Методическая статья

Лазерным наведением нейронов в головном мозге Трассировка Экспланты

DOI:

10.3791/53333

⸱

25 ноября 2015 г.

 , 
1Department of Physiology and Biophysics, University of Colorado School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы описываем технику, чтобы маркировать нейроны и их процессы с помощью Антероградный или ретроградная трассирующих инъекций в ядрах головного мозга с использованием препарата в пробирке. Мы изменили существующий метод из п я пробирке трассирующими электропорации, воспользовавшись флуоресцентно меченного мутантов мыши и основную оптического оборудования с целью повышения точности маркировки.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы представляем технику, которая сочетает в себе пробирке протокол в трассирующими впрыска, которая использует серию электрических импульсов и давления, чтобы увеличить поглощение красителя через электропорации в мозг эксплантов с целевой лазерной подсветки и соответствующих фильтров очки во время процедуры. Описанная методика электропорации в пробирке по себе дает относительно хорошее визуальное управление для таргетинга определенные участки мозга. Объединив его с лазерным возбуждением люминесцентных генетических маркеров и их чтения через фильтр очки группы обход, который может забрать выбросов генетически меченых клеток / ядер и красителя трассировки флуоресцентного, исследователь может существенно повысить точность инъекций находя интересующую область и контроля за распространением красителя / поглощения в области инъекции гораздо более эффективно. Кроме того, этот метод лазерного излучения позволяет исследовать функциональные возможности данного neurocircuit по провiding информацию о типе нейронов, в определенной области в тех случаях, когда выражение GFP связана с типом передатчика, выраженного субпопуляции нейронов.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для того, чтобы определить определенный нейронов (микро) схема, надо начать с поиска различных участников указанной схеме, и их способа подключения. С тех пор, публикация Уоллера о neurofiber трассировки через lesioning 1 большое разнообразие методов нейроанатомической трассировки был создан. Некоторые из этих методов может быть применен в фиксированной ткани вскрытии 2-4, другие полагаются на активном переносе красителя в живых нейронов, а обнаружен в 1971 5-6. Последнее может быть далее подразделены на две группы различения методов воспользовавшись активного ретроградный (от введенного области к источнику заданной проекцией, т.е.. В somata нейронов, которые проецируют на указанный участок) и активным антероградную (от вводят площадь к цели в данной проекции, то есть. аксонов прогнозов и аксонов терминалов меченых нейронов) транспорта. Кроме того, в некоторых случаях TRACER материал вводят в живых животных, которые затем пережить инъекции несколько дней или недель (в естественных условиях трассирующих инъекций), в то время как в других случаях вводят эксплантированных мозги и инкубировать в течение нескольких часов после инъекции в области искусственного спинномозговой жидкости (в пробирке трассирующими инъекции) ,

В этом протоколе мы изменили существующий в пробирке техники электропорации 7-8 маркировать нейронов somata и процессы в Антероградный и ретроградной трассировки экспериментов с использованием choleratoxin субъединицы-б и тетраметилродамин декстран как след веществ. Общая цель этого протокола состоит в обеспечении нейрофизиологов с эффективным инструментом, чтобы проследить закономерности нервных подключения между различными ядрами головного мозга, в то время как воспользовавшись доступных трансгенных линий мышей и основной оптического оборудования с целью повышения точности ориентации во трассирующих инъекций. Хотя метод Антероградный и ретроградной трассировки с помощьюcholeratoxin и декстран амин и их соответствующие флуоресцентно меченных конъюгатов не нова 9-13 (как это метод электропорации, например. Хаас и др. 14), сочетание индикаторных инъекций с электропорации в подготовке в пробирке с участием блоков ткани головного мозга является более недавнее развитие 7. Основное преимущество над методами нейронных трассировку и тот же тип меченых красителей в живых животных является увеличение интенсивности маркировки, из-за более высокой эффективности, с которой электропорации краситель быть занимаемого нейронов. Дополнительным преимуществом является укороченный инкубационный период (необходимое для транспортировки красителя) и его повышенная точность целевого во время инъекции трассирующей, потому что экспериментатор визуальный контроль над целевой области инъекции. Последнее также означает, что нет дороже стереотаксической оборудование не требуется, чтобы найти ядро ​​или мозга сферу интересов.

