Экспериментальные Стратегии перекрытия больших Tissue Пробелы в спинном мозге после поврежденном спинном острого и хронического поражения

Краткое содержание

Тяжелые травмы спинного мозга часто приводят к дефектам тканей. Описаны две возможности успешного заполнения таких пробелов для содействия адаптации тканей, регенеративным реакциям и функциональному улучшению у крыс путем имплантации системы механических микроконнекторов после острой травмы и через пять недель после полной пересечения спинного мозга.

Аннотация

После травмы спинного мозга (SCI) шрамом форм в ядре поражения, которое препятствует регенерации аксонов. Преодолевая месте повреждения после инсульта спинного мозга, опухоли резекций или дефектов тканей в результате травматических несчастных случаев могут помочь в облегчении общего восстановления тканей, а также восстановительный рост нервных волокон в и за пределы пораженного участка. представлены две экспериментальные стратегии лечения: (1) имплантация романа microconnector устройства в остро и полностью перерезана спинного мозга грудного отдела крысы к реадаптироваться разорвала спинного пни шнур ткани, и (2) заполнение полиэтиленгликоль сайта SCI хронически повреждениями крыс после рубец резекция. Хроническое повреждение спинного мозга в этой модели является полная перерезка спинного мозга, который был нанесен за 5 недель до начала лечения. Оба метода в последнее время достигнуты весьма обнадеживающие результаты и способствовало аксонов отрастание, благоприятное клеточного вторжения и функциональные улучшенияв моделях грызунов травмы спинного мозга.

Механическая система microconnector (ММС) является система многоканальной состоит из полиметилметакрилата (ПММА) с системой труб на выходе применить отрицательное давление к Mms Просвет, таким образом, потянув спинного мозга пни в сотовый структурированное отверстия. После того, как его имплантации в зазор ткани 1 мм ткань всасывается в устройство. Кроме того, внутренние стенки ммс являются микроструктурированная для лучшей адгезии тканей.

В случае хронического травмы спинного мозга подход, травмы спинного мозга ткани - в том числе площадь поражения рубцовой заполненные - иссекают на площади 4 мм в длину. После микрохирургической резекции рубцовой полученную полость заполнена полиэтиленгликолем (ПЭГ 600) , который был найден , чтобы обеспечить отличный субстрат для клеточного вторжения, реваскуляризации, регенерации аксонов и даже компактный ремиелинизации в естественных условиях.

Введение

Травматический повреждение спинного мозга приводит не только к потере аксонов , но это приводит к дальнейшему тканевых дефектов , которые мешают любые регенеративные ответы (для обзора см ^1,2). Ткани спинного мозга часто теряется через вторичный дегенерации, приводящей к образованию кист или отверстий внутри и вокруг области поражения. Большинство экспериментальных терапевтических вмешательств сосредоточиться на неполных спинальных повреждений спинного мозга, как частичные рассечение, раздавить или контузии травмы с оставшимся ободе здоровой ткани. Для получения полных травм как полных transections в результате травматических несчастных случаев или хирургических вмешательств, таких как опухоли резекций, только очень ограниченные варианты лечения доступны сегодня ^3,4. После полного рассечения, механиком натяжение приводит ткани в спинном культи ретракции, оставляя небольшой зазор в спинном мозге. Большинство стратегий сосредоточены на восполнить этот пробел с ткани, клетки или матрицы ^5,6.

Здесь другая стратегияпредставлен, а именно реадаптации отделенных пней с использованием нового microconnector устройства ^7. Для того , чтобы реадаптироваться два пни, механическая сила должна быть применена в качестве небольшого отрицательного давления для выполнения этой (Рисунок 1). Механическая система microconnector (ММС) представляет собой систему многоканальной полиметилметакрилата (ПММА) с сотовыми-образные отверстия (рис 1А) и снабжен системой выпускной трубки. Оно имплантируется в зазор тканей в результате полного рассечения спинного мозга у крыс (рис 1C). Одна трубка может быть соединена с вакуумным насосом , чтобы применить отрицательное давление к Mms (рис 1D). Давление тянет отключенных спинного мозга пни в виде пчелиных сот расселинам ммс, которые имеют микроструктурированных стенки для удержания ткани на месте , когда давление сбрасывается (Фигура 1В). Трубка может быть оставлена ​​без изменений после операции и прикреплен к осмотическому минипомпы для того,вливать вещества в активную зону поражения (рис 1E-F).

