Методическая статья

Шаг конкретных сортировка мыши сперматидах цитометрическим

DOI:

10.3791/53379

⸱

31 декабря 2015 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, Université de Sherbrooke, 2Department of Medicine, Université de Sherbrooke

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы описываем стратегию сортировки сперматид мышей с помощью проточной цитометрии. Сперматиды разделены на четыре высокочистые популяции, включая круглые (этапы спермиогенеза 1-9), раннюю элонгацию (стадии спермиогенеза 10-12), позднюю элонгацию (стадии спермиогенеза 13-14) и удлиненные сперматиды (стадии спермиогенеза 15-16). В качестве параметров отбора используются окрашивание ДНК, размер и зернистость.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Дифференцировка сперматидах мыши один важный процесс для производства функциональной мужской гаметы с интактным геном в который должен быть передан следующему поколению. Пока, молекулярные исследования этого морфологического перехода были затруднены из-за отсутствия метод, позволяющий достаточное разделение этих важных шагов сперматид дифференциации для последующих анализов. Ранее попытки правильного стробирования этих клеток с использованием проточной цитометрии, возможно, было трудно из-за своеобразного увеличению флуоресценции ДНК в сперматидах проходящих ремоделирование хроматина. Основываясь на этом наблюдении, мы предоставляем подробную информацию о простой проточной цитометрии схеме, что позволяет воспроизводимое очищение четырех популяций мыши сперматидах фиксированных этанолом, каждый из которых представляет различные состояния в процессе ядерного ремоделирования. Обогащение населения подтверждается с помощью ступенчатых конкретных маркеров и морфологических критерии. Очищенные Сперматиды могут быть использованы для геномных и протеомныеIC анализов.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Гаплоидные круглые сперматиды дифференцируются в сперматозоиды с помощью процесса, называемого спермиогенезом. Это включает в себя множество различных этапов, включая приобретение жгутика, ремоделирование хроматина и цитоскелета, конденсацию ядра, а также потерю большей части цитоплазмы. Эти уникальные клеточные события должны быть точно отрегулированы для того, чтобы получить зрелую функциональную гамету с неповрежденным геномом, пригодным для оплодотворения. Спермиогенез вряд ли может быть изучен in vitro, поскольку ни одна надежная система клеточных культур до сих пор не смогла поддержать прогрессирование на различных этапах процесса. Более того, актуальные методы in vitro приводят к плохому выходу1,2. В естественных условиях надлежащие переходы через различные этапы спермиогенеза имеют решающее значение для естественной функциональной целостности мужской гаметы. Успешная очистка сперматид в соответствии со стадиями их дифференцировки никогда не достигалась с уровнем обогащения, достаточным для молекулярной характеристики спермиогенеза. Например, очистка ключевых этапов дифференцировки сперматидов была бы особенно полезна для изучения развивающейся акросомы, формирования промежуточной части3, динамики клеточного соединения4, динамики РНК5, процесса ремоделирования хроматина6,7 или стабильности генома8. Очистка сперматид затрудняется их прогрессирующей морфологической трансформацией, отсутствием известных стадийно-специфичных внешних биомаркеров, а также их своеобразной формой и размером.

Хотя большинство мужских половых клеток демонстрируют прямую связь между окрашиванием ДНК и плоидностью (содержанием ДНК), мы заметили, что такая положительная корреляция больше не применима к сперматидам. Это связано с нашим ранним наблюдением, согласно которому срезы семенных канальцев демонстрируют переменную интенсивность окрашивания ДНК на различных этапах спермиогенеза. Несмотря на то, что окрашивание ДНК согласуется с их гаплоидным набором хромосом со стадий спермиогенеза с 1 по 7 (круглые сперматиды), мы наблюдали резкое увеличение интенсивности флуоресценции при использовании DAPI или SYTO 16 в начале ядерной реорганизации и ремоделирования хроматина (стадия спермиогенеза 8), достигая пика в начале ядерной конденсации (стадии спермиогенеза 11-12). После конденсации ядра интенсивность окрашивания ДНК снижается до спермиации (стадия спермиогенеза 16). Мы предположили, что это, вероятно, связано с формированием их своеобразной структуры хроматиновой структуры, при которой гистоны заменяются протаминами. Поэтому мы разработали надежный метод проточной цитометрии, который позволяет разделять сперматиды с использованием вариации интенсивности ДНК сперматид в качестве основного параметра отбора.

