Методическая статья

Поколение и культура крови вырост эндотелиальных клеток из периферической крови человека

20K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/53384

⸱

23 декабря 2015 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, University of Cambridge, 2Papworth Hospital

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол позволяет надежно генерировать и характеризовать эндотелиальные клетки роста крови (BOEC) из небольшого объема периферической крови взрослого человека. BOEC могут быть использованы в качестве суррогата эндотелиальных клеток пациентов с сосудистыми нарушениями и в качестве субстрата для генерации индуцированных плюрипотентных стволовых клеток.

Аннотация

Исторически сложилось так, что ограниченная доступность первичных эндотелиальных клеток у пациентов с сосудистыми нарушениями препятствовала изучению молекулярных механизмов, лежащих в основе эндотелиальной дисфункции у этих людей. Тем не менее, недавняя идентификация эндотелиальных клеток кровообращения (BOEC), полученных из циркулирующих эндотелиальных предшественников в периферической крови взрослого человека, может обойти это ограничение, предлагая эндотелиальноподобный, первичный клеточный суррогат для эндотелиальных клеток, полученных от пациента. Помимо их ценности для понимания биологии эндотелия и моделирования заболеваний, BOEC имеют потенциальное применение в терапии трансплантации эндотелиальных клеток. Они также являются подходящим клеточным субстратом для генерации индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) путем ядерного перепрограммирования, предлагая ряд преимуществ по сравнению с другими типами клеток. Мы описываем метод надежного получения, культивирования и определения характеристик BOEC из периферической крови взрослого человека для использования в этих и других приложениях. Этот подход (i) позволяет генерировать эндотелиальные клетки, специфичные для пациента, из относительно небольшого объема периферической крови взрослого человека и (ii) производит клетки, которые очень похожи на первичные эндотелиальные клетки по морфологии, клеточной сигнализации и экспрессии генов.

Введение

До недавнего времени, послеродовой поколение новых кровеносных сосудов считалось происходить исключительно через процесс, известный как ангиогенез, определяется как прорастание новых сосудов из эндотелиальных клеток уже существующих сосудов. 1 Этот процесс контрастирует с васкулогенеза или де Ново образование кровеносных сосудов из эндотелиальных клеток-предшественников, которые, как считалось, происходит исключительно в процессе эмбриогенеза. 2 Тем не менее, более поздние исследования идентифицировали и выделили циркулирующие эндотелиальные клетки-предшественники (ЕРС) в периферической крови взрослых. Эти клетки обладают способностью дифференцироваться в зрелые эндотелиальные клетки в культуре и, как полагают, участвуют в послеродовой васкулогенеза. 3,4

Протоколы для изоляции и расширения этих ЕРС обычно включают культуру мононуклеарных клеток периферической крови (PBMNCs) в среде, содержащей эндотелиальные факторы роста, в том числе vasculAR-эндотелиальный фактор роста (VEGF) и фактор роста фибробластов-2. 5-8 культуры EPC производить различные резко различных типов клеток. Исходные культуры (<7 дней) преобладают моноцитов типа клеток, известной в литературе как "ранних" ЕРС. Несмотря на свое название, эти клетки выразить моноцитов маркер CD14, отрицательные для маркера предшественников CD34 и выразить только минимальные уровни классической маркеров эндотелиальной CD31 и VEGF рецептора 2 (VEGFR2). 5 Продолжение культура порождает вторичный популяции клеток, известный как вырост конце ЕРС или вырост крови эндотелиальных клеток (BOECs), которые появляются, как сдержанный колонии эндотелиальных клеток, как. В отличие от ранних моноцитарных ЕРС, BOECs, которые также называют эндотелиальные колониеобразующих клеток (ECFCs), эндотелиальные клетки вырост или поздно вырост эндотелиальные клетки, проявляют морфологию булыжника, что характерно для эндотелиальных клеток монослоя и очень похожи на поверхности маркера5 и экспрессия генов 9, чтобы созреть эндотелиальные клетки.

Генерирование эндотелиальных-подобных клеток из периферической крови имеет ряд преимуществ, в частности, для изучения дисфункции эндотелиальных клеток, связанного с сосудистыми расстройствами, такими как легочной артериальной гипертензии (ЛАГ) 10 или болезнью Виллебранда. 11 До наличия BOECs, эндотелиальной клетки могут быть получены только из эксплантированных органов на момент смерти или трансплантации органов или изолированные от пупочной вены при рождении. Это снижение доступности представляет собой серьезное ограничение с пониманием биологии эндотелиальных клеток у пациентов с сердечно-сосудистыми расстройствами, а также взаимодействия между эндотелиальными клетками и клетками крови либо или настенной клеток. Кроме того, выделение и культивирование чистую популяцию клеток эндотелия из этих источников является технически сложным и клетки, полученные с помощью этих методов обладают лишь Limiteд пролиферативный потенциал. Поэтому BOECs предложить ценный суррогат для изоляции и культуры первичных клеток пациента эндотелиальных происхождение.

