Валидация модели мышей, чтобы сорвать ЛИНК Комплексы в манере соты

Summary

Белки ядерной оболочки играют центральную роль во многих основных биологических процессах и участвуют в различных заболеваниях человека. Этот протокол описывает новую мышиную модель на основе Cre/Lox, которая позволяет осуществлять пространственно-временной контроль разрушения комплексов LINC.

Abstract

Ядерная миграция и закрепление в развивающихся и взрослых тканях в значительной степени зависят от больших макромолекулярных белковых сборок, называемых LInkers of the Nucleoskeleton and Cytoskeleton (LINC complexes). Эти белковые каркасы охватывают ядерную оболочку и соединяют внутреннюю часть ядра с компонентами окружающего цитоплазматического цитоскелета. Комплексы LINC состоят из двух эволюционно консервативных белковых семейств, белков Sun и Nesprins, которые содержат С-концевые молекулярные сигнатурные мотивы, называемые доменами SUN и KASH соответственно. Белки Sun — это трансмембранные белки внутренней ядерной мембраны, N-концевой нуклеоплазматический домен которых взаимодействует с ядерной пластинкой, в то время как их С-концевые домены SUN выступают в перинуклеарное пространство и взаимодействуют с доменом KASH Nesprins. Канонические изоформы Nesprin имеют N-конец переменного размера, который проецируется в цитоплазму и взаимодействует с компонентами цитоскелета. Этот протокол описывает валидацию стратегии доминантно-негативных трансгенных мышей, которая нарушает эндогенные взаимодействия SUN/KASH специфичным для типа клеток образом. Наш подход основан на системе Cre/Lox, которая обходит многие недостатки, такие как перинатальная летальность и неавтономные фенотипы клеток, которые связаны с моделями зародышевой линии инактивации комплекса LINC. По этой причине данная модель является полезным инструментом для понимания роли комплексов LINC во время развития и гомеостаза в широком спектре тканей.

Introduction

Ядерная оболочка (СВ) отделяет нуклеоплазму из цитоплазмы. Она состоит из внутреннего и внешнего ядерной мембраны (ИВМ и ONM, соответственно), которые подключаются на ядерные поры. Просвет очерчены обе мембраны называют перинуклеарном пространстве (ПНС). ONM является продолжением шероховатой эндоплазматической сети (ER), и ИВМ придерживается ядерной пластинки, сетчатая промежуточных филаментов ядерной типа V представлена ​​А- и В-типа Ламины ^1,2. Линкеры в нуклеоскелета и цитоскелета (ЛИНК) комплексов макромолекул сборки, которые охватывают весь ядерный конверт физически подключить интерьер ядра в цитоскелета нитей и молекулярных моторов (Рис. 1А) Они состоят из взаимодействий между эволюционно консервативных мотивов, которые характеризуют два семейства интегральных трансмембранных белков NE: Солнце (SAD1 / Unc84) белки и Nesprins (ядерная оболочка SPectRINS). У млекопитающих, sun1 и Sun2 сотоке трансмембранных белков НИМ которого N-терминал нуклеоплазме область взаимодействует непосредственно с А- и В-типа ламинов ^3-5. С другой стороны, в INM ПНС, Sun белки питают эволюционный-сохраняется участок ~ 150 С-концевых аминокислот называется областью вс SUN домены непосредственно взаимодействуют с эволюционно-консервативными каш (Klarsicht / ANC-1, старое время гомология) домена, молекулярная подпись Nesprins. Кэш домены состоят из участка ~ 30 C-концевых аминокислот, который выступает в ПНС последующим трансмембранного домена ^6. По крайней мере, четыре различных генов Nesprin (Nesprin1-4) кодирования KASH содержащие белки, которые локализуются на северо-востоке ^7. Цитоплазматические регионы Nesprins, чьи размеры варьируются от ~ 50kDa (Nesprin4) к удивительным 1000 кДа (Nesprin1 гигантского), содержат несколько спектрин повторяет, а также конкретные мотивы позволяет их взаимодействие с цитоскелета компонентов, таких как актин, плектина и молекулярных моторов ^{8- 13.}

<р = класс "jove_content"> Исследования в позвоночных и беспозвоночных животных показали, что Ламин / ВС / Nesprin / молекулярные моторы представляют собой эволюционно консервативный "ось" контрольный ядерной миграции и крепление. Несколько нокаут (КО) мышиных моделях ЛИНК сложных компонентов были описаны и сыграли важную роль в обеспечении рамок для понимания роли Солнца и Nesprin белков на северо-востоке в ходе развития млекопитающих ^9,14,15. Тем не менее, эти модели представляют несколько существенных недостатков, в первую очередь: 1) сложности в интерпретации фенотипы в связи с клеточной неавтономных эффектов, 2) трудности в различении фенотипическую вклад каш, содержащих против KASH-менее Nesprin изоформы ^16, 3) функциональная избыточность Sun и Nesprin белков в NE в многочисленных типов клеток требует сложных схем разведения, чтобы инактивировать все взаимодействия ВС-Каш у мышей ¹⁷ и 4) перинатальный летальность мышей с дефицитом в KASH-области иNesprins1 и 2 исключает анализ взрослого фенотипы ^18.