Для дополнинально повысить адресности, мы воспользовались трансгенной линии мышей, которая выражает GFP в глицинергических субпопуляции нейронов 15 и основной оптического оборудования, состоящих из ручного лазерного указателя 405 нм фильтрации длины волны и соответствующий полосовой очки (450 - 700 нм). Таким образом, мы достигли значительного дальнейшего увеличения ориентации точность путем идентификации области инъекции через флуоресцентного сигнала и обеспечивая более тонкую способ управления для распространения красителя в зоне впрыска путем наблюдения за взаимодействием между сигналом коренного GFP и индикатором флуоресценции. Наша методика позволяет также раскрыть функциональность схеме вместе с его подключения путем выявления GFP-положительных тормозящих нейронов (или возбуждающих в других линий мышей), которые были заполнены с индикатора.

В целом, мы усиливается мощный инструмент Нейрологическая изучать Коннектом позвоночных мозг и оценки тон разные нейроанатомические особенности данной neurocircuit. С помощью трансгенных мышей наряду с недорогой и широко доступный оптического оборудования мы смогли значительно увеличить точность ориентации наших инъекций. Кроме того, трансгенные мыши, позволили нам определить тип прослеженных соединений, которые помогли раскрыть функциональность тормозного микросхемы в слуховой мозга.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Оптический генотипирование

1. Оптический генотипирование мыши Щенки

  1. Проверка на экспрессию соответствующих флуоресцентным маркером, используя лазерный указатель соответствующего длине волны возбуждения (405 нм в экспериментах, описанных здесь), и соответствующий фильтр очки, блокирующие длины волны возбуждения, но прохождения волны излучения (450 - 700 нм в экспериментах, описанных здесь) , Направьте лазерный указатель на задней части головы или спинного мозга щенка мыши (рисунок 1). Избегайте светит лазер в глаза и длительного воздействия на кожу лазерного света.

2. Оптический генотипирование пожилых животных

  1. Глубоко обезболить мышь (в возрасте до P14 P138 в экспериментах, описанных здесь) с передозировкой пентобарбитала через внутрибрюшинного введения (120 мг / кг массы тела). Подтвердите правильное анестезии, проверяя рефлексы животного (кратко зажать кончик гое ухо или один из задних ног, чтобы вызвать рефлекс втягивания в уха или ноги).
  2. Примечание: Несмотря на использование передозировки пентобарбитала (120 мг / кг массы тела) мы ссылаемся на процедуры инъекции в "глубокой анестезии" вместо эвтаназии, потому что животное идеально жив (т.е. его сердце все еще ​​бьется), когда хирургии и перфузии начать. Это обеспечивает более эффективное кровоснабжение внутренних органов, включая головной мозг.
  3. После того, как животное не показывает каких-либо рефлексы, осторожно снимите кожу, покрывающий череп (рис 2а), сделав надрез в коже, покрывающей заднюю часть головы и резки в средней части черепа. Защиту непокрытого череп к лазерным светом и наблюдать флуоресценцию через очки с фильтром, как описано выше. Если наблюдается положительный сигнал GFP, перейдите к шагу 2, если нет, пожертвовать животное через обезглавливание (второй / обеспечение формы эвтаназии после нашегоПравила IACUC).

Примечание: В даже старых мышей (> 1 месяца) флуоресценции можно наблюдать через глаза животного.