В дополнение к их применения в пробирке, BOECs также являются потенциально полезными в аутологичных клеток трансплантации терапии. Эти приложения включают в себя как трансплантация клеток эндотелия для продвижения новых сосудов (см 12 и ссылки в нем), а также генерацию индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК). 13 BOEC-полученные иПСК могут быть использованы для моделирования заболеваний и предлагают огромный потенциал в качестве исходного Материал для аутологичных клеток терапии. BOECs перепрограммировать быстрее и с большей эффективностью, чем фибробластов кожи. Кроме того, BOECs также позволит для генерации ИПСК, которые свободны от КАРИОТИПИЧЕСКУЮ аномалий, который является неотъемлемой чертой любой технологии, которая подойдет для трансляционных приложений. Способность генерировать ИПСК из образца крови пациента аLSO устраняет необходимость в биопсии кожи и образование фибробластов кожи, тем самым облегчая генерацию клеток от пациентов с заживлением ран расстройств, или очень молодые.

Протокол подробно ниже, утвержденным и проводится в соответствии с руководящими принципами Национального комитета по этике научных исследований службе (Восточная Англия), обеспечивает простой и надежный способ для генерации BOECs с более чем 90% эффективности от относительно небольшого объема (60 мл) периферической крови. Эти клетки обладают высокой пролиферативной и может быть повторно пересевают, позволяя для генерации сотни миллионов клеток из одной пробы крови.

Протокол

Схема протокола BOEC поколения показана на рисунке 1.

1. Кровь Сбор и центрифугирования в градиенте плотности

  1. Для каждого донора, добавить 3 мл раствора цитрата натрия к каждому из двух конических 50 мл центрифужные пробирки. Сбор 60 мл крови из вены и добавить 30 мл в каждую пробирку. Обратить мягко 2-3 раза перемешать. Используйте как 40 мл крови в протоколе, с объемами цитрат соответствующим образом скорректированы.
    Примечание: Очень важно, чтобы образцы крови обрабатываются в течение 2 ч сбора. Задержка обработки результатов крови в существенному сокращению в вырост выход колоний.
  2. Подготовка новых конические пробирки, содержащие центрифугирования в градиенте плотности среды сначала перевернув бутыль несколько раз перемешать. В стерильных капот, добавьте 15 мл центрифугированием в градиенте плотности среды в 50 мл коническую пробирку (трубку 1 на каждые 10 мл крови, 6 труб в донора).
  3. Развести крови 1: 1 с фосфатом Дульбекко-Buffered Соленая (DPBS). Наклоните пробирку, содержащую центрифугирования в градиенте плотности среды до угла 20 ° с рабочей поверхности. Использование помощи пипетки и 25 мл серологической пипеткой медленно слой 21 мл разбавленной крови в верхней части среды, постепенно добавляя кровь вниз к стенке трубки наклонной.
    Примечание: Это позволит свести к минимуму перемешивание крови с градиентом плотности слоя и будет производить более плотное поглощающее покрытие, а также улучшенную выход.
  4. Центрифуга образцов при 400 мкг в течение 35 мин при комнатной температуре с ускорителем и вынул.
  5. В течение этого периода центрифугирования, начать коллагена покрытие, описанную в шагах 2.1 - 2.4. Убедитесь, эти шаги были завершены, прежде чем приступить к шагу 3.1.

2. Коллаген Покрытие Т-75 колбу и подготовки питательной среды

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните следующие шаги в капот культуре клеток.

  1. Подготовка 50 мкг / мл раствора коллагена путем разбавления акции Tyре коллагена в 10 мл 0,02М уксусной кислоты. Пример: для коллагена складе в концентрации 4,05 мг / мл, добавляют 123,5 мкл коллагена 10 мл 0,02 М уксусной кислоты. Стерильный фильтр коллагена подвески перед использованием.
  2. Использование серологических пипетки, добавьте 7,5 мл раствора коллагена в культуре клеток колбу Т-75. Этот объем дает 5 мкг коллагена / см 2 (или 375 мкг / колбу). Шерсть колбу в течение 1 часа при комнатной температуре.
  3. Подготовка эндотелиальных среду роста, используемый для BOEC поколения, дополняя эндотелия базальной среды дополнений фактора роста, предоставляемых производителем. Добавить все добавки, но не добавлять сыворотку. Для приготовления 15 мл среды BOEC поколения, добавить 2,5 мл определенного фетальной бычьей сыворотки (FBS) до 12,5 мл эндотелиальных среды роста, содержащей добавки фактора роста.
  4. Продолжайте действия, описанные в разделе 3. После периода покрытия 1 час, аспирации раствора коллагена и смыть остаточных уксусной кислоты с помощью пипеткив 10 мл DPBS. Аспирируйте от DPBS и повторить этот шаг мыть еще раз. Если полученной клеточной суспензии во время этапа 3.3 не готов для посева в это время, добавьте 5 мл среды BOEC поколения в колбу, чтобы сохранить коллагена покрытие от высыхания.

