Method Article

Выделение и анализ состава растительных липидов кутикулы полиэфирные мономеры

DOI:

10.3791/53386

⸱

November 22nd, 2015

 , 
1Department of Biology, Algoma University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Липидные полиэфиры представляют собой структурные компоненты двух модификаций клеточной стенки: растительный кутикула и субериносодержащий диффузионный барьер. В этом видео мы описываем метод деполимеризации кутина из целых делипидатированных листьев. Этот метод может быть применен для исследования мутантов, скомпрометированных в биосинтезе кутина или суберина.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Наземные растения производят внеклеточные алифатические биополиэфиры, которые изменяют клеточные стенки определенных тканей. Клетки эпидермиса синтезируют кутин, полиэфир глицерина и модифицированных жирных кислот, который составляет каркас кутикулы, покрывающей воздушные поверхности растений. Суберин представляет собой родственный липидный полиэфир, который откладывается на клеточных стенках определенных тканей, включая корневую энтодерму и перидерму клубней, кору деревьев и корни. Эти липидные полимеры сильно варьируются по составу у разных видов растений и часто различаются по тканям в пределах одного вида. В данной статье мы описываем подробный протокол изучения мономерного состава кутина в листьях Arabidopsis thaliana с помощью деполимеризации, дериватизации и последующего газового хромато-масс-спектрометрического анализа (ГХ/МС), катализируемой метоксидом натрия (NaOMe). Этот метод может быть использован для исследования мономеров нерастворимых полиэфиров, выделенных из цельных делипидатированных растительных тканей, содержащих либо кутин, либо суберин. Метод может быть применен не только для характеристики состава липидных полимеров у видов, ранее не анализировавшихся, но и в качестве аналитического инструмента в прямом и обратном генетических подходах для оценки функции гена-кандидата.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Сосудистые растения полагаются на внеклеточных слоев, которые функционируют как водонепроницаемых барьеров между растительных тканей и внешней среды. Эти стены-ассоциированных структур липофильный клеток ограничивают патогенной инфекции и регулировать пассивный транспорт газов, воды и растворенных веществ в и из растительных тканей 1. Такие барьеры завод кутикулы, А synapomorphic структура уникальна для растений 2, и различных суберина содержащие диффузионных барьеров. Кутикула олеофильный слой синтезированы эпидермальных клеток и связаны с ними через пектиновые слоя на внеклеточной части клеточной стенки 3-5. Это заключает основные воздушные органы высших растений, используемых в качестве важного интерфейса между растительных тканей и окружающей среды.

Кутин, структурной матрицы кутикулы и суберин два нерастворимые глицеролипид полиэфиры, связанные с растворителем-экстрагируемых восков 2,4. Эти полимерные лipids состоят из насыщенных и ненасыщенных производных жирных кислот и структурно и функционально похожи. Тем не менее, они отличались характерными различиями в химическом составе и осаждения сайтов.

Суберин является алифатический полиэфир, расположенный внутри клеточных стенок некоторых внешних и внутренних тканей, образующих вторичную стенку. Опробковевших ткани включают periderms корней, клубней и кору деревьев, корневые эндодермы, кожуры слои, и исцелил раны 2. В отличие кутина, то суберин полиэфир обычно содержит спирты, насыщенные и моно-ненасыщенных дикарбоновых кислот и большую часть мономеров с очень длинной цепью (C≥20).

Кутин является наиболее распространенным липидов полиэфир в сосудистых растений 6, и состоит из глицерина и С 16 -С 18 жирных производных переэтерифицированную кислот, такие как гидрокси и гидрокси-замещенных эпоксидных жирных кислот 4. В то время как состав кутина полимеровварьируется в зависимости от вида tracheophyte, наиболее преобладающие первичные мономеры 10, 16-дигидрокси 16: 0, 18-гидрокси-9,10-эпокси 18: 0, и 9,10,18-триокси 18: 0 жирных кислот. Интересно, что Arabidopsis листьев и стеблей кутин в основном состоит из 18: 2 дикарбоновой кислоты 7,8.