2. Transcardial перфузии и мозг Подготовка

  1. Заливать транскардиальную охлажденным на льду фосфатно-солевом буфере (PBS; NaCl: 137 мМ, KCl: 2,7 мМ, KH 2 PO 4: 1,76 мМ Na 2 HPO 4: 10 мМ) с помощью шприца иглу 30 G в значительной степени удалить кровь из животное.
    1. Во-первых, тщательно открыть грудную клетку с острыми ножницами и затем толкать иглу в левый желудочек сердца. Начало прокачки PBS в сердце и аорту и сразу после этого шага открыть правое предсердие сердца с ножницами, чтобы позволить крови, чтобы выйти из тела. Примечание: перфузии занимает 5 - 10 мин в зависимости от размера животного.
  2. После обескровливания через перфузии, обезглавить животное, обеспечить его голову контактный пeedles (или 30 г шприц иглы), прокалывая их через глазницы в подготовке блюдо и удалить мозг из черепа.
    1. Во-первых, используйте острые ножницы, чтобы отрезать кожу наложения череп: сделать небольшой разрез в задней части головы, а затем разрезать вдоль средней линии на спинной стороне головы, разрезанная по бокам просто каудально глаз животного и, наконец, снижение в каудальном направлении, чтобы полностью удалить закрылки кожи на задней части головы.
    2. Затем повторите то же самое резки шаблон для самого черепа, убедитесь, что обе улитки удалить в процессе, потому что это существенно упростит удаление ствола мозга в конце концов. После этой процедуры хвостовой половина мозга должна лежать полностью подвержены.
    3. На следующем этапе, использовать острым лезвием бритвы или скальпель, чтобы прорезать весь передний мозг под углом около 45 ° и примерно 2 мм ростральной из мозжечка. Выкопайте отделенной передней части мозга с АБЛОР шпатель.
    4. Используйте лопаточку, чтобы поднять хвостовой половину мозга на его ростральной конце, а затем разрезать черепных нервов, которые все еще подключен к ствола мозга на его вентральной стороне. В качестве конечного результата, хвостовой половина мозга, включая ствол мозга должны свободно падать остальной части головы животного подготовленной.
    5. Переверните удалены хвостовой половину мозга, чтобы разоблачить его брюшной стороне и разрезать вдоль фронтальной плоскости только ростральной (для Антероградный инъекций) или просто хвостовой (для ретроградных инъекций) из вентрально расположенных "луковиц", содержащих тело трапециевидную (см шаг 2.3).
      1. Всегда используйте острый нож или бритва скальпель для разрезания, чтобы минимизировать гибель клеток, вызванную чрезмерной механической нагрузки на ткани. Как конечный результат, должны были получен эксплантов мозга, охватывающих около 1 см в длину и содержит полный комплекс верхнем оливарном вдоль других областях мозга.

Примечание: Этот протокол показывает процедуру индикаторного инъекции в организм трапеции, расположенной в слуховой мозга. Адаптация местоположение и ориентацию режущих плоскостей и местах инъекций по мере необходимости. Если флуоресцентных области мозга, представляющие интерес лежат достаточно близко к поверхности мозга, так что они могут быть идентифицированы и введенного без разрезания мозг (рис 2B), то корональной шаг резания может быть опущен.

  1. Определить тело трапециевидную как два брюшных видных "луковиц", содержащих брюшной ядро ​​тела трапеции (VNTB).

Примечание: Для получения дополнительной анатомической ссылкой о приблизительной стереотаксической расположения этих режущих плоскостей, см Франклин & Paxinos, 2008. Панель 78 атласа, брегмы ~ -5.7 мм показывает медиального ядра тела трапеции (= MNTB) помечены как "Tz ". Панель 69 показывает брюшной ядро ​​трапециевидного боду (VNTB) помечены как "MVPO" (medioventral periolivary ядра) 19.

3. Антероградный / Ретроградная Трассировка

Примечание: Выполните все следующие процедуры при комнатной температуре (25 ° C).