3. Сбор и покрытие из PBMNCs

  1. После центрифугирования в градиенте плотности указано в пункте 1.4, тщательно собрать Баффи пальто слой, используя стерильный пластиковый пипетки передачи. Сбор и светлый сгусток должен давать примерно 20 мл суспензии клеток и плазмы из каждой пробирки. Избегайте передачи градиента плотности среды.
  2. Развести подвеску мононуклеарных клеток 1: 1 в DPBS и инвертировать перемешать. Центрифуга при комнатной температуре в течение 20 мин при 300 х г с тормозом и ускорителем на максимум.
  3. После центрифугирования, аспирация супернатант и ресуспендирования клеток путем добавления 1 мл среды BOEC поколения на каждую гранулу и пипетки вверх и вниз несколько раз. Бассейн клеточные суспензиид долить общий объем до 10 мл с оставшейся среде.
  4. Чтобы получить оценку общего числа клеток, образец 10 мкл клеточной суспензии и разбавленной 50x с 490 мкл раствора Турка, которые будут лизировать красные кровяные клетки. Граф 10 мкл образца разведенной суспензии клеток с использованием гемоцитометра.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 60 мл крови должно дать около 100-150 х 10 6 белых кровяных клеток для обшивки.
  5. Пластина подвески все клетки в единую коллагена покрытием Т-75 колбу, пополнить объем среды 15 мл, чтобы / колбу и культуры при 37 ° С в увлажненной атмосфере, содержащей 5% CO 2. Клетки высевали в это время представляют проход 0.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Можно заморозить изолированных PBMNCs до BOEC изоляции для того, чтобы вывести на BOECs на более позднее время или для того, чтобы транспортировать PBMNCs в другой лаборатории, где BOECs могут быть сформированы. Тем не менее, важно отметить, что замораживание может PBMNCs снижают эффективность изоляции BOEC. SEE раздел 8 ниже способом.

4. Долгосрочное Культура клеток

  1. Изменение средней каждые 2 дня, добавив 15 мл свежей среды BOEC поколения (5: 1 смеси эндотелиальной среде для роста клеток и определили FBS). Для выходных, средние изменения может быть отложено на каждые 3 дня.
    ПРИМЕЧАНИЕ: вырост колонии должны появиться между 7 и 14 дней культуры.
  2. Монитор BOEC культуральной колбы на 7-14 дней для появления вырост колоний. Определить колонии в виде круговых групп клеток, проявляющих классический эндотелия булыжника морфологию.
  3. После того, как колонии или несколько колонии идентифицировали в колбе, продолжают со средними изменений и позволить расти колонии примерно 1000 до 2000 клеток на колонии, прежде чем пассирования. Определить количество клеток на колонию через грубой визуальной оценки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве руководства, это общепринято, чтобы прохода начальных колоний вырост одну неделю после идентификации первого вырост колонии.
  4. смешанные клетки путем промывки колбы дважды 10 мл DPBS. Добавляют 5 мл 1X трипсина-ЭДТА и инкубировать в 37 ° C инкубаторе в течение 5 мин. Через 5 мин, нейтрализуют трипсин с 10 мл среды (содержащей FBS) и довести клеток в суспензии с повторным пипетированием.
  5. Центрифуга суспензии при 300 мкг в течение 5 мин, ресуспендируют в 15 мл свежей среды BOEC поколения и пластины весь клеточной суспензии в новый Т-75 колбу (представляющего прохода 1, P1). Нет коллагена покрытие не требуется.
  6. Продолжить среднего изменения, как описано выше, пока клетки не сливающихся (примерно 3-5 × 10 6 клеток на колбу). После сли ни, клетки проход, как описано в шаге 4.3.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Из прохода 2 года, клетки больше не требуется среду BOEC поколения и может культивироваться в эндотелиальных клеток ростовой среды и 10% стандартной инактивированной нагреванием FBS. Коллаген покрытие может быть использован в качестве необязательный шаг идти вперед, так как есть основания полагать, что наличие коллагена может повысить BOEC proliferAtion ставки.
  7. Для дальнейшего пассирования, плиты не менее чем 750000 клеток на Т-75 колбу, как плотность низкая клеток могут привести к BOECs, чтобы остановить пролиферирующих.