Кутикулы растений также представит значительные различия в толщине, начиная от нескольких нанометров до нескольких микрометров 9. Так изоляции кутикулы является трудоемким и занимает много времени шаг, особенно для тонких листовых очень кутикулы, такие как те из Arabidopsis THALIANA 8, способы в обход изоляции кутикулы были разработаны и проверены 7,8. Здесь мы описываем подробный протокол для изучения мономерный состав кутина в Arabidopsis THALIANA листьев по метоксид натрия (NaOMe) -catalyzed деполимеризации и последующего газовой хроматографии / масс-спектрометрии (/ MS GC) анализ. Этот протокол обеспечивает надежную способ анализа СОmposition липидных завод полиэфиров в целом delipidated тканей, и была заимствована из ранее представленных протоколов 7,10,11. Образцы цельной ткани сначала гомогенизируют и исчерпывающе delipidated, удаление растворителя экстрагируемой липидов в том числе и кутикулярные epicuticular восков, липидов мембран и триацилглицеринов. Клеточной стенки обогащенный остатки затем деполимеризованный в их учредительных мономеров метилового эфира по метанолята катализируемой метанолиза натрия. Метиловые эфиры жирных кислот экстрагируют при подкислении и дериватизации с получением их соответствующих триметилсилил или ацетил производные. Производные остатки обладают высокой летучестью, и может быть элюировали из колонки газовой хроматографии по разумной температуры без изменения их структурной конформации при анализе ГХ / МС.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Примечание: Этот протокол был адаптирован с Бонавентура и др. (2004), Молина и др. (2006), Ли и др. (2013) 7,10,11. Шаги 1-5 приведены на рисунке 1.

1. Ткань делипидированием

Примечание: Всегда прополощите все стекла и крышки с хлороформом, давая сухой под вытяжкой, перед использованием.

ВНИМАНИЕ: Выполните ткани гомогенизации и все шаги растворителей передачи под вытяжкой; всегда носить лаборатории пальто, перчатки и защитные очки всплеск, чтобы избежать прямого контакта с химическими веществами и защитить образцы от загрязнения.

  1. Разогреть на водяной бане и тепло блок 85 ° C.
  2. Взвешивают приблизительно 0,5 г образца листьев каждого в предварительно взвешенный 20 мм х 125 мм стеклянные пробирки с политетрафторэтилен (ПТФЭ) -faced винтовыми пробками. Включают в себя четыре дубликатов на образце.
  3. Поместите 2-пропанол в колбе Эрленмейера (примерно 125 мл; 25 мл на г SAMPле). Добавить 2,6-ди-трет-бутил-4-метилфенол (также известный как бутилированный гидрокситолуол, ВНТ) до конечной концентрации 0,01% (вес / объем).
    Примечание: Добавить ВНТ из 5% (вес / об) маточного раствора в метаноле (ВНТ помогает свести к минимуму окисление ненасыщенных жирных кислот).
  4. Предварительный нагрев 2-пропанол до 85 ° С на водяной бане.
  5. Добавить 12 мл горячей 2-пропанол растворитель в каждую пробирку и тепла в течение 15 мин при 85 ° С в нагревательный блок. Этот шаг инактивирует липазы, что может быть освобожден от разрушенных клеток.
  6. Пусть трубки остыть до комнатной температуры и измельчить ткань тщательно гомогенизаторе до получения однородной суспензии.
  7. Поместите образцы в орбитальном шейкере и встряхивают в течение 1-2 часов при 100 оборотов в минуту и ​​при комнатной температуре.
  8. Центрифуга в течение 10 мин при 800 мкг и отбросить супернатант.
  9. Добавить равный объем 2-пропанола и встряхивают в течение 12 часов при комнатной температуре.
  10. Центрифуга в течение 10 мин при 800 мкг и отбросить супернатант.
  11. Добавить 12 мл CHCl 3: CH 3 OH (2: 1, объем / объем) до остатка (25 мл на грамм образца) и встряхивали в течение ночи при 100 оборотах в минуту и при комнатной температуре.
  12. Центрифуга в течение 10 мин при 800 мкг и отбросить супернатант.
  13. Добавить 12 мл CHCl 3: CH 3 OH (1: 2, об / об) до остатка и встряхивают в течение ночи при 100 оборотах в минуту и при комнатной температуре.
  14. Центрифуга в течение 10 мин при 800 мкг и удаления растворителя.
  15. Пусть образцы сушат при вытяжном шкафу в течение ночи при комнатной температуре.
  16. Высушите остаток, а затем поместить в вакуум-эксикаторе над безводным CaCl 2 или 4 до тех пор, CaSO постоянной массы достигается (3-5 дней).

2. Деполимеризация: метанолизе с метоксид натри (рисунок 2)

ВНИМАНИЕ: Выполните шаги 2.3 - 2.4, 2.7 - 2.8, 2.10 - 2.11, 2.13 - 2.15 и 2.17 - 2.18 под вытяжкой; всегда носить лаборатории пальто, перчатки и защитные очки всплеск.