Описан простой подход проточной цитометрии для разделения сперматид мыши с высокой чистотой (95-100%) на основе их видимого содержания ДНК (окрашивание SYTO16), размера и зернистости. Сперматиды разделены на четыре популяции; Этапы спермиогенеза 1-9, 10-12, 13-14 и 15-16. Очищенные сперматиды подходят для генетического/геномного анализа, а также для протеомных применений, как описано в недавней публикации нашей группы9.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Уход за животными было в соответствии с ухода за животными и использование комитета Шербрукский университет.

1. Подготовка трубки

  1. За день до сортировки клеток, добавить 1-2 мл инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки (FBS) до 5 мл полипропиленовые с круглым дном труб и 15 мл и 50 мл конические пробирки из полипропилена.
    Критический шаг: Убедитесь, что каждый трубки используется в протоколе является покрытием.
    Примечание: ФБС покрытие предотвращает зародышевые клетки от прилипания к стенок трубки.
  2. Медленно перемешать O / N инверсией при 4 ° С для покрытия трубки равномерно с помощью поворотного устройства.
  3. На следующий день, удалить FBS из труб с покрытием путем декантации.
    1. * Критический шаг: Убедитесь, что в 5 мл полипропиленовые круглым дном трубы и трубки, используемые для клеточного препарата 15 и 50 мл (протокол шаги 2.1 до 2.11) полностью очищена от FBS, чтобы предотвратить раздувание (т.е. неточное отклонение боковых потоков). Используйте P200 пипетки, чтобы удалить FBS.
      Примечание: Остаточная ФБС в трубах до сортировки может привести к потере клеток или загрязнения других труб, используемых во время сортировки клеток,
    2. Оставьте небольшой остаточный объем FBS (100-200 мкл) в полипропилена 5 мл с круглым дном и труб, используемых для сбора очищенных клеток.

2. Подготовка сотового

  1. Жертвоприношение один мужчина мышь под наркозом с помощью O 2 / изофлуран (индукция в 5%, то поддерживается на уровне 2%), а затем СО 2 удушья.
  2. Акциз и decapsulate оба яички и пропустить через мясорубку с маленькими ножницами в 500 мкл буфера сортировки в 1,5 мл трубки.
  3. Флеш зародышевые клетки семенных канальцев по нежным вверх и вниз пипеткой в ​​1,5 мл трубки, впервые с усеченной 100-1000 мкл кончика, а затем с неповрежденной наконечником 100-1000 мкл.
  4. Удалите мусор и комья по шаге фильтрации с использованием фильтр 40 мкм клеток и собрать фильтрат в 50 мл конических труб предiously покрыты FBS в шаге 1.
  5. Промойте фильтр один раз с сортировкой буфер до общего объема 3 мл и передачи фильтрата в 15 мл коническую трубку, ранее покрытой в шаге 1.
  6. Добавить 16 мкл 50 мМ ЭДТА, рН 8 на миллилитр суспензии клеток (48 мкл в течение 3 мл), чтобы получить конечную концентрацию 0,8 мМ ЭДТА.
  7. Чтобы исправить зародышевые клетки, постепенно добавить 3 объема ледяной 100% этанола с помощью 10 мл пипетки при осторожном перемешивании (вихревую при низкой скорости), который будет производить молочный подвески.
    Критический шаг: Медленно добавлением этанола важно и важно сохранить целостность клеточного препарата. Мы отметили, что быстрое добавление этанола вызывает лизис клеток в результате крупного снижения сортировки эффективности. Для 3 мл клеточной суспензии, должны быть добавлены 9 мл этанола примерно 1 мин.
  8. Инкубируйте клетки на льду в течение 15 мин с периодическим перемешиванием инверсией.
  9. Центрифуга клеточной суспензии при 800 мкг в течение 5 мин и снять ясносупернатант.
  10. Аккуратно ресуспендирования фиксированные половых клеток в 2 мл буфера сортировки.
  11. Добавьте 4 мкл красителя SYTO16 ДНК (1 мМ раствора в ДМСО) и инкубировать в течение не менее 30 мин (в защищенном от света).
    Примечание: Лучшие сортировки результаты получаются при использовании SYTO16, так как это проницаемой краситель ДНК, который легко включены в очень уплотненных ядер сперматидах.

