Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Боковые перегородки ядерно и Стриатум конкретных

27.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/53303

⸱

18 января 2016 г.

 , 
1TARC (Translational Animal Research Center), University Medical Center, JGU Mainz

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол подробно описывает, как конкретно трансфицировать различные области центральной нервной системы C57BL/6 с помощью внутриутробной электропорации. В этот протокол включены подробные инструкции по трансфекции областей, которые развиваются в кору, гиппокамп, таламус, гипоталамус, латеральное септальное ядро и стриатум.

Аннотация

Внутриутробная электропорация - это широко используемый метод для быстрых и эффективных пространственно-временных манипуляций с различными генами в центральной нервной системе грызунов. Сверхэкспрессия желаемых генов так же возможна, как и исследования потери функции, опосредованные shRNA. Поэтому он предлагает широкий спектр применения. Возможность нацеливания на определенные клетки в определенной области еще больше расширяет спектр потенциальных применений этого очень полезного метода. Для эффективного воздействия на конкретные регионы необходимо знать такие тонкости, как эмбриональная стадия, напряжение и, самое главное, положение электродов.

Здесь мы предоставляем подробный протокол, который позволяет проводить специфическую и эффективную внутриутробную электропорацию нескольких областей центральной нервной системы мыши C57BL/6. В частности, показано, как трансфицировать области, которые развиваются в ретроспленальную кору, моторную кору, соматосенсорную кору, грушевидную кору, рог аммония 1-3, зубчатую извилину, стриатум, латеральное септальное ядро, таламус и гипоталамус. Для получения этой информации о соответствующей эмбриональной стадии предоставляется соответствующее напряжение для соответствующей эмбриональной стадии. Самое главное, что на ней изображена карта угла, которая указывает на соответствующее положение положительного полюса. Этот стандартизированный протокол помогает обеспечить эффективную внутриутробную электропорацию, которая также может привести к сокращению количества животных.

Введение

С первого описания в 2001 году тремя независимыми группами 1-3 я н маточно электропорации стала широко используется стандартный инструмент для анализа экспрессии генов в грызунов центральной нервной системы. По сравнению с поколением мышей с, что, несмотря на постоянно улучшающих методов, до сих пор времени и денег отнимает, то в утробе электропорации призывы из-за своей простоты. Так, в период внутриутробного развития электропорации позволяет быстро и эффективно амплитудно и с потерей функции исследования 4.

Для трансфекции церебральных областей, раствор, содержащий отрицательно заряженный плазмиду вводят в желудочек. Во электрического импульса, отрицательно заряженный ДНК мигрирует к положительному полюсу и, следовательно, трансфицировали область может быть выбрана просто изменения положения к положительному полюсу. Это часто было показано, что многочисленные участки центральной нервной системы может быть таrgeted 3,5-8. Например, недавние исследования показывают, конкретные трансфекций гиппокампа, в грушевидной коре или стриатуме 9-11. Тем не менее, информация о соответствующих положениях, часто только едва стандартизированы и не всегда легко передать различных штаммов мыши.

Трансфекция некоторых эмбриональных стадиях далеко не тривиальна. Многие влияющие факторы должны быть приняты во внимание при выборе настройки для конкретных внутриутробно электропорации. Во-первых, оптимально трансфекции соответствующих эмбриональной стадии, знание о соответствующих напряжений необходим. Высокое напряжение уменьшить выживаемость, в то время как низкие напряжения уменьшают 2,3,12 эффективности трансфекции. Также размер электрода веслом играет решающую роль, так как использование электродов весла, которые слишком большие приводит к снижению специфичности или может повлечь за собой смерть из-за поражения сердечного ритма 4,12,13. Применяемаянапряжение и размер и положение электрода весла являются наиболее важные особенности, которые следует учитывать, но есть также дополнительные факторы, влияющие на исход электропорации, как прикладной количества ДНК-раствора.

Мы разработали подробный протокол, который позволяет быстро и эффективно трансфекции различных церебральных областей C57BL / 6 мыши 12. В этом протоколе подробная информация о напряжениях, которые будут использоваться и размер электрода лопастью для повышения специфичности обеспечивается. Кроме того, информация о желудочке быть заполнены а также рекомендации по количеству раствора плазмиды, и положением электрода подается. Индикация подробной информации позиции в карте и дальнейшего визуализации этих позиций позволяет простой и эффективный специфический внутриутробно электропорации ретроспленальной коры, в моторной коре, соматосенсорной коре, в грушевидной коре, тон Корню ammonis 1-3, зубчатой ​​извилине, полосатое тело, боковая перегородки ядро, таламус и гипоталамус.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

О себе этика: обработка мышей и экспериментальных процедур были проведены в соответствии с европейскими, национальными и институциональными руководящих принципов для ухода за животными.