  1. После резки, поместите коротколатентных эксплантов в подготовке блюдо с кислородом (95% O 2, 5% 2 СО) рассекает решение (NaCl: 125 мМ, KCl: 2,5 мм, MgCl 2: 1 мм, CaCl 2: 0,1 мМ, глюкоза : 25 мм, NaH 2 PO 4: 1,25 мм, NaHCO 3: 25 мм, аскорбиновую кислоту: 0,4 мМ, миоинозитола: 3 мм, пировиноградная кислота: 2 мМ), закрепив его с 30 г иглы шприц. Убедитесь, что область нагнетания вверх.
  2. Извлеките инъекции пипетки из боросиликатного стекла и заполнить их с одним из следующих трех растворов: а) 1,0 мг / мл раствора choleratoxin субъединица B-конъюгированный с Alexa 555 флуорофора в PBS 12-13 (используется в основном для ретроградного транспорта), б ) 1% -dilution в 0,9% физиологического раствора декстрана тетраметилродамин 555 (3000 МВт, в основном используется для ретроградного транспорта) или в) 1% -dilution в 0,9% физиологического раствора в 10000 МВт декстран-TRITC 555 (в основном используется для транспортировки антероградной).
    1. Убедитесь, что диапазон инъекции пипеток сопротивлений от 2,5 до 3,5 МОм и что они производятся в 3 - 4 тянущих циклов. Для экспериментов, описанных здесь, достичь этого путем выбора предварительно запрограммированных потянув алгоритм на пипетки съемника.
  3. Осветите эксплантов мозга, используя статически установлен лазерный указатель с соответствующей длиной волны (№ 2 на рис 3А; 405 нм длина волны в экспериментах, описанных здесь). Используйте лазерный указатель в качестве руководства для инъекций, и цель лазерного луча в флуоресцентно-меченного ядра головного мозга или клеток, представляющих интерес, которые будут выводиться.
  4. Найти и наблюдать освещенную целевую область через бинокулярный микроскоп, а носить очки совместимые фильтр (450 - 700 нм полосовой фильтр в экспериментах, описанных здесь). Вставьте впрыска электрод через микроманипулятора в интересующей области.
  5. Внедрить трассирующими вещество. Инъекции состоят из 2 - 10 импульсов давления при 15 фунтов на квадратный дюйм в течение 50 мс каждый, используя давление впрыска устройство, направленное перпендикулярно в области процентной (ROI) в разделе мозга. Администрирование каждого импульса давления с интервалом в 10 - 15 сек, чтобы позволить краситель распространяться.
  6. В случае тетраметилродамин (TRITC) инъекций, дополнительно стимулировать электрически для повышения поглощения красителя через электропорации с электродом, расположенным в районе мозга интереса (MNTB и VNTB в экспериментах, описанных здесь).
    1. Используйте 8 TTL импульсы 8 вольт в течение 50 мс с 50 мс интервалами межимпульсных, с приводом от стимулятора и усиливается до 55 V с блоком изоляции стимуляция (пункты № 7 и 9 на рис 3B). Используйте 10 - 20 повторений этого протокола, Adminisубито в течение нескольких минут 7,8. Убедитесь, что на землю электрод должным образом - провод заземления должен быть подключен к решению ванны!
  7. Проверьте для успеха инъекции. Поскольку люминесцентные трассирующими с большей длиной волны излучения также испускать флуоресцентный сигнал при лазерном возбуждении коротких длин волн, визуально проверить на поглощение красителя / распространение в закачиваемой целевой области при освещении площади с лазером и наблюдая через очки фильтров.

4. Инкубация

  1. После инъекции, инкубировать brainstems в кислородом искусственной цереброспинальной жидкости (ACSF; NaCl: 125 мМ, KCl: 2,5 мМ, MgCl 2: 1 мМ, CaCl 2: 2 мМ, глюкоза: 25 мм, NaH 2 PO 4: 1,25 мм, раствором NaHCO 3: 25 мм, аскорбиновую кислоту: 0,4 мМ, мио-инозит: 3 мм, пировиноградная кислота: 2 мм, продувают 95% O 2 - 5% CO 2) при комнатной температуре (RT, 25 ° С) в течение 1 - 4 ч, в то время каккраситель транспортируется. Пузырь решение в течение всего инкубационного периода.
  2. Впоследствии передачи brainstems в 4% параформальдегида (PFA), растворенного в PBS (примерно 100 мл; Ph. 7 для смеси PFA / PBS) и инкубируют их при 4 ° С, чтобы позволить пост-фиксацию в течение ночи (O / N).