5. Замораживание и оттаивание BOEC Культуры

  1. Trypsinize клетки, как описано в разделе 4.3 и центрифуге при 300 мкг в течение 5 мин. Аспирируйте супернатант и ресуспендируют в 10 мл среды. Это не требует эндотелиальных клеток ростовой среды; DMEM с 10% FBS стандартных будет достаточно. Сбор 10 мкл образца суспензии клеток, чтобы выполнить вручную количества клеток с помощью гемоцитометра.
  2. Центрифуга снова ресуспендируют в и 2х10 6 клеток / мл в охлажденном льдом криоконсервации среды (40% DMEM с 50% FBS и 10% ДМСО). Добавить 0,5 мл (10 6 клеток) в каждом флаконе, место флаконы в ледяной холод изопропанол криоконсервации судна и места в -80 ° C морозильник по крайней мере 2 часа прежде, чем перейти к жидким азотом. Не оставить клетки при -80 ° С в течение более 24 часов.
  3. Для таять клетки, добавить 10 мл подогретого среды в 15 мл коническую центрифужную пробирку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При оттаивать Прохождение 1 клеток, оттепель в эндотелиальных клеток ростовой среды, дополненной 20% FBS, определенной в течение первых 2 дней после оттаивания. Это приводит к изоляции более стабильной клеточной идти вперед.
  4. Удалите клетки от жидкого азота и оттепели в 37 ° C бане воды с перемешиванием до тех пор, нежной лишь небольшое кристаллов льда осталось во флаконе. Добавить содержимое флакона по каплям к конической центрифужную пробирку и спин вниз в 300 мкг в течение 5 мин.
  5. Аспирируйте супернатант и осадок ресуспендируют клеток в 10 мл EGM-2 мВ + 10% FBS. Добавить в Т-75 колбу и пополнить среды до 15 мл.

6. Характеристика BOECs с помощью проточной цитометрии

  1. После того, как BOEC колонии, описанные в разделе 4 было разрешено расширить, Trypsinize клетки, как описано в разделе 4.4 и ресуспендируют при концентрации 10 6 клеток на мл в буфере окрашивания (DPBS остроумиеч 2% FBS и 2 мМ ЭДТА).
  2. Комбинат 10 5 клеток флуорохромом конъюгированного антител, направленных против CD45, CD14, CD34, CD31 (использовать все в 1:20 разбавления) или VEGFR2 (разбавить 1:10) (см таблицу 1 для получения подробной информации). Инкубировать в течение 30 мин при 4 ° С в темноте.
  3. Промыть клетки с 1 мл окрашивающего буфера и центрифуге при 300 х г в течение 5 мин. Аспирируйте супернатант и ресуспендируют в 400 мкл буфера для окрашивания для анализа. Сохранить клетки при 4 ° С в защищенном от света перед анализом.
  4. Выполнение цитометрии анализ на цитометр возможности для выявления флуоресцентно конъюгированных антител, используемых в анализе.
  5. Использование неокрашенной BOEC образец для идентификации клеточной популяции на цитометр, регулируя вперед и боковое рассеивание напряжений, а также напряжения для каналов FITC и APC.
  6. Определить стробирования пороги, используя изотипа окрашенных клеток для каждого флуорохромом. Оценка позитивности для каждого маркера клеточной поверхности на основе presencе пиковой сдвига в интенсивности флуоресценции по сравнению с контролем изотипа для флуорохромом анализируются.

7. Характеристика BOECs по иммунофлуоресцентных микроскопии

  1. Пластинчатые BOECs в 24-а, плоским дном планшета для культуры ткани без покровных при плотности 5 х 10 4 клеток в 500 мкл эндотелия среде роста клеток + 10% тепла инактивированной ФБС на лунку и оставить придерживаться и расти при 37 ° С, 5% СО 2 до клеток охватывать по крайней мере 70-80% площади поверхности каждой лунки (оценка слияния путем визуального осмотра под световым microsope).
  2. Вымойте клеток в каждой лунке в течение 5 мин с 1 мл DPBS.
  3. Исправление клетки O / N при 4 ° С с 500 мкл 4% -ного раствора параформальдегида в DPBS.
  4. Промыть клетки в течение 3 х 5 мин с 1 мл на лунку DPBS. Добавить и удалить DPBS помощью пипетки и аспиратор, соответственно.
  5. Проницаемыми клеток для 3 х 10 мин с 0,2% полисорбата 20 в DPBS.
  6. Инкубируйте клетки в течение 1 часа при комнатной температуре в блокирующем буфере, содержащем 10% FBS в DPBS.
  7. Пятно клетки при 4 ° CO / N в 300 мкл буфера для разведения антител (0,1% бычьим сывороточным альбумином в DPBS), содержащей первичные антитела, направленные против CD34 (10 мкг / мл), CD144 (1: 300) или фактора Виллебранда (1: 250) , В таблице 1 для получения полной информации.
  8. Смыть несвязанных первичных антител в течение 5 х 10 мин с DPBS.
  9. Инкубируйте клетки в течение 1 часа при комнатной температуре с соответствующим флуоресцентно-меченного вторичного антитела, как указано в таблице 1 (все в 1: 200).
  10. Смыть несвязанных вторичных антител в течение 5 х 10 мин с DPBS.
  11. Инкубируйте клетки с 1 мкг / мл 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) в DPBS в течение 10 мин при комнатной температуре.
  12. Промыть клетки с DPBS в течение еще 3 мин х 5.
  13. Клетки изображение в 100-кратном увеличении, используя инвертированный микроскоп оснащен внешним источником света для возбуждения флуоресценции, и захват изображения с помощью приложитьред цифровая камера для последующего анализа в автономном режиме.