3. Клеточный сортер Настройка

Примечание: Здесь, 4-Laser (405 нм - фиолетовый, 488 нм - синий, 561 нм - желто-зеленый, 633 нм - красный) 20-параметр BDFACSAria III клеток сортировщик используется. 6.1.3 Программное обеспечение BD FACSDiva используется для визуализации и анализа данных. Параметры могут различаться в зависимости от типа используемого сортировщика.

  1. Стерилизовать сортировщик FACS, запустив 70% этанола в качестве оболочки жидкости во время процедуры струйная отключения (меню "Цитометр" в программном обеспечении) до сортировки. Выберите "цитометром" на панели инструментов программного обеспечения и выберите "жидкостный шutdown ". Следуйте инструкциям, упомянутые процессы.
  2. Подготовка и фильтровать 1X PBS с 0,22 мкм фильтр таким образом, чтобы устранить любые кристаллы и примеси. Заполните оболочки бака к верхней линии шва на внутренней стороне резервуара.
  3. Запустите программу и войти. Запустите сортировщик FACS, чтобы согреться лазеров, по крайней мере 30 мин до сортировки. Запустите два жидкостных процессов запуска, чтобы спугнуть этанола из струйной. Выберите "цитометром" на панели инструментов программного обеспечения и выберите "текучей" запуск. Следуйте инструкциям, упомянутые процессы.
    Примечание: Эта восстанавливает струйной оболочки с нормальной жидкости (1x PBS).
  4. Очистите блок сортировки и отклоняющие пластины с дистиллированной водой и высушите их полностью. Разрушать ультразвуком сопло 100 мкм, помещенный в трубку дистиллированной воды в течение 2 мин в ультразвуковой в ванне. Протрите сопла тщательно.
  5. Вставьте сопло 100 мкм в проточную кювету и повернуть насадку-фиксирующий рычаг по часовой стрелке в 12Положение ч. Установите давление оболочка 20 фунтов на квадратный дюйм в.
  6. Включите потока и регулировки амплитуды, чтобы получить целевые значения для частоты (около 30), падение 1 (около 150) и Gap (около 12) и создать стабильную капель отрыва шаблон (несколько капель спутниковое). Выключите ослабление.
  7. Убедитесь, что поток прямо и попадает в центр аспиратора отходов путем изменения угла сортировки блока. Примечание: Насадка 130 мкм в 10 фунтов на квадратный дюйм также была протестирована и не очевидная разница не было найдено.
  8. Установите лазер задержка 0 для синего, -77.39 на красный, 37.33 для фиолетового и -39.85 для желто-зеленых лазеров.
  9. Установить области масштабирования до 1,14 для синего, 1,0 для красного, 0,75 для фиолетовых и 0,96 для желто-зеленых лазеров.
  10. Использование теста Сортировать (в окне "Сторона поток" программного обеспечения), чтобы убедиться, что боковые потоки не раздувая. В окне "Сторона поток", отрегулируйте ползунки напряжения каждого бокового потока, так что они попали в middlе сбора пробирку. Если центр поток не плотно, отрегулировать 2-й, 3-й и 4-й параметры, чтобы ограничить падение центральную поток.
  11. Начните цитометра настройки и применения слежения (CS & T) в программном обеспечении (меню "Цитометр").
  12. Используйте цитометра настройки и слежения бусы на 1 капле на 350 мкл для автоматизации характеристика и отслеживание цитометра производительности, используя инструкции производителя.
  13. Выйти из программы CS & T. Применить настройки CS & T, убедитесь, что параметры потока по-прежнему позволяют стабильный паттерн капель отрыва, и включите кнопку Sweet Spot, как описано в инструкции производителя (в "окне" отрыва).
  14. Оптимизация стоимости падение задержки, используя флуоресцентные шарики (см таблицу материалов).
    1. Установите трубки сбора в держателе. Откройте рода блок дверь. В окне "Сторона поток», включите напряжения, затем выберите "Тест рода "и нажмите кнопку Аспиратор ящика, чтобы открыть ящик и иметь доступ к трубам сбора.