1. В Utero Электропорация

Примечание: В маточно электропорации проводили ранее опубликованные 12,14. Таким образом, метод только кратко описаны в следующем (рис 1).

  1. Препараты
    1. Подготовка Быстрая зеленого цвета эндотоксина передовые трансфекции класса раствора плазмиды (содержащий 1,5 pCAGGS), как описано ранее 12.
    2. Потяните и растереть (35 ° угол) боросиликатного стекла капилляров (0,8-0,9 диаметра) для инъекций.
    3. Стерилизовать инструментов.
  2. Хирургия
    1. Администрирование анальгетики (Carprofen, 4 мг / кг массы тела, подкожно, 24 ч) депо, по крайней мере за 30 мин до начала операции.
    2. Держите длинуанестезии максимум 35-45 мин (III стадия - этап хирургической анестезии в соответствии с Guedel 15 - максимальная 25-30 мин).
    3. Обезболить приуроченные беременных мышей с изофлуран (индукции в камере: 2,8%, операции через маску: 2,5%). Подтвердите анестезия невосприимчивости к схождения крайнем случае.
    4. Применить глазную мазь, чтобы предотвратить сухость глаз-во время анестезии.
    5. Стерилизовать хирургическое площадь с 7,5% раствором йода-провидон и охватывают мышь с стерильную марлю (влажной 0,9% бензилового спирта солевого раствора) с только хирургическим области подвергается.
    6. Разрежьте брюшной полости с скальпель (разрез кожи: 1,5-2 см, мышцы разреза: 1-1,5 см).
    7. Заповедник открытую брюшную полость от высыхания путем увлажнения с подогреваемой 0,9% раствора бензилового спирта или другого солевого стерильного изотонического раствора по указанию ветеринарного персонала или комитета.
    8. Осторожно извлечь рога матки (с помощью кольцевых пинцетом, не прикасайтесь матку с пальцемс).
  3. Введение ДНК и электропорацию. Примечание: Точные детали, нацеленные на конкретные регионы указаны в разделе 2.
    1. Медленно вводят окрашенного раствора ДНК в желудочке, как показано на рисунке 1 и 2 секции с помощью подготовленных боросиликатного капилляров.
    2. Нанесите соответствующее напряжение для соответствующего эмбриональной стадии (например,., 36-38 В для E14) с помощью специализированных платиновыми электродами щипцов типа (интервал цикла длина 50 мс, интервал паузы 950 мс). Импульсный электропорации лопасти во время приложения напряжения к минимуму повреждение стенки матки.
  4. Сообщение электропорации / послеоперационный уход
    1. Тщательно заменить рога матки в брюшной полости.
    2. Шовный мышцы и разрез кожи отдельно.
    3. Пусть остальные мыши на тепловой опорного устройства для восстановления.
    4. Контроль мыши при восстановлении (поведение, корма иРасход воды), 4 ч, 24 ч и 48 ч после операции. При необходимости применять дополнительные анальгетики (Carprofen, 4 мг / кг массы тела, 24 ч депо) для дальнейшей 2 дней.

2. Трансфекция конкретных мозговых зон

Примечание: Положение положительному полюсу показан как угол между вертикальной осевой через желудочка, наполненного раствора ДНК (правая или третьего желудочка) и положением к положительному полюсу. При заполнении в левый желудочек в позиции зеркально. На рисунке 4 позиции уха показаны Изначального, которые обеспечивают важные ориентиры.

