Высокая пропускная способность Данио Rerio Анализ Расход энергии

Примечание: Этот протокол следует рекомендациям университета Аризоны Управления ответственного поведения исследований и был одобрен Комитетом по уходу и использованию животного Институциональная

1. Данио рерио эмбрионов Разведение и обслуживание

1. Подготовка E3 эмбриона среду ^8. Сделать 60x маточного раствора, растворить 34,8 г NaCl, 1,6 г KCl, 5,8 г CaCl ₂ ^● _2Н 2 О, а 9,78 г MgCl ₂ 6H ₂ ^● О в 1,95 л ddiH _{2 O.} Отрегулируйте рН до 7,2 с помощью NaOH и HCl Регулировка громкости до 2 л с использованием ddiH ₂ O.
2. Для подготовки 1x E3 эмбриона среду, развести 16,5 мл 60x запас в 1 л ddiH20. Добавить 100 мкл 1% метиленовый синий.
3. Разведение
   1. Дом Мужчина и женщина маточного стада (7 - 18 месяцев возраста) отдельно, чтобы максимизировать плодовитость.
   2. Включите огни 1 - 2 ч раньше на день раньше яйца лучшего. Настройка спаривания (1 самец и 1 - 2 самки) в CRossing клетки, как описано выше ^9. Пересечение клетки позволяют яйца, чтобы избежать хищников, как они проходят через перфорированную базе танка вставки, в которых взрослые рыбы проводятся.
   3. Дополнительно:. Для своевременной разведения (как было бы необходимо для исследований, связанных с морфолиновое инъекции), отделить мужского и женского рыбы с помощью прозрачной пластиковой перегородки, удаление это утром, приведет к своевременной кладки яиц и оплодотворения. Для морфолино исследований, выполнения расчетов мощности для оценки количества эмбриональной рыбы, необходимого на лечение. Без оценки величины эффекта или изменения, предварительный судебный можно запустить с N = 8.
4. Вылейте яйца от пересечения клетке в чашке Петри (100 - 150 эмбрионов / 10 см чашки Петри). Разрешить яйца оседают на дно тарелки и вылейте воду. Удалите оставшуюся воду с помощью тоненького кончика одноразовые пипетки передачи. Добавить еще Е3 эмбриона среду, достигнутый в шаге 1.1.
5. Сделать AFхромой полированная одноразовые пипетки для будущего яйца и передачи рыбы. Используя ножницы, вырезать окончил одноразовые пипетки передачи в 0,25 мл учебы. Для удаления заусенцев, пламя польский срез кончика над горелкой Бунзена.
6. Поддержание эмбриональных рыбу до 4 дней после оплодотворения (DPF) в 10 см чашки Петри в данио эмбрионов E3 среды на 28,5 ^○ С Два раза в день, использовать пламя полированный окончил одноразовый передачи пипетки, чтобы удалить любые неоплодотворенные яйца или мертвые эмбрионы (непрозрачный белый внешний вид). После каждого дня, заменить E3 эмбриона среды. Вылейте E3 эмбриона среду, удалить оставшуюся жидкость с помощью тоненького кончика пипетки одноразовые передачи, и добавить обратно подогретого (28,5 ^○ C) E3 эмбриона среду.

2. Подготовка Пробирной Решение

1. Приготовьте раствор для анализа соответствии с таблицей 1. Фильтр стерильный раствор для анализа, используя фильтр 0,22 мкм. Перед анализом посвящение, теплый стерильной анализа раствора в 28,5 ^○ Сводяная баня.