    2. Оптимизация боковые потоки, чтобы они идут в центре трубки. Отрегулируйте значения ползунков и по мере необходимости.
    3. Закройте дверь блока сортировки и убедитесь, что для регулировки микрометра диск, чтобы получить яркий шарик место в центре. Очистить отходов ящик, тест вроде и напряжения. Удалить труб сбора.
    4. Оптимизация задержки падение в соответствии с инструкциями производителя.
      1. Вкратце, пожать шарик флакон энергично и развести 1 каплю бисера в 0,5 мл PBS.
      2. Использование инструкции производителей, установить задержку падение, используя шаблон эксперимента падения задержки, доступные в программе. В качестве альтернативы, используйте функцию автоматического задержки падения установить задержку падение.
      3. Загрузите трубку флуоресцентных бисером и регулировать расход до пороговой скорости не ~ 3000 до 4000 событий / сек. Установите точность сортировки "Первоначальный" и последнийLY, чтобы "Точная настройка" в окне "Сортировать макета". Выберите оптический фильтр и сортировать шарики. Отрегулируйте задержку падения до ~ 100% не сортируются влево.
        Примечание: Этот шаг является критическим, чтобы убедиться, что клетки процентной рода в виде бокового потока. Шарики и оптический фильтр используется для достижения близко к отклонению капель 100%.
  15. Поставьте FSC 1.5 нейтрального (ND) фильтр в левой части детектора FSC блока. Установите расширение окна до 2,00 мкс и масштабирование FSC площадь в 1,00 (на вкладке "Лазер" в окне "цитометром").
  16. Перед загрузкой пробирку, Поместите образец фильтра линию 50 мкм в конце линии пробы, чтобы избежать образования комков. Чтобы сделать это, выберите "Изменить Образец фильтр" в меню "цитометром".
  17. Испытание состава пробы жидкости, чтобы достичь хорошего разделения, не раздувают между бокового потока и предотвратить клетки от прилипания к Полипропилепе трубы.
    1. Загрузите пробирку, включите отклоняющих пластин и выберите "Test-то" с выдвижной ящик закрыт. Посмотрите на боковых потоков, если разделение происходит не слишком много Фаннинг.
      Примечание: Раздувание вероятно из-за высокой концентрации белка в буфере выборок.
  18. Загрузка пробирку в прибор FACS. Выберите образец перемешивание 300 об и температуре образца 4 ° С. Выберите "Получение данных" в "Приобретение панели".
  19. При необходимости, разбавить образец, чтобы достичь соответствующей скорости событии, не более 5000 событий / сек (при максимальной скорости потока 3,0). Строго соблюдать эти пределы с тем, чтобы поддерживать чистоту отсортированных клеток.
  20. Для анализа и сортировки клеток, оптимизировать пороговое значение FSC устранить мусор, не мешая населения интерес. В логарифмической шкале, отрегулируйте напряжение фото-мультипликатор (ФЭУ) детектор с фильтром 530/30 для того, чтобы сделатьУбедитесь, что сигнал флуоресценции от общей численности населения вписывается в масштабе, и ворота на положительной популяции (рис 1, ворота 1).
  21. Произведите рассеяния вперед-зону (FSC-A) / бокового рассеяния-зоны (SSC-А) сюжет SYTO16 положительного населения и регулировать FSC-A около 110 В в линейном масштабе, а SSC-А около 150 V в логарифмической шкале, чтобы визуализировать все события, исключая очень крупные клетки и клеточных агрегатов.
  22. В окне "Layout" Сортировать установите "режим сортировки Precision" на "4-полосная чистота" (Выход маска: 0, чистота Маска: 32 Фаза Маска: 0). Выберите "Непрерывный" в меню "События" Целевые непрерывного сортировки.
  23. Добавить населения для сортировки в области, соответствующей труб (в окне "Layout" Сортировать). Место населения с более высокими частотами в середине и с более низкими частотами на концах. Установите пластины напряжения до 2500 В. При сортировке, держать сбора образец Тмассовые рассылки по льду.