  1. Трансфекция областей коры (2А, Таблица 1).
    1. Выполните операцию, как описано в разделе 1.2. Для электропорации внутриутробно корковых областей использования эмбрионов E14.
    2. Вводят 1,5-2 мкл ДНК-раствора, содержащего 4 мкг ДНК в правый латеральный желудочекс помощью подготовленных боросиликатного капилляров.
      1. Осторожно установите эмбриона с помощью кольцевых щипцы, так что нет никаких видимых сосудов выше места прокола.
      2. Медленно введите ДНК-решение примерно 0,75 мм корональной от lambdoidal шва и 0,5 мм латерально от сагиттального шва (рис 3). Убедитесь, что глубина погружения составляет 1,2 мм (E14, измеряется от стенки матки). Проверьте сине-зеленая окраска с резким демаркации.
    3. Подайте напряжение через специализированных платиновыми электродами щипцов типа (интервал цикла длина 50 мс, интервал паузы 950 мс).
      1. Используйте 3 или 5 мм электрода весло.
      2. Используйте напряжение от 36-38 В.
      3. Разместите центр электродов только передних уха зачатков.
      4. Для трансфекции ретроспленальной углы использование мозга от 330-0 ° для трансфекции моторной коры 0-40 ° к трансфекции соматосенсорной коре 40-95 ° к трансфекциигрушевидной коры 95-110 ° (2А).
    4. Действия после электропорации / послеоперационный уход, как описано в разделе 1.4. Жертвоприношение мышей и анализировать эмбрионов через 4 дня после электропорации (E18), как описано в разделе 3.
  2. Трансфекция гиппокампе (Фигура 2В, таблица 1).
    1. Выполните операцию, как описано в разделе 1.2. Для внутриутробно электропорации гиппокампа использовать эмбрионы E15.
    2. Вводят 2 мкл ДНК-раствора, содержащего 4 мкг ДНК в правый латеральный желудочек с помощью подготовленных боросиликатного капилляров.
    3. Подайте напряжение через специализированных платиновыми электродами щипцов типа (интервал цикла длина 50 мс, интервал паузы 950 мс).
      1. Используйте 3 или 5 мм электрода весло.
      2. Используйте напряжение от 38-40.
      3. Разместите центр с отрицательным полюсом только передней уха зачатка и центра Ое положительному полюсу на середине уха зачатка.
      4. Для трансфекции зубчатой ​​извилине использовать углы от 190-210 °, трансфекции Корню ammonis (CA) 3 210-230 ° для трансфекции CA2 230-250 ° для трансфекции СА1 250-275 ° (рис 2B).
    4. Действия после электропорации / послеоперационный уход, как описано в разделе 1.4. Выполнить анализ после полной гиппокампа (после рождения, р21), как описано в разделе 3.
  3. Трансфекция боковой перегородки ядра полосатого тела (и фиг.2С, Таблица 1)
    Примечание: Углы перекрываются с таковыми для трансфекции гиппокампа. Для эффективного трансфекции боковой перегородки ядро ​​и полосатое тело без нежелательных гиппокамп трансфекции ранее эмбриональных стадиях (E12) должны быть использованы.
    1. Выполните операцию, как описано в разделе 1.2. Для электропорации внутриутробно боковой перегородки ядра и striatгм использовать эмбрионы E12.
    2. Вводят 1 мкл ДНК-раствора, содержащего 4 мкг ДНК в правый латеральный желудочек с помощью подготовленных боросиликатного капилляров.
    3. Подайте напряжение через специализированных платиновыми электродами щипцов типа (интервал цикла длина 50 мс, интервал паузы 950 мс).
      1. Использование 0,5 мм электрод.
      2. Используйте 33 В.
      3. Разместите центр электродов на уровне уха зачатков.
      4. Для трансфекции боковые углы использование перегородки ядро от 100-170 ° для трансфекции стриатуме 170-240 ° (рис 2С).
    4. Действия после электропорации / послеоперационный уход, как описано в разделе 1.4. Жертвоприношение мышей и анализировать эмбрионов через 6 дней после электропорации (E18), как описано в разделе 3.
  4. Трансфекция таламуса и гипоталамуса (рис 2D, Таблица 1)
    1. Выполните операцию, как описано в разделе 1.2. Для в иТеро электропорации таламуса и гипоталамуса использования E12 E13-эмбрионов.
    2. Вводите 1-1,5 мкл ДНК-раствора, содержащего 4 мкг ДНК в боковой желудочек (левой или правой) через подготовленных боросиликатного капилляров. Подождите в течение 2-3 мин, пока раствор не диффундирует в третий желудочек. В качестве альтернативы непосредственно вводить в третий желудочек.
      Примечание: Это повышает специфичность, но может привести к снижение выживаемости (высокий риск повреждения).
    3. Подайте напряжение через специализированных платиновыми электродами щипцов типа (интервал цикла длина 50 мс, интервал паузы 950 мс).
      1. Используйте 0,5 или 3 мм электрод.
      2. Используйте напряжение от 33-35 В.
      3. Разместите центр электродов только позади уха зачатки.
      4. Для трансфекции углы использование таламус от 25-40 ° к трансфекции гипоталамус 90-180 ° (рис 2D).
    4. Действия после электропорации / послеоперационный уход, как десываются в разделе 1.4. Жертвоприношение мышей и анализировать эмбрионов через 6 дней после электропорации (E18), как описано в разделе 3.