Этот протокол описан новый модель мыши, предназначенный для разрушения всех взаимодействий ВС-каш в живом организме, в клетке автономным и развитием регулируемым образом, минуя многие из недостатков, описанных выше. Это / LOX-ориентированная модель мыши Cre опирается на два важных концепций: 1) домен KASH любого известного белка Nesprin достаточно целевой EGFP в NE в системах клеточных культур и 2) SUN домены взаимодействуют разбора с KASH доменов, таким образом, избыточная экспрессия любой домен KASH будет насыщать все эндогенные SUN домены и инактивировать ЛИНК комплексы доминантно-негативной манере ¹⁷ (рис 1B). Этот протокол описывает сбор тканей и этапы обработки, используемые для подтверждения нарушения всех взаимодействий ВС-KASH в мозжечка клеток Пуркинье.

Protocol

О себе этика: Процедуры с участием животных предметы были одобрены уходу и использованию комитета Институциональные животных (IACUC) Вашингтонского университета в Сент-Луисе с.

1. Мышь Разведение и генотипирование

1. Порода Tg (КАГ-LacZ / EGFP-KASH2) мышей с Tg (PCP2-CRE) мышей, чтобы произвести Tg ^(PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) ^19,20. Примечание: В то время как остальная часть этого протокола ориентирована на использование линии Tg (PCP2-Cre) мыши, чтобы ограничить EGFP-KASH2 выражение клеток Пуркинье в мозжечке, аналогичная процедура может следовать любой другой Tg (CRE) мыши ( 2А).
2. Выполните генотипирование для выявления щенков укрывательство как EGFP и CRE трансгены, как описано ранее ^19.

2. Подготовка материалов для вскрытия и тканей Коллекция

1. Приготовьте 100 мл 30% сахарозы в PBS (30 г сахарозы / 100 мл 1x PBS) и хранят при -20 ° С. День ткани чarvesting, оттепель и нагрузки ~ 30-35 мл раствора сахарозы в 35 мл шприц для transcardial перфузии.
2. Подготовка 40 мл 4% PFA в PBS (10 мл 16% параформальдегида и 30 мл PBS). Нагрузка ~ 30-35 мл 4% PFA в 35 мл шприц для transcardial перфузии.
3. Заполните 10 см планшет для тканевых культур с 10 мл PBS для рассечения тканей.
4. Приготовьте кетамин / ксилазин коктейль, состоящий из 16 мг / мл кетамина и 3 мг / мл ксилазина.
5. Готовят раствор 70% -ным этанолом для рассечения.

3. Вскрытие и тканей Коллекция

1. Используя 1 мл шприц, вводят 500 мкл кетамин / ксилазина коктейль на 25 г веса тела и ждать ~ 15 мин. В качестве альтернативы, используйте другой метод институционально утвержденный седации, который подходит для биологической системы интересов.
2. По седации, мягко ущипнуть заднюю лапу на, чтобы подтвердить отсутствие болевой реакции, контактный все лапы на пенопластовый лоток спинной сторонемышь вниз.
3. Спрей живота с 70% этанола и сделать надрез от нижней части живота до верхней части грудной клетки, чтобы получить доступ к сердцу.
4. Сделать небольшой надрез в правое предсердие сердца, и вставить в шприц, содержащий 30% раствор сахарозы в левый желудочек сердца.
5. Заливать раствор в размере ~ 2-5 мл в мин. Когда пуст, снимите шприц и повторите с 4% раствором PFA.
6. Открепить мышь от пенополистирола лоток и обезглавить, чтобы получить доступ мозг.
7. Снимите кожу вокруг головы животного, используя щипцы и ножницы. Совать отверстие в задней части черепа с иглой и осторожно удалите череп ножницами и щипцами рассекающих.
8. После того, как мозг явно доступны, используйте щипцы для удаления мозжечка и поместить его в PBS. Пополам мозжечка в сагиттальной плоскости со скальпелем и передать 30% раствора сахарозы в течение ночи при 4 ° С. Примечание: Для того, чтобы подготовительныеявляются парафиновые срезы, исправить мозжечок в течение ночи при 4 ° С в 4% PFA до тканей вложения и секционирования.

4. Обработка и тканей Секционирование

1. Приготовьте суспензию сухого льда и 2-метил бутана. Дайте температура ванны для уравновешивания в течение 5 мин.
2. Заполните cryomold с ОКТ соединения и поместите одну половину пополам мозжечка в форму.
3. Использование рассекает микроскоп и пинцет положении мозжечок, так что поверхность пополам (около средней линии мозжечка) вверх.
4. Передача cryomold к сухим льдом суспензии в течение 5 мин, пока ОКТ соединение не образуется твердый белый матрицу вокруг образца ткани. Примечание: Замороженные пробы теперь можно хранить при -20 ° С в случае необходимости.
5. Этикетка предварительно обработанных поли-лизин слайды для сбора срезов тканей и подготовить криостат в соответствии с инструкциями изготовителя для того, чтобы собрать 15 мкм разделы Сербеллум. Для сбора разделы, тщательно нами раздел OCT стороной с покрытием поли-лизин слайда. Чтобы сохранить ориентацию разделе, не повернуть слайд во время этого шага.
6. Магазин тканей секции при -20 ° C до приступить окрашивания и визуализации.