4. Сотовый Сортировка

  1. Непосредственно перед сортировка, клетки фильтр, использующий фильтр 50 мкм в ранее покрытой 5 мл полипропилен круглый нижний трубку.
  2. Промойте фильтр широко 1-2 мл буфера сортировки.
  3. Сортировать неподвижные половые клетки, используя 488 нм лазерный оборудованный сортировщик клеток следующую схему стробирования, изображенной на рисунке 1. Соберите очищенные фракции в 5 мл полипропиленовые пробирки с круглым дном, предварительно покрытые в разделе 1 на льду.
    1. Убедитесь, что 100-200 мкл FBS хранится в трубах, чтобы избежать сбора налипание отсортированных клеток в стенке трубы.
    2. Убедитесь, что концентрация SYTO16 насыщается, чтобы избежать колебания флуоресценции во время сортировки периода. SYTO16 насыщается, когда нет еще вариация интенсивности окрашивания клеток на 488 параметров (окрашивания ДНК) Alexa Fluor сортировочных графики. Если необходимо, добавьте 1 мклSYTO16 в сортировочный трубки для достижения насыщения.
    3. Отображает общее события на графическом отображаются следующие параметры: количество событий VS Alexa Fluor 488-A.
    4. Выберите положительное окрашивание ДНК клетки ворота 1, как показано на рисунке 1.
      1. Показать клетки ворот 1 на графике с использованием SSC-A против FSC-A в качестве параметров
        1. Выделите ячейки с Gate 2, как показано на рисунке 1.
        2. Показать клетки от ворот 2 на графике с использованием FSC-A против Alexa Fluor 488-А в качестве параметров.
        3. Выберите ячейки с воротами 5 и 6 на ворота Ворота 2 графика, как показано на рисунке 1.
        4. Дисплей отдельно ворота 5 и 6 на ворота графики с использованием Alexa Fluor 488-W против Alexa Fluor 488-А в качестве параметров.
        5. Выберите спермиогенез шаги 1-9 сперматид на графическом ворота 5 и спермиогенез шаги 10-12 сперматид на воротах 6 графики, как показано на рисунке 1.
      2. Дисплейклетки из ворот 1 на графике с использованием FSC-A против Alexa Fluor 488-А в качестве параметров
        1. Выберите ячейки с ворот 3 и 4 ворот, как показано на рисунке 1.
        2. Дисплей отдельно ворота 3 и 4 ворот на графики с использованием Alexa Fluor 488-W против Alexa Fluor 488-А в качестве параметров.
        3. Выберите спермиогенез шаги 13-14 сперматид на ворота 3 графических и спермиогенез шаги 15-16 сперматид на ворота 4 графика, как показано на рисунке 1.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Стратегия Память используется с проточной цитометрии

Рисунок 1 представляет собой стратегию стробирования используется в проточной цитометрии для сортировки четыре высокой чистоты популяции сперматид. Вкратце, клетки с окрашиванием положительной ДНК (Alexa Fluor 488-А) сначала выбирается ворота 1. сперматидах от сперматогенеза шаги 1-12 выбранной (Gate 2) на точечной график, показывающий зернистости (SSC-A) от...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Сперматогенного клетки всегда был сложным для изучения, учитывая сложность семенных эпителия, а также ограниченный успех культуры в пробирке. На протяжении многих лет, многие методы, чтобы очистить разработаны зародышевые клетки из различных видов. Методы очистки с использованием седиментационных гравитации с перколлом или бычьим альбумином сыворотки градиентов обычно обеспечивают хороший выход интактных клеток зародышевых, но не имеют соответствующего определения между некоторыми типами клеток, таких как мейоз...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы хотели бы поблагодарить д-ра Леонид Волков и Эрик Бушар их технической консультации по эпифлуоресцентной микроскопии.

Финансовая поддержка

Финансируемого Канадским институтом медицинских исследований (грант № СС-93781) в ГБ