Помимо острого рассечения спинного мозга и другой тип полных результатов поражения от хирургического удаления опухоли спинного или твердого хроническое поражение шрама, приводящей к большими промежутками ткани в несколько миллиметров, которые не могут быть преодолены с помощью Mms до сих пор. Большинство пациентов с травмой спинного мозга страдают от хронических ран. У этих больных, полностью развитый рубец занимает ядро ​​поражения. Хирургическое удаление поражения рубца является концепция лечения , которая в настоящее время исследуемого после экспериментального ТСМ ^8,9. В то время как сама процедура резекция может быть выполнена, не вызывая значительного дополнительного урона, разрыв в результате чего ткань необходимо преодолеть с подходящей матрицей, которая позволяет и способствует регенерации тканей и, в конкретном случае, повреждений спинного мозга, регенерации нервных волокон для поддержания и развития функций опорно-двигательного аппарата. это былообнаружили, что низкомолекулярный полиэтиленовый гликоль (ПЭГ 600), является очень подходящим материалом для этой цели. Его отсутствие иммуногенности и очень низкой вязкости позволяют плавную интеграцию в окружающую ткань. Вставка биополимера в одиночку способствует нашествию полезных клеток, в том числе эндотелиальные клетки, клетки периферической шванновских и астроциты, и - что очень важно - регенерацию и удлинение аксонов нисходящих и восходящих трактов волокна, а также их ensheathment с помощью компактного миелина ^8. Установлено, что эти регенеративные ответы должны сопровождаться долговечными функциональных усовершенствований. Сочетание резекции рубцовой ткани и последующей имплантации ПЭГ 600 представляет собой безопасный и простой, но очень эффективное средство преодоления существенных дефектов спинного мозга ткани.

Протокол

Институциональные рекомендации по безопасности и комфорта животных соблюдались, и все хирургические вмешательства и до и после хирургического вмешательства по уходу за животными были предоставлены в соответствии с законом Германии о защите животных (Государственное ведомство, окружающей среды и защиты потребителей от Северный Рейн-Вестфалия, LANUV NRW ).

1. Полное Перерезка грудного отдела спинного мозга Женский крыс Wistar (220 - 250 г)