3. Фиксация перфузии

  1. Препараты
    1. Теплый 4% параформальдегида (PFA) до 37 ° С.
    2. Заполните 50 мл шприц с PBS (4 ° С) и второй шприц с подогретой PFA. Избегайте пузырей.
    3. Подключите шприцы с трехходовым краном. Подключите третий конец крылатого вливания (бабочка).
    4. Промойте крылатый инфузионный набор с PBS.
  2. Перфузия
    1. Глубоко анестезию мыши (беременной или послеродовой трансфицировали) с подкожным применением кетамина гидрохлорида (60 мг / кг) и ксилазина (7,5 мг / кг).
    2. Подтвердите хирургического этапа допуска по останову до пят-пинча.
    3. Откройте брюшной полости как раз под грудной клеткой.
    4. Аккуратно вырежьте диафрагму.
    5. Осторожно откройте грудную клетку с помощью разреза на еACH-сайт до ключицы.
    6. Вставьте кончик бабочки в левой камеры сердца (начиная с верхушки сердца).
    7. Вырезать ушка левого предсердия.
    8. Медленно заливать мышь с PBS (примерно 10 мл).
    9. Переключатель трехпозиционный кран.
    10. Заливать мышь с 5-10 мл 4% PFA.
    11. Обезглавьте мыши с помощью ножниц и анализировать мозг, начиная с большого затылочного отверстия. Выполните рассечение, опубликованной ранее 16.
    12. Postfixate мозг в течение 2 дней в 4% PFA. Держите голову на 4 ° С в темноте.

4. Иммуногистохимия

  1. Создание 70 мкм разделы (например, с vibratome).
  2. Дополнительно: Повышение флуоресценции с окрашиванием антител.
    1. Блок секции в течение 1 часа при комнатной температуре (0,1-0,2% Тритон Х-100, 5% нормальной козьей сыворотки)
    2. Инкубируйте O / N с соответствующим антителом (анти-GFP, 1: 1,000)
    3. Вымойте 3-5 Раз с 0,1 М фосфатным буфером.
    4. Инкубируют 3-5 ч с соответствующим флуоресценции, конъюгированных вторичных антител (Alexa Fluor 488 конъюгированный анти-кроличий IgG-1: 1000).
    5. Дополнительно: контрастное с 4-6-diaminodino-2-фенилиндола (DAPI, 0,2 г / мл в 0,1 М фосфатном буфере) в течение 1 мин.
    6. Анализ флуоресценции с соответствующим флуоресцентным микроскопом.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Рисунок 2 показывает, примеры для конкретных внутриутробно электропорации регионах развивающихся в ретроспленальной корой, моторной коры, соматосенсорной коры, то грушевидной коры, то Корню ammonis 1-3, зубчатой ​​извилине, полосатое тело, боковая перегородки ядро , таламус и гипоталамус. Результаты трансфекции показаны рядом с рекомендуемой углом (Рис.2). Для лучшей визуализации углов в естественных условиях положение электрода (0,5 мм), также показаны на рис<...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этом протоколе подробно описывается, как трансфицировать ретроспленальную кору, моторную кору, соматосенсорную кору, грушевидную кору, рог аммония 1-3, зубчатую извилину, стриатум, латеральное септальное ядро, таламус и гипоталамус мышей C75BL/6. Учитывая всю предоставленную информацию, это первый протокол, который предоставляет всю необходимую информацию для легкого воссоздания трансфекции этих областей головного мозга у мыши C57BL/6. Предыдущие публикации в основном были сосредоточены только на нескольких конкретных ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Техническая поддержка Мелани Пфайфер и Николая Шмаровского (Институт микроскопической анатомии и нейробиологии, Университетская медицинская клиника Майнца).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
EndoFree Plasmid Maxi KitQIAGEN12362
Fast GreenRoth0301.1
pCAGGSAddgene
капилляры из боросиликатного стекла (диаметр 0,8-0,9 мм)от Precision Instrument Inc.1B100F-4
Изофлуран (Форен)AbbottPZN 4831850
Карпрофен (Римадил)Pfizer GmbHномер одобрения: 400684.00.00
глазная мазь (Bepanthen Augen und Nasensalbe)Bayer PZN 01578681
0,9% бензиловый спирт 0,9% физиологический растворPharmacy
Университетского медицинского центра Майнца
марля (ES-Kompressen)Hartmann407835
стерильный 5-0 Perma-Hand Silk Шовный материалEthicon Johnson & JohnsonK890H
кольцевые щипцы 1/ 1,5 ммFine Science Tools11101-09
кольцевые щипцы 4,8/ 6 ммFine Science Tools11106-09
кольцевые щипцы 2,2/ 3 ммFine Science Tools11103-09
Adson щипцы с зазубринами прямые 12 смFine Science Tools1106-12
IrisScissors-Delicate Straight-Sharp/ Тупые 10 смИнструменты для тонкой науки14028-10
Ножницы Майо-Стилл-Прямые 15 смИнструменты для тонкой науки14012-15
Дюмон #5 Щипцы-нержавеющиеинструменты для тонкой науки11251-20
Иглодержатель Кастровьехо-с замком-карбид вольфрама 14 смИнструменты для тонкой науки12565-14
Электропоратор CUY21 SC Непа Джин Ко.
FST 250 Стерилизатор горячих шариковFine Science Tools18000-45
Микрошлифовальный станок EG-44Narishige
P-97 Micropette PullerSutter Instrument CompanyP-97
Платиновые электроды 650P 0,5 ммNepageneCUY650P0,5
Платиновые электроды 650P 3 ммNepageneCUY650P3
Платиновые электроды 650P 5 ммNepageneCUY650P5
Платиновые электроды 650P 10 ммNepageneCUY650P10
Система анестезииRothacher-Medical GmbHCV-30511-3 Пар 19,3
Нагревательная пластинаRothacher-Medical GmbHHP-1M
Регулятор температуры 220 В переменного токаRothacher-Medical GmbHTCAT-2LV