Таблица 1. Анализ среднего

3. Выполните Пробирной

1. Промыть эмбрионы рыбок данио 3 раза стерильной фильтрованной E3 эмбриона среды. Смешайте все жизнеспособные эмбрионы рыбок данио с муфтой в стакан. Стерильный фильтр 75 мл Е3 эмбрион среднего. Использование тонкой наконечником одноразовые пипетки передачи, вновьдвигаться столько эмбриона среды E3 от эмбрионов данио, как это возможно. Добавить еще 20 мл стерильного отфильтрованного E3 эмбриона среду. Снять и заменить E3 эмбриона среды в 3 раза.
2. Пластина 1 рыбы в каждый из 93 лунки 96-луночного черного сторону очевидно нижнюю пластину. Передача эмбриональных рыбу на тарелку индивидуально захвата эмбриона в пламя полированный окончил пластиковые одноразовые пипетки передачи (шаг 1.5) и осторожно извлечения в колодец. Перевести E3 эмбриона среду, взятую из стакан, содержащий промытый рыбу в 3 пустых скважин. Это гарантирует, что контрольные лунки были подвержены точно такой же, как воды в лунки, которые содержат рыбу. Обе скважины, которые содержат рыбу и пустые колодцы должны быть по крайней мере половиной полном объеме (200 мкл) при заключении этого шага.
3. Заменить E3 эмбриона среду с анализа решения во всех 96 скважин, в том числе пустых скважин. Этот шаг должен быть выполнен 1 колонка за один раз для каждого из 12 столбцов в 96-луночный планшет. Использование тонкой кончик одноразовые трансфер пипетки, удалить E3 эмбриона среды из каждой лунки в одном столбце пластины (8 скважин). Позаботьтесь, чтобы не коснуться данио эмбриона. Добавить 300 мкл аналитического раствора в каждую лунку, из которой воду удаляют. Повторите удаление E3 эмбриона среды и замены с анализа решения для всех 12 столбцов пластины.
4. Необязательно: Чтобы проверить изменения скорости обмена веществ в ответ на соединения, чтобы решение, которое в 100 раз (100X) желаемая концентрация лечение. Следует отметить, что гарантировать, что решение 100x не превышает 10% ДМСО, чтобы ограничить конечную концентрацию DMSO не более чем 0,1%. Добавить 3 мкл раствора 100x для каждого из очистных скважин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выполнение вычислений мощности, чтобы оценить количество очистных скважин. Тем не менее, без оценки величины ответа или изменения, предварительный судебный могут работать в 8 соединения обработанной и 8 транспортных средств обработанных скважин контроля, которые содержат рыбу.
   1. Добавить 3 мкл контроля транспортного средства контроля (нет Дрюг лечение) скважин, которые содержат рыбу. Чтобы убедиться, что флуоресцентный отклик на соединения является результатом действий внутри рыбы, применять наркотики и транспортных средств лечения до 3 пустых скважин в 96-луночного планшета.
5. Читайте рыбы, заполненный пластину на флуоресцентной ридере с длиной волны возбуждения при 530 нМ и длины волны излучения при 590 нм.
6. Место пластины в увлажненном инкубаторе установлен в 28,5 ^○ C (сохранить пластину в темноте на протяжении анализа, чтобы избежать фотообесцвечивания анализа решения). Анализ может быть запущен для периодов времени, которые варьируются от 1 часа до 24 часов. Продолжительность анализа зависит от цели исследования. Для проверки ответа на короткого действия нестабильного соединения короткий срок может быть наиболее подходящим. Тем не менее, для стабильных испытаний или тестов составных генетических эффектов, максимизации продолжительности анализа предпочтительнее использовать преимущества, связанные с совокупной сигнала.
7. В заранее определенный момент времени (см шаг 3,6, чтобы помочь определить сроки)прочитать флуоресценции рыбы заполненные пластины снова с теми же настройками, как на стадии 3.5.

4. Оценка относительного изменения флуоресценции, связанные с лечением

1. Рассчитать изменение в флуоресценции каждой лунки вычитанием флуоресценции в момент времени 0 с флуоресценцией при заключении исследования. Уэллс без рыбы (заготовок), должны иметь значения около 0, что намного ниже значений из скважин, которые содержат рыбу.
   Изменение флуоресценции = флуоресценции при заключении - флуоресценции в момент времени 0
2. Чтобы установить относительное изменение флуоресценции, вычислить среднее изменение флуоресценции для контрольные лунки затем разделить на изменение флуоресценции каждой лунки с помощью среднего изменения флуоресценции контрольных лунках. Следует отметить, что элементы управления могут быть как элементы управления транспортных средств или генетические элементы управления.
   

Анализ решение не увеличивать флуоресценцию в отсутствие эмбрионального рыбы (рисунок 1). Тем не менее, анализ является очень чувствительным к малейшим изменениям в скорости обмена веществ в скважину. Один рыбы в лунку создает сигнал значительно отличается от пустых скважин в течение 1 ч (Р <0,0001). Рисунок 2 дает наглядное представление сигналов, генерируемых эмбрионального рыбы после 24 часов инкубации. Для этой картины были использованы прозрачные двусторонние скважин. Тем не менее, черные односторонние скважины являются предпочтительными для проведения анализа для предотвращения выщелачивание флуоресцентного сигнала от соседних скважинах.

Поскольку НАДН 2 индуцируется сокращение AlamarBlue не является обратимым, сигнал накапливается со временем. Это позволяет небольшие изменения должны быть усилены. Чтобы показать, что различия накапливаются и таким образом возрастать со временем, мы наблюдали за относительное изменение флуоресценции, индуцированного 1 до 5 рыб на 1, 2 и 4 ч (Рисунок 3). В каждом номере рыбы / а относительное изменение флуоресценции значительно увеличилось с течением времени (P <0,001). Что еще более важно, потому что сигнал накапливается со временем, величина разницы в изменении флюоресценции, что в результате манипулирования количество рыбы / лунку более устойчив при температуре 4 часа, чем в 1 ч инкубации. Таким образом, за счет увеличения продолжительности воздействия, мы можем повысить способность обнаруживать различия, связанные с данной лечения.

Рисунок 1. Сравнение шум в сигнал. Обнаруживаемое изменение флуоресценции генерируется 1 данио в 96-луночный планшет при 1 ч. Уэллс, которые не содержат рыбы (заготовок) генерируют сигнал. Мало Усы представляют SEM (п = 5 - 8). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версиюэта фигура.

Рисунок 2. Визуальное представление аналитического планшета на 24 часов. Представитель картина результатов, полученных с помощью этого теста. Розовые скважин свидетельствуют рыбы с высокой метаболической скоростью, фиолетовые скважин умеренной скорости обмена веществ, и синие скважин с низким скорость метаболизма. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Различия Рисунок 3. Сигнал Amplify со временем. Разница в флуоресцентного сигнала, генерируемого изменением количества рыбы / лунку увеличивается со временем. Потому что сигнал накапливается со временем, величина изменения флуоресценции расходится с betweensamples время тшляпа отличаются скоростью генерации сигнала. Столбики ошибок обозначают SEM (N = 7).

Авторы не имеют конкурирующих финансовых интересов, которые можно было бы раскрыть.