5. Окрашивание и визуализации мозжечка разделах

1. Подготовьте следующие решения до окрашивания ткани:
   ~ 50 мл PBS
   ~ 5-10 мл 4% PFA в PBS
   ~ 10-20 мл 0,5% Тритон Х-100, 10% сыворотки осла в PBS
2. Оттепель мозжечка разделов. Важно отметить, что свести к минимуму их воздействие на любого источника постоянного и интенсивного света, чтобы предотвратить выцветание EGFP.
3. Использование гидрофобный барьер перо, нарисуйте прямоугольник вокруг участков ткани.
4. После исправить разделы с 4% PFA в течение 5 мин. Использование достаточное количество жидкости, чтобы покрыть всю область, очерченной гидрофобного барьера (обычно ~ 500 мкл). Использование вакуума или пипетку, вновьпереместить фиксатор будучи особенно осторожны, чтобы не нарушить срезах тканей.
5. С помощью пипетки, осторожно применять PBS на слайде, не нарушая срезах тканей. Через 5 мин использовать вакуум или пипетку тщательно удалить жидкость. Повторите PBS промыть в общей сложности три раза.
6. С помощью пипетки, тщательно применять соответствующего разбавления первичных антител (3 мкл кальбиндин и / или Nesprin2 антитела на 900 мкл раствора) в 0,5% Triton X-100, 10% осла сыворотки в PBS. Инкубируют в течение одного часа при комнатной температуре в темноте.
   Примечание: EGFP-KASH2 будут видны при непосредственном флуоресцентной микроскопии на замороженных срезах, и нет необходимости использовать антитела анти-EGFP. Однако, если парафиновые срезы были подготовлены, визуализация EGFP-KASH2 требует иммунологического с антителом анти-EGFP.
7. Удалить решение антител и промыть PBS три раза.
8. Приготовьте 1: 1000 разведения Alexa Fluor-вторичными антителами в 0,5% Triton X-100,10% сыворотки осла в PBS и хранить в темноте.
9. Осторожно удалить окончательный PBS промыть и применить разбавление вторичных антител в течение одного часа в темноте.
10. Удалить решение вторичное антитело, промойте и мыть разделе три раза. При необходимости применяются окрашивающим ядра, например, DAPI (~ 300 нм), в течение первого применения PBS.
11. Полностью удалить решение PBS по всему ткани и место ~ 5-7 мкл монтажа СМИ на участке ткани. Поставьте стакан покровное на вершине разделе ткани и отложите в течение ~ 15-30 минут при комнатной температуре в темноте.
12. Используйте флуоресцентный микроскоп оснащен соответствующими фильтрами для визуализации EGFP и любые другие длины волн, подходящие для вторичных антител, используемых в шагах 5.8 / 5.9. В мозжечка ломтиками, использовать цель 20X, чтобы посмотреть EGFP-KASH2 ядерных диски.

Results

Этот протокол иллюстрирует полезность (/ EGFP-KASH2 CAG-LacZ) модели мыши ТГ ограничить EGFP-KASH2 выражение мозжечка клеток Пуркинье с использованием ТГ (PCP2-CRE) мышей. В Tg ^(PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) потомство, то LacZ / V5 открытая рамка считывания вырезали в P6 на рекомбиназой Cre что приводит к экспрессии EGFP-KASH2, предназначенных специально для клеток Пуркинье (рис 2А). Как и ожидалось, EGFP-KASH2 предназначен для ядерной оболочки, как указано EGFP-положительных обода, как наблюдаем...

Discussion

Наиболее важным шагом для успешного изучения роли ЛИНК комплексов в естественных условиях, используя (/ EGFP-KASH2 CAG-LacZ) модель ТГ является определение подходящего мыши линии (ы) CRE. В самом деле, если Cre активен в других типов клеток, участвующих в подобных путей, это может усложнить интерпретацию результатов. Следовательно, важно, чтобы исследовать соседние клетки, как показано здесь в слоях молекулярных и клеточных гранул мозжечка (Фигура 2В). Кроме того, чтобы максимизировать любые фи...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Сахароза	Сигма Олдрич	S0389
10x PBS	Gibco	14200-075
16% раствор параформальдегида	Электронная микроскопия науки	15710
ОКТ соединение	ткани-тек	4583
адгезионные слайды	StatLab	M1000W Сыворотка
осла	Сигма Олдрич	D9663
Triton X-100	Sigma Aldrich	T9284
ImmuEdge Pen	Vector Laboratories	H-4000
Антитело против кальбиндина	Sigma Aldrich	C9848
Антитело против EGFP	Abcam	ab13970
Антитело против Nesprin2			Ранее описано в Ref. 21
Флуоресцентный монтаж Медиа	Dako	S3023
2-метилбутан	Sigma Aldrich	O3551