8. замораживание и оттаивание PBMNCs

  1. В конце стадии 3.2, После центрифугирования аспирата среды и вручную разрушить осадок клеток с повторным пипетированием вверх и вниз с помощью пипетки P1000 наконечник. Добавить 1 мл замораживания среды, 90% сыворотки и 10% ДМСО, убедившись, что аккуратно перемешать, чтобы произвести клеточной суспензии. Передача клеточной суспензии криопробирку и размораживать, как описано в разделе 5.

Результаты

Выделение охристыми пальто мононуклеарных клеток из 60 мл крови, как правило, дает 100-150x10 6 Всего белых кровяных клеток. При покрытием в один Т-75 колбу, большое количество клеток в клеточной суспензии unlysed делает его трудно решить отдельные прилипшие клетки с помощью микроскопии светлого. Повторные средние изменения приводят в оформлении неадгезивных клеток и позволяют визуализации клейкой населения моноцитарно "ранних" ЕРС. На 7 день, Т-75 будет содержать примерно 7х10 6 из этих удлиненных адгезивных клеток. С 7 день до 14, колонии BOECs должен появиться в колбе (рис 2А). Колонии сначала появляются в 3 до 5 смежных клеток. Вырост номер колония может варьироваться от 1 до 10 колоний на 60 мл крови. Как правило, молодые доноры (т.е. 20-25 лет), как правило, для получения большего числа колоний выроста, которые также появляются в начале культуры.BOECs пролиферируют из этой центральной группы клеток образовывать колонии, состоящие круговые нескольких сотен клеток. Клетки в этих колониях демонстрируют классический эндотелия булыжника морфологию.

Желательно, чтобы прохода исходных колоний, когда они содержат около 1000 клеток на колонии. Вырост колонии обычно достигают этого размера через 7 дней после их первоначального вида в культуре. После того, как первоначальные колонии пересаживали в новую Т-75 колбу, они должны распространяться, чтобы сформировать сливающийся монослой на (3-5x10 6 клеток на колбу) в течение 5 дней или меньше (Рис 2B). В небольшой процент выделений (<10%), вырост колонии не появляются, или не размножаются достаточно после этого первого шага пассирования. BOECs, которые обладают низкой пролиферации после первого пассирования редко идут дальше, чтобы стать стабильными BOEC изоляция и часто останавливаются пролиферирующих в течение двух-трех проходов. МоноцитарныхРанние ЕРС, содержащиеся в BOEC культур непролиферативная и, как правило, очищается от культур в течение 1-2 пассажей. Оформление этих ранних клеток-за гибели клеток, отказ начале клеток повторно придерживаться после пересева и разбавление не-пролиферативных начале ЕРС повторного пассирования с.

Прохождение 1-клетки могут быть либо пассируют далее в культуре или замораживали для дальнейшего использования. После того, как выделение стабильно генерируется, клетки не могут быть пассировать в размере 1 сливной колбу на 3-5 новых Т-75 колбы вплоть до прохода 8 или 9, прежде чем стать покоя. Опять же, плотность клеток является критическим всей культуры. По нашему опыту, не менее чем 750000 клеток следует высевали в Т-75 колбу, как снижение плотности клеток может привести к аресту роста. Несмотря на высокую пролиферативный потенциал BOECs клетки также не следует допускать того, чтобы overconfluent (т.е..,> 5x10 6 клеток на колбу), так как это может привести к чаты ион BOECs к непролиферативной фенотипа.

