Культуры, полученные из стволовых клеток, обладают огромным потенциалом для моделирования инфекционных заболеваний. Здесь описывается культура органоидов желудка мыши и человека, полученная из взрослых стволовых клеток. Органоидам микроинъекционно вводится желудочный патоген Helicobacter pylori.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Органоиды как модель для инфекционных болезней: Культура человека и мыши желудка органоидов и Микроинъекция Helicobacter Pylori
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Недавно биологи-инфекционисты использовали культуры, полученные из стволовых клеток, чтобы удовлетворить потребность в новых и лучших моделях для изучения взаимодействия хозяина и патогена. Были использованы три клеточных источника: эмбриональные стволовые клетки (ESC), индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSC) или взрослые стволовые клетки. В данной работе описывается культура органоидов желудка мыши и человека, полученных из взрослых стволовых клеток, и используется для лечения желудочного патогена Helicobacter pylori. Желудочные железы человека выделяют из резекционного материала, засеивают в базальную матрицу и внедряют в среду, содержащую факторы роста эпидермальный фактор роста (EGF), R-спондин, Noggin, Wnt, фактор роста фибробластов (FGF) 10, гастрин и бета-ингибитор трансформирующего фактора роста (TGF). В этих условиях желудочные железы разрастаются в трехмерные органоиды, содержащие 4 линии желудка. Органоиды расширяются бесконечно и могут быть заморожены и разморожены так же, как клеточные линии. Для исследования инфекций бактерии микроинъецируются в просвет органоидов. Зараженные органоиды обрабатываются для визуализации. Описанные методы могут быть адаптированы к другим органоидам и инфекциям другими бактериями, вирусами или паразитами. Это позволяет изучать индуцированные инфекцией изменения в первичных клетках.
Введение
Изучение патогенных микроорганизмов зависит от адекватных модельных систем для имитации в естественных условиях заражение. Для некоторых инфекционных агентов, адекватные модели системы не хватает, а некоторые из используемых систем далеки от оптимальных. Одним из примеров является бактерия желудка Helicobacter Pylori (H.), который причинно связаны с развитием рака желудка. Тем не менее, в отсутствие более подходящей системы для культивирования клеток, многие исследования, направленные на анализ молекулярных механизмов, лежащих в основе линий Использование клеточного рака развитие рака, которые представляют собой конечную раковой каскада. Первичные, ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Установление желудка Органоид культуры
Примечание: Этот протокол может быть использован для выделения желудочных желез от мыши или тканей человека. Рекомендуется использовать ткани примерно 1 см. Человека ткань может быть получена из желудка резекции или биопсии.
- Подготовка материала
Примечание: используется матрица подвал Матригель. Держите подвал матрицу на льду во все времена. Хранить в подвал матрицу при -20 ° С и оттаивают на льду перед использованием. Базальная среда относится к Расширенный DMEM / F12, дополненной HEPES; соответствующий источник глютамина, таких как Glutamax и соответствующих антибиотиков, таких....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Этот протокол позволяет изоляции желудочных желез (рисунок 2). Железы высевают в подвале матрицы, которая затвердевает, как капли в скважине, обеспечивая 3-мерного рамки богатой ламинином и коллагена, чтобы позволить железы расти в органоидов (рисунок 3). Органоиды, как правило, начинают как маленькие кисты и в 12-16 дней, они расширяют в сферах с диаметром 50-300 мкм в (рисунок 4). Некоторые органоиды останется кистозная, некоторые развития малого buddings. Последнее, .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Этот протокол описывает использование постоянно расширяющихся, нетрансформированных первичных органоидов из взрослых стволовых клеток для биологии инфекций. Критическими этапами являются: 1) выделение жизнеспособных желез, 2) расширение органоидов и 3) микроинъекция. Ниже приведены некоторые предложения по модификациям, устранению неполадок и техническим рекомендациям.