5. Ткань для нарезки и монтажа

  1. На следующий день, мыть ствола головного мозга в три раза PBS (5 мин на каждой стадии промывки), рассматривать его в 4% агара, а затем нарезать 50 - 80 мкм толстыми ломтиками на vibratome. Ломтики монтирования при помощи монтажного среду на предметное стекло, покровное и.
  2. При желании, маркировать участки с флуоресцентным Ниссля в течение 25 мин (например синий Нисслю в 1: 100 разведения в АБ СМИ).
    1. Для подготовки AB СМИ, смешать 250 мл 0,2 М фосфатного буфера (PB; 51 мм KH 2 PO 4, 150 мМ Na 2 HPO 4), 15 мл 5 М NaCl, 15 мл 10% Тритон-X, 220 мл DDH 2 O и 5 г бычьего сывороточного альбумина.
    2. Товар доступенде и добиться успеха в маркировке шаг Ниссля на 3 стадии промывки в PBS (10 мин каждый).

Примечание: В случаях, когда более толстые участки должны быть установлены и проанализированы (в описываемых экспериментах такие срезы 100 - 500 микрон, чтобы сохранить аксонального соединения через большие расстояния), метод можно сочетать с тканевой очистки. Мы нашли ClearT2 12, чтобы быть успешным 20. Когда шаг ткани очистка включена, выполните его перед установкой секций.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Цифры 1 и 2 показывают, как лазерная указка и лазерные очки можно использовать для быстрого и недорого генотипу GFP положительные животных из помета. В тех случаях, молодых детенышей мыши, методика может быть использована для неинвазивного определения GFP метку в головном мозге животного через череп и вышележащей кожи (фиг.1А - D). Излучение флуоресценции можно увидеть через кожу и череп щенков мыши по крайней мере до 3 день постнатального (рис 1c). Процедура показана <...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Общая численность в пробирке индикаторного электропорации, в отличие от исследований в естественных условиях отслеживания, является то, что дает исследователям лучше доступ к области мозга интерес и, следовательно, не предполагает дорогостоящего стереотаксической (и часто электрофизиологическое) оборудования. Кроме того, период выживания требуется для эксплантов мозга охватывает только несколько часов (1 - 4), а не дней или даже недель в случае в естественных условиях трассирующих инъекций (см...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы не имеем ничего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Поддерживается NIH / NIDCD R01 DC эксперименты 011582. визуализации были проведены в университете Колорадо Anschutz Medical Campus Расширенный световой микроскопии Ядра при частичной поддержке NIH / NCRR Колорадо аст номер гранта UL1 RR025780 и расстройств Скалистые горы Neurlogical Core Center Грант NIH P30NS048154. Д-р Саша дю Лак из Института Солка предоставил нам мышей GlyT2-GFP.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Хлорид натрияSigma-AldrichS7653Все химикаты от Sigma-Aldrich, если не указано иное.
Хлорид калия P9333
Фосфат калия одноосновнойP5655
Двухосновнойнатрия S907
ХлоридM2670
ХлоридC5080
ГлюкозаG7528
БикарбонатS6297
Аскорбиновая кислотаA4544
Мио-инозитолI5125
ПируватP2256
Бычий сывороточный альбуминA2153опционально, для дополнительной (иммуно)гистохимии
Triton-X-100X100опционально, для дополнительной (иммуно)гистохимии
Поли(этиленгликоль), 8000 МВтP2139опционально, для очистки мозга
ФормамидFisher ScientificF84опционально, для очистки мозга
Холератоксин субъединица-bМолекулярные зондыC-34776 (Alexa 555) 
Молекулярные зондытетраметил-родаминаD-7162 (Alexa 555)
Флуоресцентный NisslInvitrogenN-21479 (синий)опционально
ПараформальдегидFisherScientific SF93
AgaroseInvitrogen16520
Fluoromount-GSouthern Biotech0100-01
Пентобарби-талВортек ФармасьютикалсФатал-Плюс 
Нити боросиликатного стеклаГарвардский аппаратG150F-10
Дозатор для дозаторовZeitz Instruments, ГерманияDMZ Универсальный пуллер
Перфузионная установкаЛазерная
указка на заказ laserpointerpro.com, ГонконгHK-88007294 (405 нм)
Фильтрующие/защитные очкиDragon Lasers, КитайLSG09 (полосовой 450-700 нм)
Бионокулярный микроскоп Wild Heerbrugg, ШвейцарияWild M3Оборудован осветителем высокой интенсивности (MI-150; Dolan-Jenner Inc.) 
PicospritzerParker InstrumentsPicospritzer III
PC с установленным программным обеспечением MC Stimulus MultiChannel Sys-tems, Германия (программное обеспечение)
2-канальный стимуляторMulti Channel Sys-tems, ГерманияSTG-1002
Блок изоляции стимуляцииA.M.P.I., ИзраильIso-Flex
МикроманипуляторNarishige, ЯпонияYOU-1
VibratomeLeica, ГерманияVT1000S
фосфат магния кальция натрия натрия