Мы полагаем, что любая клетка быть помечены как BOEC должен отображать соответствующую поверхность клеток и внутриклеточного окрашивания эндотелиальных маркеров. Характеристика BOECs может быть достигнуто с помощью проточной цитометрии (рис 3) или флуоресцентной микроскопии (рис 4), с последующим окрашиванием для типичных маркеров эндотелиальных клеток. BOECs положительны для CD31 эндотелиальные маркеры и поверхностные VEGFR2 и отрицательные для моноцитов CD14 маркера и пан-лейкоцитов маркера CD45. BOECs также принадлежать Вейбел-Паладе органы и таким образом выразить фактор Виллебранда (ФВ), как дискретной, точечной окрашивание цитоплазмы. В отличие от других развитых эндотелиальных типов клеток, таких как легочной артерии или аорты эндотелиальных клеток, BOECs также выразить прародителя и активации маркера CD34 на их поверхности.

ftp_upload / 53384 / 53384fig1.jpg "/>
Рисунок 1. Схема протокола BOEC поколения. Мононуклеарные клетки периферической крови выделяют из венозной крови центрифугированием в градиенте плотности и культивировали на коллагеновых пластинок, покрытых в эндотелиальных среды роста, содержащей FBS определен. BOEC колонии появляются в течение 7-14 дней культуры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-1
Рисунок 2. Светлое изображения представительных BOEC культур. (А) вырост колонии появляются в культурах между 7 дней и 14. колоний, присутствующих в коллекциях эндотелиальных клеток, как, которые расположены в булыжной монослоя и размножаются в радиальном направлении от центральной точки. Ближайшие вырост колонии приверженцем моноcytic клетки, которые составляют подавляющее большинство клеток в начале культур. Эти клетки, описанные ранее в "начале" эндотелиальных клеток-предшественников, имеют веретенообразную морфологию и выразить моноцитарных маркер CD14. (Б) После пассирования, высоко пролиферативные BOECs взять на культурах, как не-пролиферативных клеток моноцитов либо отмирают или не повторно прикрепить после пассирования. Масштабная линейка 250 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-2
Рисунок 3. Характеристика BOECs с помощью проточной цитометрии. BOECs трипсинизировали и окрашивали флуоресцентно-сопряженных антител изотипа контроля (серый заполненный пик) или антител, направленных против конкретных поверхностных маркеров (красная линия). Поверхностные маркеры для цитометрического характеристикивключают гемопоэтические маркеры CD45 и CD14, эндотелиальные маркеры CD31 и VEGFR2 и progentior и эндотелиальной маркер CD34 активации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-3
Рисунок 4. Иммунофлуоресцентное окрашивание BOECs эндотелиальных маркеров клеток. Представительства иммунофлуоресцентные изображения BOECs иммуноокрашиванию с антителами, направленными против поверхности клеток эндотелия маркера CD144 (VE-кадгерин, верхняя правая панель) и гликопротеин крови фактора фон Виллебранда (ФВ, нижняя правая панель) , Соответствующие панели, показывающие окрашивание DAPI ядерной показаны слева. Масштабная линейка 50 мкм. для CD144. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большеВерсия этой фигуры.

Обсуждение

Мы представляем подробный протокол, который позволяет надежно и эффективно получать BOEC из мононуклеарных клеток периферической крови взрослого человека (PBMNC). Наш протокол включает в себя два важных усовершенствования, которые представляют собой прогресс по сравнению с предыдущими методами выделения BOEC. 14-16 К ним относятся отсутствие гепарина в исходной питательной среде PBMNC и использование определенной сыворотки, квалифицированной эмбриональными стволовыми клетками. Это последнее уточнение имеет особое значение. Сыворотка, квалифицированная эмбриональными стволовыми клетками (ESC), является более стабильным сортом сыворотки, и, хотя пока неизвестно, какие компоненты обогащены сывороткой, которые способствуют выделению BOEC, влияние этой определенной сыворотки на эффективность генерации BOEC очевидно. Кроме того, мы также добились успеха в выделении BOEC с помощью сыворотки крови человека, что позволило создать BOEC для клинической трансляции. В наших руках этот усовершенствованный протокол приводит к успешной изоляции стабильных культур BOEC от более чем 90% доноров, что делает его одним из самых надежных методов генерации BOEC, известных на сегодняшний день. Несмотря на то, что использование определенных сывороток имеет решающее значение для генерации BOEC, оно также представляет собой основное ограничение текущего протокола. Будущие усовершенствования метода могут включать в себя генерацию этих клеток в бессывороточных, определенных условиях культивирования.

Важнейшие этапы протокола включают обработку образцов крови как можно скорее после сбора, полный забор клеток охристой оболочки после центрифугирования градиента плотности и своевременный перенос исходных колоний из P0 в P1. Этот этап прохождения имеет решающее значение для установления стабильной изоляции. Как и другие эндотелиальные клетки, BOEC, по-видимому, очень чувствительны к плотности покрытия. Если плотность покрытия после пассирования слишком низкая, BOEC не будут размножаться. И наоборот, если позволить колониям стать чрезмерно слитыми до пассации, клетки также прекратят пролиферацию и будут иметь тенденцию превращаться в удлиненный фенотип мезенхимальных клеток. Если с 7 по 14 день появляется небольшое количество колоний или если колонии небольшие по размеру, устранение неполадок может включать увеличение плотности клеток путем помещения колоний P0 в колбу T-25 вместо T-75.

