry, G., Matthews, J. N. S. Statistical Methods in Medical Research. , 4th ed, Blackwell Science. Oxford. (2001).
  15. Newcomb, E. W., et al. The combination of ionizing radiation and peripheral vaccination produces long-term survival of mice bearing established invasive GL261 gliomas. Clin Cancer Res. 12 (15), 4730-4737 (2006).
  16. Pellegatta, S., et al. Neurospheres enriched in cancer stem-like cells are highly effective in eliciting a dendritic cell-mediated immune response against malignant gliomas. Cancer Res. 66 (21), 10247-10252 (2006).
  17. Clark, A. J., et al. Stable luciferase expression does not alter immunologic or in vivo growth properties of GL261 murine glioma cells. J Transl Med. 12, 345-34 (2014).
  18. Abdelwahab, M. G., Sankar, T., Preul, M. C., Scheck, A. C. Intracranial implantation with subsequent 3D in vivo bioluminescent imaging of murine gliomas. J Vis Exp. (57), e3403(2011).
  19. Ozawa, T., James, C. D. Establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging. J Vis Exp. (41), (2010).
  20. Baumann, B. C., Dorsey, J. F., Benci, J. L., Joh, D. Y., Kao, G. D. Stereotactic intracranial implantation and in vivo bioluminescent imaging of tumor xenografts in a mouse model system of glioblastoma multiforme. J Vis Exp. (67), (2012).

Перепечатки и разрешения

Теги

GL261in vivo
Биолюминесценция изображений из иммунокомпетентных животной модели для глиобластомы
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.