1. Подготовка спинного мозга
   1. С помощью изофлуран ингаляционной анестезии (2 - 3% от изофлуран в O ₂ / NO ₂ в соотношении 1: 2) и болюсной инъекции Carprofen (подкожно [SC] 5 мг / кг). Сочетание карпрофена и опиоидной бупренорфин (0,02 мг / кг подкожно) рекомендуется. Начните операцию, когда веко рефлекс на легкое прикосновение с ватным тампоном и подушечки абстинентного рефлекса на ущемление стимул с щипцами больше не наблюдается.
   2. Место животное на нагревательном одеяле при 37 ° C для поддержания temperatu телаповторно во время операции и положить глазной мази на глаза, чтобы избежать сухости под наркозом.
   3. Бритье спине животного и подготовить кожу с дезинфицирующим кожи.
   4. Разрежьте кожу на средней линии вдоль грудных позвонков на 4 см с хирургическим скальпелем и открыть его. От этого шага дальше, использовать стерильный хирургические инструменты для всех процедур (автоклавируют или погружной стерилизованные).
   5. Втяните мышцы выше грудных позвонков с помощью небольшой мышцы зажим.
   6. Удалите остистые процессы на грудном уровне 8 (Th8) и Th9 с костным костными кусачками путем осторожно отсечение небольшие кусочки кости до позвоночной кости не являются плоскими.
   7. С помощью анатомических щипцов поднять позвоночный столб на остистых TH7 и использовать костными кусачками, чтобы обрезать небольшие кусочки позвоночной кости от хвостового до ростральной до тех пор, пока ламинэктомии выполняется на Th8 и Th9. Expose твердую мозговую оболочку, не повреждая его, осторожно удаляя лишь несколько и очень небольшие кусочки позвоночной кости в то время.
   8. Зажмите цепи за счет 2 стабилизационных зажимов на отростков TH7 и Th10, поднимите животное расцепить дыхательные движения из позвонков.
2. Полное рассечение спинного мозга на грудном уровне 8/9
   1. Поднимите твердую мозговую оболочку с тонким пинцетом, вырезать твердую мозговую оболочку с тонкой глаз ножницами в поперечном направлении.
   2. Удерживайте боковую обрезанный конец твердой мозговой оболочки с тонким пинцетом и вставить спинной крючок в subarachnoidic пространство между твердой мозговой оболочкой и arachnoidea. Во избежание повреждения мозговых оболочек, не покалывания в мягкой или твердой мозговой оболочки либо с пинцетом или спинного мозга крючок.
   3. Медленно поверните крюк, чтобы поместить все это вдоль ткани спинного мозга, следя за тем, чтобы не колоть в ТМО (Pia по-прежнему нетронутыми).
   4. Поднимите спинной мозг в течение приблизительно 1 - 2 мм вверх, пока разрыв не виден на брюшной стороне между ткани спинного мозга и твердой мозговой оболочки.
   5. Вставьте мелкие глазные ножницы в пространство betweeп Dura и Пиа и перерезали спинной мозг, а спинной крючок остается на месте.
   6. Поднимите два пни спинного мозга с двумя щипцами и визуально обеспечить полное рассечение.
   7. Для контрольно-пораженном животных и животных с хронической травмы, закройте твердую мозговую оболочку по узловыми швами с мононити без адсорбирующихся 9.0 нитей.
   8. При хронических поражениях следуют часть 1.6.
3. Mms Имплантация
   1. Поместите Mms выше места повреждения с обеих труб, лежащих на каждой боковой стороне позвонка и опустить его в полость поражения.
   2. Шовные трубы к мышцам на стороне позвонка с не рассасывающиеся нити 4-0, чтобы обеспечить стабилизацию Mms. Обеспечить фиксацию ммс с помощью щипцов во время этого шага.
   3. Снимите соединительный палец ммс путем разрезания с парой тонких ножниц.
   4. Закройте твердую мозговую оболочку над ммс и сшить его с 9,0 нитями.
   5. Приложить одну трубку к вакуумному насосу, и уплотнениедругой зажимая.
   6. Слегка отрицательное давление к Mms с помощью вакуумного насоса через открытую трубку, всасывая спинного мозга пни в просвет Mms. Применение отрицательного давления в течение нескольких минут (при максимуме в течение 10 мин) и контролировать с помощью датчиков (250 - 350 мбар).
   7. Обрежьте трубы, близкие к ммс и снимите трубки. Продолжить с шагом 1.6.
4. Резекция спинного мозга ткани , включающий хроническое поражение шрамом на 5 неделе после первоначальной травмы
   1. Выполните шаги 1.1.1 - 1.1.5.
   2. Определение рубцовой ткани по коричнево-желтый внешний вид и жесткой ткани на верхней части спинного мозга. Аккуратно удалить поверхностные слои рубцовой ткани путем проведения с тонким пинцетом и резки с тонкими ножницами. С помощью этого метода, повторно открыть сайт ламинэктомии подвергать ткани, содержащей спинного мозга зону травмы. Остановить подготовку, когда Dura шов визуально идентифицирован.
   3. Зажмите позвоночник от 2 стабилизационный зажимает на спинуленные процессы TH7 и Th10, а затем поднять животное расцепить дыхательные движения из позвонков.
   4. При небольшом картонного линейкой измерить площадь спинного мозга, который должен быть иссекают (длина: 4 мм) и обозначая края этой соответствующей области ткани с поперечными разрезами, чтобы последующее удаление ткани.
   5. Удалить рубцовой ткани с помощью комбинации резки и аспирации. Достаньте ткань, которая была отделена от спинного мозга с поперечными насечками. Используйте нежное стремление всякий раз, когда это достаточно, чтобы позволить удаление ткани. Кроме того, в тех случаях, когда жесткая текстура рубцовой ткани делает аспирация ткани слишком сложно, использовать тонкие ножницы, чтобы вырезать и удалить эту ткань.
   6. Вставьте кусок (приблизительно 5 мм х 5 мм х 5 мм куб) гемостатической желатиновой губки в зазор ткани до кровоточащих стихает. Желатин губка будет уменьшаться в размерах, как только она пропитана жидкостью.
5. Implantation ПЭГ 600
   1. Подготовка 1 мл чистого неразбавленного ПЭГ 600 для инъекций при нагревании до 37 ° С.
   2. Удалить желатиновой губки.
   3. Вставьте достаточное количество (примерно 5 - 7 мкл) ПЭГ в зазор с использованием 10 мкл шприца или 10 мкл пипетки.
   4. Тщательно покрывают область с куском (приблизительно 5 мм х 4 мм) замены герметика / твёрдой.
   5. Закрепите герметик окружающих мышечной ткани с несколькими каплями клея ткани. Поместите герметик поверх ПЭГ-заполненной резекция зазором. Для предотвращения проскальзывания герметика, использовать небольшие капли клея ткани, чтобы исправить углы герметиком к окружающей мышечной ткани. Примечание: Во избежание утечки клея ткани на ткани спинного мозга!
6. Закрытие тканей и послеоперационный уход
   1. Шовный мышцы и слой кожи для слоя с узловыми швами с плетеным адсорбирующихся 4-0 нитей
   2. Вводят 2 × 2,5 мл хлорида натрия (NaCl[0,9%]) при 36 ° C подкожно для регидратации после операции. Однократное введение 5 мл NaCl будет простираться кожу животного и может привести к ненужному вреда животному. Не оставляйте без присмотра животное, пока полное сознание не восстанавливается.
   3. Вводят ежедневный карпрофен (подкожно 5 мг / кг) в течение не менее 2-х дней после операции. Дом для животных в одной клетке в течение первых 2-х дней, после чего в группах 2 - 3.
   4. Применяют лечение антибиотиками (ежедневно пероральное введение энрофлоксацину) для первого послеоперационного недели.
   5. У ручного мочевого пузыря мочеиспускания в два-три раза в день, осторожно поглаживая через живот животного от ростральной к хвосту. Будьте осторожны, чтобы не переместить позвоночник животного и не поднять животное на хвост. Вручную аннулированию мочевой пузырь полностью spinalized животного ежедневно в течение всего времени выживания. Необходимо соблюдать осторожность, чтобы поместить пищевые гранулы и бутылки с водой в высоту, которая может быть достигнута с помощью животных безстоя на hindpaws. Несмотря на то, будучи подрывается в задней функции четверти, животные двигаются и исследовать клетки активно сразу после операции. Рекомендуется держать крыс в общительных группах.
   6. При хронических поражениях оставить время выживания животных за пять недель до шрама резекции. Выполните шаги 1.4.