После освоения метода полученные BOEC могут быть использованы в нескольких приложениях, включая исследования биологии эндотелиальных клеток in vitro , моделирование заболеваний и скрининг лекарств, а также терапию трансплантацией клеток in vivo . Важным соображением для разработки любого процесса клеточной терапии является использование клеток, свободных от патогенных мутаций. Ранее мы показали, что BOEC, выделенные с использованием нашего протокола, обладают геномами, свободными от вариаций числа копий и, таким образом, являются репрезентативными для индивидуума, у которого они были собраны. Кроме того, мы также продемонстрировали, что большинство линий iPSC, полученных от BOEC, свободны от вариаций числа копий. 13 Это контрастирует с предыдущими сообщениями об изменении числа копий в ИПСК на основе фибробластов. На сегодняшний день эти клетки остаются единственными иПСК, для которых была зарегистрирована такая степень геномной точности. Эта особенность важна для области биологии иПСК и использования ИПСК в моделировании заболеваний, скрининге лекарств и будущей клеточной трансплантации.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантами, финансируемыми Британским фондом сердца (BHF), Dinosaur Trust, McAlpine Foundation, Fondation Leducq, Fight for Sight, Кембриджским биомедицинским исследовательским центром, Национальным институтом исследований в области здравоохранения, включая (i) Оксбриджский центр регенеративной медицины BHF [RM/13/3/30159], (ii) Кембриджский центр передового опыта в области исследований, (iii) Больница Адденбрука, Кембриджские университетские больницы NHS Foundation Trust и (iv) Больница Папворта NHS Foundation Trust, а также поддержал Кембриджский центр фенотипирования клеток BRC NIHR. MLO финансируется за счет стипендии BHF Intermediate Fellowship. FNK финансируется за счет стипендии BHF PhD.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Для сбора крови
60 мл шприц с наконечником luer-lokBD309653
19G Surflo Winged Infusion SetTerumoSV-19BL
50 мл коническая центрифужная пробиркаStarLabE14502 на донора
цитрат натрияMartindale Pharmaceuticals270541
Name<strong>CompanyНомер в каталогеКомментарии
Для изоляции охристой шерсти
Ficoll-Paque PlusGE Healthcare17-1440-03
Dulbecco' s PBS (без Ca2+ и Mg2+)Sigma-AldrichD8537
Стерильно упакованные пластиковые переводные пипеткиAppleton WoodsKC231
Turk' sРаствор Millipore1.093E+09
NameCompanyНомер в каталоге>Комментарии
Для клеточной культуры, пропускания и замораживания клеток
Тип 1 Коллаген (полученный из крысиного хвоста)BD Biosciences35-4236
Дульбекко s PBS (без Ca2+ и Mg2+)Sigma-AldrichD8537
0,02M уксусной кислоты Sigma-AldrichA6283приготовлен в воде с реагентом
Endothelial Growth Medium-2MV
(содержит Bullet Kit, но не сыворотку)		LonzaCC-3202Примечание: Важно, чтобы среда не содержала гепарин.  
не используйте EGM-2.
Фетальная бычья сыворотка (США), определенныйгиклонSH30070
10x трипсин EDTAGibcoT4174развести до 1x в PBS перед использованием
Термоинактивированный FBSGibco10500-064
DMEMGibco41965-039
DMSOSigma-Aldrich276855
Nalgene Mr. Frosty Морозильный контейнерSigma-AldrichC1562
Name<strong>CompanyНомер в каталогеКомментарии
Для проточной цитометрической характеристики
FITC-конъюгированная мышиная античеловеческая CD14BD Biosciences555397Мышь IgG1k, Клон: WM59
Разведение: 1:20
FITC-конъюгированная мышиная античеловеческая CD31BD Biosciences555445мышиная IgG1k, Клон: WM59
Разведение: 1:20
APC-конъюгированная мышиная мышиная античеловеческая CD34BD Biosciences555824мышиной IgG1k, Клон: 581/CD34
Разведение: 1:20
FITC-конъюгированный мышиный CD45BD Biosciences560976мыши IgG1k, клон: HI30
Разведение: 1:20
  APC-конъюгированная мышь античеловеческая VEGFR2R& D SystemsFAB357Aмышь IgG1, клон: 89106
Разведение: 1:10
FITC-конъюгированная мышь IgG1k контроль изотипаBD Biosciences555748Клон: MOPC-21
Разведение: 1:20
APC-конъюгированная мышь IgG1k контроль изотипаBD Biosciences555751Клон: MOPC-21
Разведение: 1:20
APC-сопряженная мышь IgG1k контроль изотипаR& D SystemsIC002A
Разведение: 1:10		Клон: 11711
ЭДТА, 0,5М растворSigma-AldrichE7889
Name<strong>CompanyНомер в каталогеКомментарии
Для иммунофлуоресцентной микроскопии 
Corning Costar 24-луночный планшет для культуры тканейSigma-AldrichCLS3527
ПараформальдегидSigma-Aldrich158127
BSASigma-AldrichA7906
Полисорбат 20Sigma-AldrichP2287
Моноклональный мышиный антитело к человеку CD34R& D SystemsMAB72271Clone 756510, IgG1, использовать при 10 мкм; г/мл
Поликлональный козий античеловеческий VE-кадгерин (CD144)R& D SystemsAF938Antigen affinity- очищенный IgG, применение в соотношении 1:300
Моноклональный кролик против человека фактор фон Виллебранда (vWF)Abcamab154193Клон EPSISR15, применение в соотношении 1:250
Вторичное антитело Donkey против мыши IgG (H+L), конъюгат Alexa Fluor 488Life TechnologiesA-21202поликлональный, 2 мг/мл, применение в соотношении 1:200
Вторичное антитело против козы IgG (H+L) от осла, конъюгатAlexa Fluor 488Life TechnologiesA-11055Поликлональный, 2 мг/мл, 1:200
Ослиное антитело против кролика IgG (H+L) вторичное, Alexa Fluor 568 конъюгированное LifeTechnologiesA-10042Поликлональное,  2 мг/мл, 1:200
DAPI (4′,6-Diamidino-2-фенилиндола дигидрохлорид)Sigma-AldrichD9542применение в 1 μ г/мл