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Waller, A. Experiments on the sections of glossopharyngeal and hypoglossal nerves of the frog and observations of the alterations produced thereby in the structure of their primitive fibers. Philos. Trans. R. Soc. Lond. 140, 423-429 (1850).
  2. Fink, R. P., Heimer, L. Two methods for selective silver impregnation of degenerating axons and their synaptic endings in the central nervous system. Brain Res. 4, 369-374 (1967).
  3. Nauta, W. J. Selective silver impregnation of degenerating axons in the central nervous system. Stain Technol. 27, 175-179 (1952).
  4. Ramón y Cajal, S. Histologie du système nerveux de l'Homme et des vertébrés. , Maloine, Paris. (1911).
  5. Kristensson, K., Olsson, Y. Uptake and retrograde transport of peroxidase in hypoglossal neurons. Electron microscopical localization in the neuronal perikaryon. Acta Neuropathol. 19, 1-9 (1971).
  6. Kristensson, K., Olsson, Y. Retrograde axonal transport of protein. Brain Res. 29, 363-365 (1971).
  7. Burger, R. M., Cramer, K. S., Pfeiffer, J. D., Rubel, E. W. Avian superior olivary nucleus provides divergent inhibitory input to parallel auditory pathways. J. Comp. Neurol. 481, 6-18 (2005).
  8. Ford, M. C., Grothe, B., Klug, A. Fenestration of the calyx of Held occurs sequentially along the tonotopic axis, is influenced by afferent activity, and facilitates glutamate clearance. J. Comp. Neurol. 514, 92-106 (2009).
  9. Glover, J. C., Petursdottir, G., Jansen, J. K. S. Fluorescent dextran amines used as axonal tracers in the nervous system of chicken embryo. J. Neurosci. Methods. 18, 243-254 (1986).
  10. Trojanowski, J. Q., Gonatas, J. O., Gonatas, N. K. Conjugates of horseradish peroxidase (HRP) with cholera toxin and wheat germ agglutinin are superior to free HRP as orthograde transported markers. Brain Res. 223, 381-385 (1981).
  11. Trojanowski, J. Q., Gonatas, J. O., Steiber, A., Gonatas, N. K. Horseradish peroxsidase (HRP) conjugates of cholera toxin and lectins are more sensitive retrograde transported markers than free HRP. Brain Res. 231, 33-50 (1982).
  12. Conte, W. L., Kamishina, H., Corvin, J. V., Reep, R. L. Topography in the projections of lateral posterior thalamus with cingulate and medial agranular cortex in relation to circuitry for directed attention and neglect. Brain Res. 1240, 87-95 (2008).
  13. Conte, W. L., Kamishina, H., Reep, R. L. Multiple neuroanatomical tract-tracing using fluorescent Alexa Fluor conjugates of cholera toxin subunit B in rats. Nat. Protoc. 4, 1157-1166 (2009).
  14. Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo- from single cells to the entire brain. Differentiation. 70, 148-154 (2002).
  15. Zeilhofer, H. U., et al. Glycinergic neurons expressing enhanced green fluorescent protein in bacterial artificial chromosome transgenic mice. J. Comp. Neurol. 482, 123-141 (2005).