Результаты

Ткань Сохранение, аксонов Перерост и функциональная выгода ММС Имплантация после острого Полная перерезка спинного мозга
Показано , что острая имплантацию Mms стабилизировал полностью перерезаны пни спинного мозга и уменьшение усадки ткани (Фигура 2А в сравнении с B). Как визуализировали с помощью окрашивания трехцветный в сагиттальных срезах, зеленый соединительной ткани окрашивание фиброзного рубца в ак...

Обсуждение

Здесь два различных хирургических подходов представлены для устранения пробелов ткани в спинном мозге после (1) острый полное рассечение и ММС имплантации и (2) хроническим поражением спинного мозга и фиброзной удаление рубцов плюс матрицы имплантации PEG. Обе стратегии приводят к сохранению и регенерации тканей аксонов, а также к существенным локомоторной улучшению функций у обработанных животных. Для имплантации ммс адекватную фиксацию ммс в пределах спинного мозга фирмы твёрдой швом после операции является важным тех...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
PEG 600 Ph Eur	Merck/VWR	8,170,041,000
Gelastypt желатиновая губка	sanofi Aventis	PZN-8789582
Герметик Nescofilm	Roth	2569.1
Baytril	Bayer
Rimadyl (Carpofen)	Pfizer
Forene (Isoflurane)	Abbvie
Kodan (дезинфицирующее средство для кожи)
Histoacryl (клей для тканей)
Friedman-Pearson Rongeur, чашка 1 мм, прямая	Fine Science Tools	16020-14
Микрошпатель "два в одном" - 12 см	Fine Science Tools	10091-12
Щипцы Dumont #7 - Inox Medical	Fine Science Tools	11273-20
Щипцы Dumont #5/45 - Inox Medical	Fine Science Tools	11253-25
Крючок для спинного мозга	Инструменты для тонкой науки	10162-12
Ножницы	Инструменты для тонкой науки	14078-10
Зажим	Aesculap	EA016R
Ethicon Vicryl 4-0
Bepanthen Augen- und Nasensalbe	Bayer
Анатомические щипцы	Fine Science Tools	11000-13
Самоудерживающийся ретрактор	Инструменты для тонкой науки	17008-07
Зажим для кожи	Инструменты для изобразительной науки	13008-12
Aluspray	Селектавет