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
ИзофлуранABBOT05260-05Для обезболивания мышей перед эвтаназией
Фетальная бычья сывороткаWisent90150Для покрытия пробирки
1x PBS
EDTABioShopEDTДля сортировки буферного препарата
HEPESSigmaHДля сортировки буферного препарата
100% ЭтанолLes alcools de commerce092-09-11NДля фиксации клеток
SYTO 16Life TechnologiesS7578Окрашивание ДНК
5 мл полипропиленовые круглые донные трубкиBD Falcon352063Коллекция отсортированных клеток
15 мл полипропиленовые конические донные пробиркиPROgene1500
50 мл полипропиленовые конические донные трубкиPROgene5000
Испаритель для анестетика TEC4Ohmeda1160526Для эвтаназии мышей
CO2 газовый баллонPraxairC799117902Для эвтаназии мышей
O2 газовый баллонPraxairO254130501Для мышиной эвтаназии
Самодельная мышиная газовая камераДля мышиной эвтаназии
40 &; m Сетчатый фильтрFalcon Cell Corning Incorporated352340
50 μ m фильтры линии пробBD Biosciences649049
смеситель VortexLabnet international, inc.S0200Для фиксации клеток
Динакская центрифугаClay Adams101
Celltrics 50 µ m фильтрыPartec04-004-2327
488 нм лазерно-электронный сортировщик клетокBD BiosciencesFACSAria III
Accudop Флуоресцентные шарикиBD Biosciences345249
Буфер для сортировки: 1x PBS, 1 мМ EDTA pH 8,0, 25 мМ HEPES pH 7,0, 1% FBSFBS термоинактивированный. Приготовьте свежий раствор, 0,22 μ m фильтруют и держат при температуре 4°C.

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sato, T., et al. In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes. Nature. 471 (7339), 504-507 (2011).
  2. Sato, T., et al. In vitro production of fertile sperm from murine spermatogonial stem cell lines. Nat. Commun. 2, 472(2011).
  3. Sun, X., Kovacs, T., Hu, Y. -J., Yang, W. -X. The role of actin and myosin during spermatogenesis. Mol. Biol. Rep. 38 (6), 3993-4001 (2011).
  4. Cheng, C. Y., Mruk, D. D. Cell junction dynamics in the testis: Sertoli-germ cell interactions and male contraceptive development. Physiol. Rev. 82, 825-874 (2002).
  5. Laiho, A., Kotaja, N., Gyenesei, A., Sironen, A. Transcriptome profiling of the murine testis during the first wave of spermatogenesis. PLoS ONE. 8 (4), (2013).
  6. Leduc, F., Maquennehan, V., Nkoma, G. B., Boissonneault, G. DNA damage response during chromatin remodeling in elongating spermatids of mice. Biol. Reprod. 78 (2), 324-332 (2008).
  7. Meistrich, M. L., Mohapatra, B., Shirley, C. R., Zhao, M. Roles of transition nuclear proteins in spermiogenesis. Chromosoma. 111 (8), 483-488 (2003).
  8. Grégoire, M. -C., et al. Male-driven de novo mutations in haploid germ cells. Mol. Hum. Reprod. 19 (8), 495-499 (2013).
  9. Simard, O., et al. Instability of trinucleotidic repeats during chromatin remodeling in spermatids. Hum. Mutat. , (2014).
  10. Wykes, S. M., Krawetz, S. Separation of spermatogenic cells from adult transgenic mouse testes using unit-gravity sedimentation. Mol. Biotechnol. 25 (2), 131-138 (2003).
  11. Yoshida, S., et al. The first round of mouse spermatogenesis is a distinctive program that lacks the self-renewing spermatogonia stage. Development (Cambridge, England). 133 (8), 1495-1505 (2006).
  12. Moreno, R. D., Lizama, C., Urzúa, N., Vergara, S. P., Reyes, J. G. Caspase activation throughout the first wave of spermatogenesis in the rat. Cell Tissue Res. 325 (3), 533-540 (2006).
  13. Meistrich, M. L., Trostle-Weige, P. K., Van Beek, M. E. Separation of specific stages of spermatids from vitamin A-synchronized rat testes for assessment of nucleoprotein changes during spermiogenesis. Biol. Reprod. 51 (2), 334-344 (1994).
  14. van Pelt, A. M., de Rooij, D. G. Synchronization of the seminiferous epithelium after vitamin A replacement in vitamin A-deficient mice. Biol. Reprod. 43, 363-367 (1990).
  15. Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. J. Flow cytometry purification of mouse meiotic cells. J. Vis. Exp. , (2011).
  16. Kovtun, I. V., McMurray, C. T. Trinucleotide expansion in haploid germ cells by gap repair. Nature Genet. 27 (4), 407-411 (2001).
  17. Bastos, H., et al. Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis. Cytometry A. 65 (1), 40-49 (2005).
  18. Lassalle, B., Ziyyat, A., Testart, J., Finaz, C., Lefèvre, A. Flow cytometric method to isolate round spermatids from mouse testis. Hum. Reprod. 14 (2), 388-394 (1999).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Alexa Fluor 488

Похожие статьи