  1. Разогреть тепло блок 60 ° C.
  2. Взвесьте пробирки, содержащие сухой остаток (важный для дальнейших расчетов).
  3. Добавить внутренние стандарты в каждую пробирку: 25 ωL метил heptadecanoate (1 мг / мл) и акции 25 мкл со-pentadecalactone (1 мг / мл акции).
  4. Добавить 0,9 мл метилацетата, 1,5 мл метоксида натрия и 3,6 мл метанола в каждую пробирку и колпачок их. Кроме того, подготовить реакционной смеси этих трех реагентов и добавить 6 мл аликвоты с каждого образца.
  5. Образцы тепла течение 2 часов при 60 ° С и вихря периодически 15-минутными интервалами.
  6. Давайте образцы остыть до комнатной температуры.
  7. Добавьте 10 мл хлористого метилена (СН 2 Cl 2) и 1,5 мл ледяной уксусной кислоты, чтобы извлечь метиловых эфиров жирных кислот.
  8. Добавить физиологический раствор (0,5 М NaCl), чтобы заполнить каждую пробирку и шапку.
  9. Образцы Вихревые в течение 1 мин и центрифугируют в течение 10 мин при 800 х г в.
  10. Трансфер органическую фазу (нижний) для очистки труб среднего размера (16 х 125 мм стеклянные пробирки с политетрафторэтилена (ПТФЭ) -faced винтовой крышкой).
  11. Добавить физиологический раствор (0,5 М NaCl), чтобы заполнить каждую пробирку и шапку.
  12. Образцы Вихревые в течение 1 мин и центрифугируют в течение 10 мин при 800 х г в.
  13. Удалить водный (верхний) фазы и повторите шаги 2.11-2.12.
  14. Удалить все водный (верхний) фазы.
  15. Добавить безводный сульфат натрия (Na 2 SO 4) в растворителе, крышка трубы, и вихрь в течение 1 мин; Образцы могут быть оставлены в настоящее время до следующего дня. На этом этапе образцы могут быть оставлена ​​на ночь при вытяжном шкафу.
  16. Центрифуга в течение 2 мин при 800 мкг для уплотнения Na 2 SO 4 соль на дне.
  17. Перевести органическую фазу в маленький стакан одноразовой трубки (13 х 100 мм стеклянные пробирки с политетрафторэтилена (ПТФЭ) -faced винтовой крышкой).
  18. Растворитель выпаривают досуха в атмосфере азота и переходите к шагу дериватизации. Если не обрабатываются немедленно, хранить образцы выпаривали при -20 ° С (образцы могут бытьLSO хранятся до стадии испарения).

3. Подготовка производных для газовой хроматографии

ВНИМАНИЕ: Выполните шаги 3.1.2 и 3.1.5 - 3.1.8 под вытяжкой; всегда носить лаборатории пальто, перчатки и защитные очки всплеск.

  1. Производные триметилсилила
    1. Разогреть тепла блок до 100 ° С.
    2. Добавить 100 мкл пиридина и 100 мкл (БСТФА N, О бис-триметилсилил-трифторацетамид) в каждую пробирку и колпачок их.
    3. Образцы тепла при 100 ° С в течение 10 мин.
    4. Давайте образцы остыть до комнатной температуры.
    5. Выпаривают образцы в атмосфере азота при комнатной температуре. Избегать применения тепла к образцам, мономеры обладают высокой летучестью на данном этапе.
    6. Добавить 500 мкл 1: 1 (объем / объем) гептан: толуол.
    7. Образцы Вихревые в течение 1 мин и центрифугируют в течение 2 мин при 800 х г в.
    8. Добавить образцы GC флаконы и приступить к GC / MS анализа.
  2. Ацетилпроизводные
    Примечание: ацетилирование, изменять шаги 3.1.1-3.1.3 выше следующим образом (не показано на видео); шаги 3.1.4-3.1.8 те же:
    1. Разогреть тепло блок 60 ° C.
    2. Добавить 100 мкл пиридина и 100 мкл уксусного ангидрида (AC 2 O) в пробирки.
    3. Тепловые пробы 1 часа при 60 ° С.

4. ГХ / МС анализ

  1. Использование капиллярной колонки HP-5 (30 м х 0,25 мм х 0,25 мкм толщины пленки) или эквивалент (т.е.., 5% дифенил, 95% диметилполисилоксану). Программа ГХ с потоком газа гелия-носителя устанавливают при 1,5 мл / мин и температуре печи запрограммированной от 150 до 300 ° С со скоростью 3 ° С / мин.
  2. Используйте сплит инъекции (сплит соотношение 1:10) и установить масс-спектрометр в режим сканирования по 40-600 а.е.м. (ударной ионизации электрона).
  3. Создайте таблицу последовательности в том числе растворителей (пустой), WT и мутантных повторов, каждый с использованием указанного метода кутина анализа.
  4. Нагрузка растворителяи флаконы на карусели, добавить гексан шприцев полоскания флаконах в пробоотборник при необходимости, и начать последовательность. После того, как последовательность завершена, общей ионной хроматограммы следов доступны для всех образцов.

Анализ данных 5.