По сравнению с другими методами выделения, которые используют энергичное встряхивание или пипетирование для высвобождения жел.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Ганс Клеверс является изобретателем нескольких патентов на органоидную культуру. В противном случае авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Эта работа была поддержана стипендией Марии Кюри ЕС (EU/300686-InfO) для S.B. и премией за исследования от Объединенного европейского фонда гастроэнтерологии для H.C. Мы хотели бы поблагодарить Гарри Бегтела, Йеруна Корвинга и Центр визуализации Хубрехта за техническую помощь, Меритчелла Хуча за помощь в создании первоначальной органоидной культуры и Яну Заврос за обсуждение.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| <сильный>средний | |||
| HEPES | Invitrogen | 15630-056 | |
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-028 | |
| Matrigel, GFR, без фенола | BD | 356231 | |
| GlutaMAX | Invitrogen | 35050-079 | Исходная концентрация 200 мМ, конечная концентрация 2 мМ |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | Исходная концентрация 50 х, конечная концентрация 1х |
| N-ацетилцистеин | Sigma-Aldrich | A9165-5G | Стоковая концентрация 500 мМ, конечная концентрация 1 мМ |
| Мышиный рекомбинантный EGF | Invitrogen | PMG8043 | Стоковая концентрация 500 &микро; г/мл, конечная концентрация 50 нг/мл |
| Человеческий рекомбинантный FGF10 | Peprotech | 100-26 | Стоковая концентрация 100 & микро; г/мл, конечная концентрация 200 нг/мл |
| TGF&бета; i A-83-01 | Tocris | 2939 | Концентрация материала 500 &микро; М, конечная концентрация 2 & микро; М |
| Никотинамид | Sigma-Aldrich | N0636 | Стоковая концентрация 1 М, конечная концентрация 10 мМ |
| [Leu15]-Гастрин | Сигма-Олдрич | G9145 | Концентрация запаса 100 &микро; M, конечная концентрация 1 нМ |
| RHOKi Y-27632 | Sigma-Aldrich | Y0503 | Концентрация материала 10 мМ, конечная концентрация 10 & микро; M |
| Wnt3A кондиционированная среда | Стабильная клеточная линия, полученная в лаборатории Клеверса. Конечная концентрация 50%. Клетки можно получить у Ганса Клеверса. | ||
| R-спондин1 кондиционированная среда | Стабильная клеточная линия, полученная в лаборатории Куо. Конечная концентрация 10%. Клеточную линию можно получить у Calvin Kuo, Stanford. | ||
| Кондиционированная среда | Стабильная клеточная линия, полученная в лаборатории Clevers. Конечная концентрация 10%. Клетки можно получить у Ганса Клеверса. | ||
| R-spondin3 | R& D | 3500-RS/CF | Альтернативный источник R-спондина. Это было проверено на органоидах кишечника человека (1 & микро; г/мл), но еще не на желудочных органоидах. |
| Noggin | Peprotech | 120-10 | Альтернативный источник для noggin. Это было протестировано на органоидах кишечника человека (100 нг/мл), но еще не на органоидах желудка. |
| TrypLE express | Life Technologies | 12605036 | решение для ферментативной диссоциации |
| CoolCell® Безалкогольные контейнеры для заморозки клеток | биоцизия | BCS-405 | |
| Восстанавливающая клеточная культура Замораживающая среда | Invitrogen | 12648-010 | |
| Antibiotics | |||
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | Антибактериальная композиция против бактерий и грибков. Это полезно после инициации культуры. Для долгосрочного посева вы можете перейти на другие антибиотики или не принимать их. |
| Пенициллин/Стрептомицин | Инвитроген | 15140-122 | Исходная концентрация 10 000/10 000 Ед/мл, конечная концентрация 100/100 Ед/мл. Может использоваться в качестве альтернативы Примоцину в культуре длительного времени. |
| Other | |||
| Tweezers | Neolabs | 2-1033 | Пинцет с тонкими кончиками полезен для удаления мышечного слоя из тканей. |
| 4 Well Multidish | Thermo Scientific | 144444 | Вы можете использовать другие Multidish. Они были особенно полезны для микроинъекций, поскольку имеют низкий внешний ободок и обеспечивают большую мобильность манипулятора. |
| Микроманипулятор | Narishige | M-152 | |
| Микроинъектор | Narishige | IM-5B | |
| Стереомикроскоп | Leica | MZ75 | |
| Workbench Clean Air | Изготовлен на заказ для установки стереомикроскопа в состоянии ML2 | ||
| Капилляры | Harvard Apparatus | GC100T-10 | 1 мм внешний диаметр, 0,78 мм внутренний диаметр. |
| Пуллер для микропипеток | Sutter Instruments | Flaming Brown Пуллер для микропипеток против | |
| антител Cag A | Santa Cruz | sc-25766 |
Ссылки
- Aiuto, L., et al. Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Models to Investigate Human Cytomegalovirus Infection in Neural Cells. PLoS ONE. 7 (11), e49700(2012).
- Penkert, R. R., Kalejta, R. F. Human Embryonic Stem Cell Lines....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