  16. Poyatos, I., Ponce, J., Aragön, C., Giménez, C., Zafra, F. The glycine transporter GLYT2 is a reliable marker for glycine-immunoreactive neurons. Brain. Res. Mol. Brain Res. 49, 63-67 (1997).
  17. Gong, S., et al. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425, 917-925 (2003).
  18. Heintz, N. Bac to the future: the use of BAC transgenic mice for neuroscience research. Nat. Rev. Neurosci. 2, 861-870 (2001).
  19. Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , 3rd ed, Elsevier/Academic Press. New York. (2008).
  20. Kuwajima, T., Sitko, A. A., Bhansali, P., Jurgens, C., Guido, W., Mason, C. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140, 1364-1368 (2013).
  21. Wouterlood, F. G., Jorritsma-Byham, B. The anterograde neuroanatomical tracer biotinylated dextran amine: comparison with the tracer PHA-L in preparations for electron microscopy. J. Neurosci. Methods. 48, 75-87 (1993).
  22. Lanciego, J. L., Wouterlood, F. G. A half century of experimental neuroanatomical tracing. J. Chem. Neuroanat. 42, 157-183 (2011).
  23. Rodriguez-Contreras, A., Silvio, J., van Hoeve, S., Habets, L. P., Locher, H., Borst, J. G. G. Dynamic development of the calyx of Held synapse. PNAS. 105 (14), 5603-5608 (2008).
  24. Albrecht, O., Dondzillo, A., Mayer, F., Thompson, J. A., Klug, A. Inhibitory projections from the ventral nucleus of the trapezoid body to the medial nucleus of the trapezoid body in the mouse. Front. Neural Circuits. 8, 83(2014).
  25. Benson, D. A., Teas, D. C. Single unit of binaural interaction in the auditory cortex of the chinchilla. Brain Res. 103, 313-338 (1976).
  26. Koka, K., Jones, H. G., Thornton, J. L., Lupo, J. E., Tollin, D. J. Sound pressure transformations by the head and pinnae of the adult Chinchilla (Chinchilla lanigera). Hear Res. 272 (1-2), 135-147 (2011).
  27. Ryan, A. Hearing sensitivity of the mongolian gerbil, Meriones unguiculatus. J. Acoust. Soc. Am. 59 (5), 1222-1226 (1976).
  28. Zwicker, E., Fastl, H. Psychoacoustics Facts and Models. , Springer. (1990).
  29. Chu, G., Hayakawa, H., Berg, P. Electroporation for the efficient transfection of mammalian cells with DNA. Nucleic Acids Res. 15 (3), 1311-1326 (1987).
  30. Klenchin, V. A., Sukharev, S. I., Serov, S. M., Chernomordik, L. V., Chizmadzhev, Y. A. Electrically induced DNA uptake by cells is a fast process involving DNA electrophoresis. Biophys J. 60 (4), 804-811 (1991).
  31. Elias, L., Kriegstein, A. Organotypic Slice Culture of E18 Rat Brains. J. Vis. Exp. (6), e235(2007).
  32. Gähwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. J. Neurosci. Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
  33. Tallini, Y. N., et al. BAC transgenic mice express enhanced green fluorescent protein in central and peripheral cholinergic neurons. Physiol Genomics. 27 (3), 391-397 (2006).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

B

Похожие статьи