  1. Определить липидный полиэфирные мономеры, сравнивая масс-спектр каждого пика к опубликованному масс-спектров, либо путем поиска коммерческих библиотеку, если можно.
  2. Для каждого идентифицированного пика в общем ионного тока хроматограмме, использовать их соответствующие сроки хранения, чтобы найти области на таблицу результатов интеграции с GC / MS программного обеспечения (Справочная Рисунок 1).
  3. Для каждого мономера (столбцы AB), добавьте значения площади, найденные в таблице интеграции (Справочная Рисунок 1, колонка D) в соответствующей колонке для каждого повторить образец в Excel таблицы мономеров (Справочная файла 2, колонн CF), которая электронные таблицы для количественного арабидопсисакутина TMSI производные. Используйте Дополнительный файл 3, если ацетилированные производные получают вместо этого.
  4. Добавить области внутренних стандартов (IS) в колоннах (HK). Для тех мономеров, которые не дериватизированных, а именно жирных кислот метиловых эфиров (FAMEs), и дикарбоновых сложных эфиров кислоты диметилового (DCA DME,), использовать 17: 0 FAME (IS1), как для количественного (фиолетовый тени ячеек в таблице мономера; Справочная Файлы 2/3). Для гидроксилированных мономеров, в том числе первичных спиртов, феруловая кислоты и ω-гидроксикислот, используют 15: 0 15-гидрокси FAME (IS2), как выбор для соединения количественной (зелено-shadded ячеек в таблице мономера; дополнительные файлы 2/3) ,
  5. Добавить сухую массу листьев для каждого репликации на колонках АХ-BA (Справочная файла 2) или AQ-АТ (Справочная файла 3); альтернативно, сканировать листья для расчета площади поверхности и добавить значения площади к столу мономера, чтобы выразить мономера нагрузки на единицуплощадь поверхности.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол, описанный в этой рукописи устанавливается для определения липидов мономеров полиэфира, минимизируя вклад без кутина липидов 10 Рисунок 1 представляет обзор анализа, который вообще занимает от 8 (т.е., кутина или суберина.) -. 10 дней (от начальной заготовки ткани получения данных ГХ), в зависимости от того, сколько образцы дают высохнуть.

Выбранный катализируемой основанием метанолиза (рис 2) способ деполимеризации полиэфиры ранее утверждены для семян Arabidopsis, которые содержат как кутин и суберина. Ткани сначала гомогенизировали и исчерпывающе delipidated для удаления растворителя-извлекаемые липиды. Выход остатка после экстракции в процентах от первоначальной сырой массы, в обычно 6% для A. THALIANA Кол-0 листья. Клеточной стенки обогащенного остатки сушат в вакуумном эксикаторе и затем деполимеризации на составляющие мономеров сложного метилового эфира скатализируемой основанием трансметилирования. Два часа инкубации был выбран в качестве критического времени, необходимого для правильного деполимеризации и восстановления липидных компонентов полиэфирных. Более длительные времена инкубации в результате увеличения 2-оксикислот; это потенциально извлечь из мембранных сфинголипиды 10.

Типичный хроматограмма, если Arabidopsis дикого типа листьев кутина показано на рисунке 3, для вывода -TMSi эфирных производных (рис 3а) и производных О-ацетил (рис 3b). Каждый пик был определен в сравнении с масс-спектров от литературы и 7,8 публичной базе данных 12 протокола .our видео показывает, как подготовить TMSI производные, но образцы могут быть альтернативно ацетилированный для получения производных гидроксильные группы. Силилированный производные полезны для целей идентификации потому что они дают диагностическую масс-спектров. Тем не менее, ацетилированные производные являются более стабильными и хорошая альтернатива Силилированиеодин мономеров были идентифицированы 10. Чтобы помочь реализовать этот протокол в лабораториях, которые только были ГК, соединенный с пламенно-ионизационным детектором (FID), ГХ / ПИД следы, соответствующие ацетилированного производные WT мономеров лист кутина и в гомолога серии стандартов метилового эфира жирных кислот также показаны (Справочная Рисунок 4).

Этот метод является качественной и обнаруживает количественные различия между образцами, следовательно, его значение для мутанта анализа. Количества отдельных мономеров определяются с использованием метода внутреннего стандарта количественного, что позволяет сравнивать мономера изобилии между образцами. Следует уточнить, однако, что пик размер (суммарного количества ионов) могут не отражать молярные соотношения мономеров в полиэфира. Мы в том числе редактируемых таблиц мономеров для расчета суммы мономеров в Arabidopsis листьев кутина, как метиловых эфиров жирных кислот и производных (TMSI Справочная файла 1), или туз производные TYŁ (Справочная файла 2) спиртов. Эти таблицы могут должны быть адаптированы, если образцы извлекают из различных органов или видов растений.