Ссылки

  1. Yancopoulos, G. D., Klagsbrun, M., Folkman, J. Vasculogenesis, angiogenesis, and growth factors: ephrins enter the fray at the border. Cell. 93, 661-664 (1998).
  2. Flamme, I., Frölich, T., Risau, W. Molecular mechanisms of vasculogenesis and embryonic angiogenesis. J Cell Physiol. 173, 206-210 (1997).
  3. Asahara, T., et al. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science. 275, 964-967 (1997).
  4. Shi, Q., et al. Evidence for circulating bone marrow-derived endothelial cells. Blood. 92, 362-367 (1998).
  5. Ormiston, M. L., Deng, Y., Stewart, D. J., Courtman, D. W. Innate immunity in the therapeutic actions of endothelial progenitor cells in pulmonary hypertension. Am J Respir Cell Mol Biol. 43, 546-554 (2010).
  6. Hur, J., et al. Characterization of two types of endothelial progenitor cells and their different contributions to neovasculogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24, 288-293 (2004).
  7. Lin, Y., Weisdorf, D. J., Solovey, A., Hebbel, R. P. Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood. J Clin Invest. 105, 71-77 (2000).
  8. Yoder, M. C., et al. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109, 1801-1809 (2007).
  9. Toshner, M., et al. Transcript analysis reveals a specific HOX signature associated with positional identity of human endothelial cells. PLOS ONE. 9, e91334(2014).
  10. Toshner, M., et al. Evidence of dysfunction of endothelial progenitors in pulmonary arterial hypertension. Am J Respir Crit Care Med. 180, 780-787 (2009).
  11. Wang, J. W., et al. Analysis of the storage and secretion of von Willebrand factor in blood outgrowth endothelial cells derived from patients with von Willebrand disease. Blood. 121, 2762-2772 (2013).
  12. O'Neill, C. L., et al. Therapeutic revascularisation of ischaemic tissue: the opportunities and challenges for therapy using vascular stem/progenitor cells. Stem Cell Res & Ther. 3, 31(2012).
  13. Geti, I., et al. A Practical and Efficient Cellular Substrate for the Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Adults: Blood-Derived Endothelial Progenitor Cells. Stem Cells TM. 1, 855-865 (2012).
  14. Prasain, N., Meador, J. L., Yoder, M. C. Phenotypic and functional characterization of endothelial colony forming cells derived from human umbilical cord blood. Journal of Vis Exp: JoVE. , (2012).
  15. Martin-Ramirez, J., Hofman, M., van den Biggelaar, M., Hebbel, R. P., Voorberg, J. Establishment of outgrowth endothelial cells from peripheral blood. Nat Prot. 7, 1709-1715 (2012).
  16. Hofmann, N. A., Reinisch, A., Strunk, D. Isolation and large scale expansion of adult human endothelial colony forming progenitor cells. Journal of Vis Exp: JoVE. , (2009).

Перепечатки и разрешения

Теги

Выделение из периферической кровицентрифугирование в градиенте плотностиколлагеновое покрытиесреда для получения BOECпротокол культивирования клетокмаркеры эндотелиальных клетокиммунофлуоресценция CD144окрашивание на фактор фон Виллебрандаметод криоконсервации
Поколение и культура крови вырост эндотелиальных клеток из периферической крови человека
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.