Ссылки

  1. Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294 (5544), 1071-1074 (2001).
  2. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).
  3. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
  4. LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 19 Suppl 1. (July), i120-i125 (1991).
  5. Nakahira, E., Yuasa, S. Neuronal generation, migration, and differentiation in the mouse hippocampal primoridium as revealed by enhanced green fluorescent protein gene transfer by means of in utero electroporation. J Comp Neurol. 483 (3), 329-340 (2005).
  6. Navarro-Quiroga, I., Chittajallu, R., Gallo, V., Haydar, T. F. Long-term, selective gene expression in developing and adult hippocampal pyramidal neurons using focal in utero electroporation. J Neurosci. 27 (19), 5007-5011 (2007).
  7. Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation. J Neurosci Methods. 143 (2), 151-158 (2005).
  8. Kolk, S. M., de Mooij-Malsen, A. J., Martens, G. J. M. Spatiotemporal Molecular Approach of in utero Electroporation to Functionally Decipher Endophenotypes in Neurodevelopmental Disorders. FNMOL. 4 (November), 37(2011).
  9. Tomita, K., Kubo, K. I., Ishii, K., Nakajima, K. Disrupted-in-schizophrenia-1 (Disc1) is necessary for migration of the pyramidal neurons during mouse hippocampal development. Hu Mol Gen. 20 (14), 2834-2845 (2011).
  10. Niwa, M., Kamiya, A., et al. Knockdown of DISC1 by In Utero Gene Transfer Disturbs Postnatal Dopaminergic Maturation in the Frontal Cortex and Leads to Adult Behavioral Deficits. Neuron. 65 (4), 480-489 (2010).
  11. Nakahira, E., Kagawa, T., Shimizu, T., Goulding, M. D., Ikenaka, K. Direct evidence that ventral forebrain cells migrate to the cortex and contribute to the generation of cortical myelinating oligodendrocytes. Dev Biol. 291 (1), 123-131 (2006).
  12. Baumgart, J., Grebe, N. C57BL/6-specific conditions for efficient in utero electroporation of the central nervous system. J Neurosci Methods. 240, 116-124 (2015).
  13. Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat Protc. 1 (3), 1552-1558 (2006).
  14. Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. JoVE. (54), (2011).
  15. Guedel, A. E. Inhalation anesthesia: a fundamental guide. , Macmillan. New York. (1937).
  16. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. JoVE. (65), e3564(2012).
  17. Mizutani, K., Saito, T. Progenitors resume generating neurons after temporary inhibition of neurogenesis by Notch activation in the mammalian cerebral cortex. Development. 132 (6), 1295-1304 (2005).
  18. Tabata, H., Nakajima, K. Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation. Dev, Growth & Differ. 50 (6), 507-511 (2008).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Боковые перегородки ядерно и Стриатум конкретных
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.