В качестве примера, мы проанализировали Arabidopsis Талия на Колумбия (Кол-0) листья дикого типа и два ранее охарактеризованных нулевые-мутантных аллелей гена CYP86A2 / att1, att1-1 (м-1) и att1-2 (м-2 ) 13,14. Цитохрома Р450 монооксигеназ о CYP86A подсемейства кодируют предполагаемые Q-oxydases и участвовать в суберина и кутина мономера биосинтеза. Наши результаты (рисунок 4) показывают, значительное снижение нагрузок трех основных мономеров липидов в листьях мутантных по сравнению с WT листьев. В соответствии с прогнозируемым функции фермента, 16: 0, 18: 2, и 18: 1 дикарбоксилатов были специально затронуты в att1 мутантов.

"SRC =" / файлы / ftp_upload / 53386 / 53386fig1.jpg "/>
Рисунок 1. Обзор анализа липидов полиэфирной. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-1
Рисунок 2. Механизм NaOMe-катализируемой реакции трансметилирования. Нуклеофильного метоксид анионы атаковать cabonyl углерод липидных сложных полиэфиров, чтобы сформировать нестабильную тетраэдрического интермедиата (а), который легко диссоциирует на метиловых эфиров жирных кислот и алкоксидов анионов (B). Эти алкоксиды являются сопряженными основы, и реагирует с метанолом, регенерации каталитически активных метоксид анионы, тем самым поддерживая дополнительные реакции деполимеризации (C). Если вода присутствует вСистема, он будет реагировать с метоксид натрия с образованием гидроксид натрия, сильное основание, что необратимо гидролизует эфиры, чтобы привести к нежелательным свободных жирных кислот. Метилацетат добавлен в качестве со-растворителя 15 для удаления небольших количеств гидроксида натрия в системе (D). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-2
Рисунок 3. Представитель общая ионная хроматограмма дикого типа Arabidopsis THALIANA листьев кутина мономеров. (А) О -trimethylsilyl (TMSI) эфир и (Б) ацетат гидроксильные производные. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. а>

figure-results-3
Рисунок 4. кутин мономера состав Arabidopsis THALIANA WT и двух нулевые мутантные аллели гена CYP86A2. (Мутант-1 = att1-1; мутанта-2 = att1-2) Столбики ошибок обозначают стандартное отклонение среднего (n = 4) , Взято из 13, с разрешения © Blackwell Publishing (2007). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-4
Справочная Рисунок 1. Пиковая результаты интеграции стол с / MS программного обеспечения GC. Пики, соответствующие выявленных мономеров и внутренних стандартов идентифицируются по их retenti на время (столбец С) и значения площадь приведены в колонке Д. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

figure-results-5
Справочная файла 2. Таблица Arabidopsis кутина мономеров (производных триметилсилил эфира гидроксильных метиловые эфиры жирных кислот). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

figure-results-6
Справочная файла 3. Таблица Arabidopsis кутина мономеров (производных О-ацетил гидроксильных метиловые эфиры жирных кислот).ком / файлы / ftp_upload / 53386 / Supplemental_File_3_Cutin_template_Acetylated_derivatives.xlsx "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

figure-results-7
Справочная Рисунок 4. ГХ / FID следы от (АВ) метил жирной кислоты (FAME) стандарты индекса удерживания (пики помечены каждого насыщенного FAME длиной цепи); и (С) А. ацетилированный THALIANA WT лист кутина мономеры. Цифры на пике соответствуют: 16: 0 FAME (1), ферулата (2), 18: 3 FAME (3), 18: 1/18: 2 FAMEs (4), 18: 0 FAME (5), (6 sinapate ), 16: 0 DCA (7), 16-ОН 16: 0 FAME (8), 18: 2 DCA (9), 18: 1 DCA (10) 18: 0 DCA (11), 18-ОН 18: 2 FAME (12), 18-ОН 18: 1 FAME (13), 20: 0 FAME (14), 10,16-diOH 16: 0 FAME (15), 24: 0 FAME (16). DCA: диметиловый эфир дикарбоновой кислоты; FAME: метиловый эфир жирной кислоты; IS1: внутренний стандарт 1, 17: 0 Слава; ИС2: внутренний улandard 2, 15-ОН 15: 0 славы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В отличие от других биополимеров, таких как ДНК и белков, липидов растений полиэфиры не сделаны из шаблона. Вместо этого их композиции зависит от специфичности ферментов, присутствующих в тканях, которые делают эти внеклеточные полимеры. Таким образом, химические анализы на компоненты которой важно понять липидный состав сложного полиэфира.

Химические методы расщепляют эфирные связи, включают омыление, гидрогенолиз, кислотный катализируемой трансметилирования и катализируемой основанием трансметилирования 2. Каждый из них имеет свои преимущества и недостатки. Омыления производит свободные жирные кислоты, которые гидроксильные могут подвергаться вторичной реакции. Гидрирование алюмогидридом лития (LiAlH 4) 16 была использована для анализа кутина 7. Гидрогенолиз уменьшает функциональными углерода спирты и оригинальные структуры должны быть выведены с помощью deuteriolysis с литий-алюминий дейтеридом (LiAlD 4).Недостатком этого подхода является требование высокой разрешающей ГХ / МС, чтобы сравнить степень deuteriation жирных полиолов, полученных, чтобы сделать их назначений структур. Катализируемой кислотой переэтерификации с метанольным трифторида бора (BF 3) был часто используется в кутин и суберина деполимеризации 8,17,18, но реагент имеет ограниченный срок годности и может ввести искажений, обусловленных побочных реакций 15. Метанольный серной кислоты также дает метиловые эфиры мономеров, но с более значительным числом 2-гидрокси жирные кислоты, которые, предположительно, не являются истинными липидных компонентов полиэфирные, по сравнению с другими методами 10.

NaOMe катализируемой Способ переэтерификации описано в данном протоколе производит метиловых эфиров жирных кислот, которые модифицируют силилированием гидроксильных групп, обеспечивая характерный масс-спектров для идентификации или ацетилированием, чтобы обеспечить более стабильные производные гидроксильных групп FOг количественная. Одним из недостатков этого метода является то, что гидролиз конкурирует с переэтерификации, когда вода присутствует в реакции. Вода реагирует с NaOMe (катализатор) и производит NaOH, который в свою очередь гидролизует жирные кислоты метиловый эфиры с образованием свободных кислот (рис 2D). Это нежелательно, так как побочная реакция два пика будет присутствовать для каждого жирной кислоты: метилового эфира и сложного эфира производного TMSI, что усложняет анализ. С использованием безводного реагентов и добавление метилацетат, как сорастворитель, чтобы конкурировать с омылением, таким образом, решающие шаги, чтобы предотвратить гидролиз (рис 2D).

Кутина и суберина содержать от 1 до 26% глицерина 4. Однако, это мономера не будет обнаружено в экспериментальных условиях, описанных в данном протоколе. Глицерин высокой гидрофильностью и, в отличие от мономеров метилового эфира жирной кислоты, будут устранены в течение водных растворителей шагов стирки. Это ограничение такжеpplies к другим методам кутин деполимеризации, но глицерина может быть определена в водном слое, полученном после переэтерификации с использованием метода ферментативного. В качестве альтернативы, он может быть количественно с использованием более мягких условий (например., 0,05 М NaOMe) без дополнительной водной экстракции для обнаружения всех мономеров, в том числе глицерин 19,20 .Although полезной для целей количественного глицерина, мягкие условия обычно дают неполное деполимеризации кутина и суберина.

Если ГК соединен с пламенно-ионизационным детектором (FID) доступен, все повторности могут быть проанализированы в настоящем документе для целей количественного после пики репрезентативной выборки были определены ГХ / МС. В качестве альтернативы, мономеров в GC / FID следов могут быть идентифицированы, если их индексы удерживания известны. Детектор ионизации пламени имеет особенно высокую чувствительность и широкий спектр пропорциональности, которая имеет решающее значение для количественного определения главных и второстепенных компонентов пробыв единичных трасс. Кроме того, это надежный и простой в обслуживании и эксплуатации 15.

Описанный протокол позволяет надежным и воспроизводимым изоляции, идентификации и количественного определения, липидных растений мономеров полиэфира, позволяя химических характеристик мутантов, которые отличаются по составу одного или более липидных мономеров полиэфира. Процедура является масштабируемой, он может быть легко приспособлен для обработки как малых, так и больших количествах различных растительных материалов, в том числе корни, семена, листья, стебли и цветки. Массовые спектральные данные липидных полиэфирных мономеров из многих видов были опубликованы, например,., 21-26 и составляют ценные ресурсы для выявления неизвестных мономеров при адаптации этого протокола для других тканей и / или видов. Этот метод применим к исследованию биосинтеза, регулирования и распределения липидов полиэфиров в высших растений.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Конфликт интересов не декларируется.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана грантом Natural Sciences and Engineering Research (NSERC)-USRA для S.J. и грантом NSERC-Discovery для I.M. Благодарим Ричарда Бурго, Меган Рейнс и Аманду Флюк за техническую помощь. Семена мутантов att1-1 и att1-2 были любезно предоставлены доктором Цзянь-Мин Чжоу из Института генетики и биологии развития, Пекин, Китай.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Химикаты
2-пропанолFisher ScientificBPA451-4Растворитель для делипидирования
Безводный сульфат натрияFisher ScientificS421500
Уксусный ангидридSigma Aldrich320102Дериватизатор
BSTFA (N,O-бис(триметилсилил)-трифторацетамид)Sigma-Aldrich15222Дериватизатор
Бутилированный гидрокситолуол (BHT)Sigma-Aldrich101162Антиоксидант
Хлорид кальция, безводныйFisher ScientificC614-3Десикационный агент
Суфлат кальция, безводный (DRIERITE-8 MESH с индикатором)Acros Organics219090020Десикационный агент
Хлороформ (трихлорметан)Fisher ScientificC6074Органический растворитель
Ледяная уксусная кислотаFisher ScientificBP2401212Подкислитель
Гелиевый газ-носитель, сжатыйвоздух LiquideALPHAGAZ1-UN1046Газ-носитель, GC/MS
ГептанFisher ScientificH3501Органический растворитель
ГексаныFisher ScientificH3024Органический растворитель
МетанолFisher ScientificA4124Органический растворитель, трансметилирование реактивный
МетилацетатSigma-Aldrich296996Органический растворитель
МетилгептадеканоатSigma-AldrichH4515Внутренний стандарт (запас 1 мг/мл)
Метилендихлорид (Дихлорметан)Fisher ScientificD374Органический растворитель
Азот, сжатыйAir LiquideALPHAGAZ1-UN1044Газ-носитель, GC-FID
ПентадеканолактонFluka76530Внутренний стандарт (1 мг/мл запаса)
ПиридинSigma-Aldrich270970Сорастворитель для дериватизации
Хлорид натрияFisher ScientificBP358212Физиологический раствор
Метоксид натрия (25 мас.%)Sigma-Aldrich156256Nucleophile
TolueneFIsher ScientificT2904Organic solvent
Plant Growth Supplies
Pro-Mix PGXPremier Tech Horticulture LtdPro-Mix PGX рекомендуется для выращивания растений Arabidopsis (Eddy, R. and Hahn, D.T., 2012, http://docs.lib.purdue.edu/pmag/2)
Методы Purdue для роста Arabidopsis. 
Купол влажности PermaNest Grower's Solution, LLC, Куквилл, Теннесси;GD2211-24
Лотки для растений Perma-Nest (22x11 дюймов)Grower's Solution, LLC, Куквилл, Теннесси;Н/Д
Квадратные горшки для теплицы, 3,5 дюйма Grower's Solution, LLC, Куквилл, Теннесси;P86
Удобрение для растений общего назначения, Plant-Prod 20-20-20Premier Tech Home and Garden In., Brantford, ONN/A
Стеклянная посуда
13 x 100 мм стеклянная пробирка с тефлоновой завинчивающейся крышкойKimble Chase Life Science and Research Products LLC45066A-13100
16 x 125 мм стеклянная пробирка с тефлоновой завинчивающейся крышкойKimble Chase Life Science and Research Products LLC45066A-16125
стеклянные пробирки 20 x 125 мм с завинчивающейся крышкой с тефлоновым покрытиемKimble Chase Life Science and Research Products LLC45066A-20125
GC крышки флаконовNational ScientificC400051A
флаконы GCNational ScientificC40001
Одноразовые пастерные пипеткиFisher Scientific1367820B
КолбыFisher Scientific
Оборудование
Allegra X15R центрифугаBeckman Coulter
Аналитические весыFisher Scientific
Belly dancerШейкер может быть использован для этой цели, если танцовщица живота недоступна
DB-5 Капиллярная GC колонкаJ& W Scientific, Калифорния, США;  30 м x 0,25 мм x 0,25 мкм; m толщина пленки
Эксикатор
Isotemp 202 водяная баняFisher Scientific
ISQ LT одиночный квадупольный масс-спектрометрThermo Scientific
Тепловой блокИспаритель
Polytron
Газовый хроматограф Trace 1300Thermo Scientific
Двухступенчатый регуляторAir LiquideQ1-318B-580
Вакуумный эксикаторFisher Scientific
Вихревой смесительFisher Scientific
GC флаконы микровкладыши National Scientific C4011631 азота Fisher Scientific гомогенизатор Birkmann

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kolattukudy, P. Biopolyester membranes of plants: cutin and suberin. Science. 208 (4447), 990-1000 (1980).
  2. Kolattukudy, P. E. Polyesters in higher plants. Adv. Biochem. Eng. Biot. 71, 1-49 (2001).
  3. Yeats, T. H., Rose, J. K. C. The formation and function of plant cuticles. Plant Physiol. 163 (1), 5-20 (2013).
  4. Pollard, M., Beisson, F., Li, Y., Ohlrogge, J. B. Building lipid barriers: biosynthesis of cutin and suberin. Trends Plant Sci. 13 (5), 236-246 (2008).
  5. Beisson, F., Li-Beisson, Y., Pollard, M. Solving the puzzles of cutin and suberin polymer biosynthesis. Curr. Opin. Plant Biol. 15 (3), 329-337 (2012).
  6. Heredia, A. Biophysical and biochemical characteristics of cutin, a plant barrier biopolymer. Biochim. Biophys. Acta. 1620 (1-3), 1-7 (2003).
  7. Bonaventure, G., Beisson, F., Ohlrogge, J., Pollard, M. Analysis of the aliphatic monomer composition of polyesters associated with Arabidopsis epidermis: occurrence of octadeca-cis-6, cis-9-diene-1, 18-dioate as the major component. Plant J. 40 (6), 920-930 (2004).
  8. Franke, R., et al. Apoplastic polyesters in Arabidopsis surface tissues - A typical suberin and a particular cutin. Phytochemistry. 66 (22), 2643-2658 (2005).
  9. Vogg, G., et al. Tomato fruit cuticular waxes and their effects on transpiration barrier properties: functional characterization of a mutant deficient in a very-long-chain fatty acid -ketoacyl-CoA synthase. J. Exp. Bot. 55 (401), 1401-1410 (2004).
  10. Molina, I., Bonaventure, G., Ohlrogge, J., Pollard, M. The lipid polyester composition of Arabidopsis thaliana and Brassica napus seeds. Phytochemistry. 67 (23), 2597-2610 (2006).
  11. Li-Beisson, Y., et al. Acyl-lipid metabolism. The Arabidopsis Book. 11, e0161(2013).
  12. Christie, W. W. Mass Spectrometry of Fatty Acid Derivatives. , LipidHome. Available from: http://www.lipidhome.co.uk/ms/masspec.html (2015).
  13. Molina, I., Ohlrogge, J. B., Pollard, M. Deposition and localization of lipid polyester in developing seeds of Brassica napus and Arabidopsis thaliana. Plant J. 53 (3), 437-449 (2008).
  14. Xiao, F., et al. Arabidopsis CYP86A2 represses Pseudomonas syringae type III genes and is required for cuticle development. EMBO J. 23 (14), 2903-2913 (2004).
  15. Christie, W. W., Han, X. Lipid Analysis - Isolation, Separation, Identification and Lipidomic Analysis. , 4th edition, Oily Press. Bridgwater, U.K. 446(2010).
  16. Walton, T. J., Kolattukudy, P. E. Determination of the structures of cutin monomers by a novel depolymerization procedure and combined gas chromatography and mass spectrometry. Biochemistry. 11 (10), 1885-1896 (1972).
  17. Matzke, K., Riederer, M. A comparative study into the chemical constitution of cutins and suberins from Picea abies (L.) Karst., Quercus robur L., and Fagus sylvatica L. Planta. 185 (2), 233-245 (1991).
  18. Riederer, M., Schönherr, J. Quantitative gas chromatographic analysis of methyl esters of hydroxy fatty acids derived from plant cutin. J. Chromatogr. 360, 151-161 (1986).
  19. Moire, L., Schmutz, A., Buchala, A., Yan, B., Stark, R., Ryser, U. Glycerol Is a Suberin Monomer. New Experimental Evidence for an Old Hypothesis. Plant Physiol. 119 (3), 1137-1146 (1999).
  20. Graça, J., Schreiber, L., Rodrigues, J., Pereira, H. Glycerol and glyceryl esters of omega-hydroxyacids in cutins. Phytochemistry. 61 (2), 205-215 (2002).
  21. Eglinton, G., Hunneman, D. H. Gas chromatographic-mass spectrometric studies of long chain hydroxy acids-I: The constituent cutin acids of apple cuticle. Phytochemistry. 7 (2), 313-322 (1968).
  22. Espelie, K. E., Köller, W., Kolattukudy, P. E. 9,16-dihydroxy-10-oxo-hexadecanoic acid, a novel component in citrus cutin. Chem. Phys. Lipids. 32 (1), 13-26 (1983).
  23. Holloway, P. J. Intracuticular lipids of spinach leaves. Phytochemistry. 13 (10), 2201-2207 (1974).
  24. Holloway, P. J., Deas, A. H. B. Epoxyoctadecanoic acids in plant cutins and suberins. Phytochemistry. 12 (7), 1721-1735 (1973).
  25. Holloway, P. J. The chemical constitution of plant cutins. Cutler, D. F., Alvin, K. L., Price, C. E. , Academic Press. London. 45-85 (1982).
  26. Croteau, R., Fagerson, I. S. The constituent cutin acids of cranberry cuticle. Phytochemistry. 11 (1), 353-363 (1972).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cutin AnalysisSuberin AnalysisPlant CuticleLipid PolyesterGC MS AnalysisSodium MethoxideTissue ExtractionMonomer QuantificationArabidopsis ThalianaLipid Polymer

Related Articles