Методическая статья

Измерение рН фагосомы по Логометрический флуоресцентной микроскопии

DOI:

10.3791/53402

⸱

7 декабря 2015 г.

 ,  , 
1Department of Cellular Physiology and Metabolism, University of Geneva

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Фагосомный pH влияет на созревание фагосом, выработку окислителей, фагосомное убийство, а также на презентацию антигена. В данной работе мы описываем ратиометрический метод измерения временных и конечных изменений рН отдельных фагосом в живых фагоцитах с помощью флуоресцентной микроскопии.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Фагоцитоз является фундаментальным процессом, через который врожденные иммунные клетки поглощают бактерии, апоптоза клеток или других инородных частиц для того, чтобы убивать или нейтрализовать проглоченного материала, или представить его в качестве антигенов и инициировать адаптивные иммунные реакции. РН фагосом является критическим параметром регулирования деление или слияние с endomembranes и активации протеолитических ферментов событий, которые позволяют фагоцитарная вакуоль, чтобы созреть в деструкции органелл. Кроме того, перемещение Н + необходим для производства высоких уровней активных форм кислорода (ROS), которые необходимы для эффективного уничтожения и сигнализации на другие ткани хозяина. Многие внутриклеточных возбудителей подорвать фагоцитарную убийство путем ограничения подкисление phagosomal, подчеркнув важность рН в фагосом биологии. Здесь мы опишем логометрического метод для измерения рН в phagosomal нейтрофилов с использованием флуоресцеинизотиоцианатом (FITC) меченных зимозаном в фагоцитарной ТаргETS, и изображения живых клеток. Анализ основан на флуоресценции FITC свойств, который гасили кислом рН при возбуждении при 490 нм, но не при возбуждении при 440 нм, что позволяет количественно определить соотношение рН-зависимой, а не абсолютной флуоресценции, из одного красителя. Подробный протокол выполнения калибровки красителя месте и конверсии в соотношении реальных значений рН также предоставляется. Одноместный красителях логометрических методы, как правило, считается выше одной длины волны или двойной красителя псевдо-пропорциональный протоколов, так как они менее чувствительны к возмущениям, таких как отбеливание, изменение фокуса, лазерные изменения и неравномерное маркировку, которые искажают измеряемый сигнал. Этот метод может быть легко модифицирован для измерения рН в других фагоцитирующих клеточных типов, и зимозан можно заменить любым другим амина, содержащего частицы, из инертных бисера для живых микроорганизмов. Наконец, этот метод может быть адаптирован, чтобы сделать использование других флуоресцентных зондов, чувствительных к различным диапазонам рН или другой phagosomДеятельность аль, что делает его обобщенное протокол для функциональной визуализации в фагосом.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Фагоцитоз, процесс, посредством которого клетки врожденного иммунитета поглощают крупные частицы, развившийся из механизма поедания одноклеточных организмов, и включает в себя связывание с мишенью, обволакивание ее мембраной и отщипывание мембраны, чтобы сформировать вакуоль внутри цитозола, называемую фагосомой. В то время как фагосомная мембрана образуется из плазматической мембраны, активная сортировка белков и липидов, а также слияние с эндомембранами во время формирования фагосомы, превращают фагосому в отдельную органеллу внутри клетки с деградационными свойствами, которые позволяют убивать, нейтрализовать и расщеплять проглоченный материал1-3. Этот процесс, называемый фагосомным созреванием, основан на доставке множества протеолитических и микробицидных ферментов, включая никотинамидадениндинуклеотидфосфат (NADPH) оксидазу, которая переносит электроны в фагосомы, производящие сильный окислитель O2- и его производные активные формы кислорода (АФК) 2,4.

Люминальный pH фагосом оказывает глубокое влияние на несколько событий, необходимых для функционирования фагосом. Во-первых, pH влияет на транспорт эндомембран в целом, поскольку pH-зависимые конформационные изменения трансмембранных регуляторов трафика изменяют набор детерминант трафика, таких как Arfs, Rabs и везикулярные белки оболочки, которые, в свою очередь, определяют, какие везикулы могут сливаться с фагосомами 5-8. Во-вторых, ионный состав фагосомного просвета также трансформируется по мере созревания фагосом, и некоторые ионные транспортеры, такие как обменник Na+/H+ или антипортеры ClC семейства ClC, которые способствуют фагоцитарной функции, полагаются на транслокацию H+ 9,10. Аналогичным образом, продукция АФК тесно связана с фагосомным рН. АФК и его токсичные побочные продукты окисления уже давно признаны решающими для фагосомального уничтожения нейтрофилов 4,11,12, и, как было показано, играют важную роль в других фагоцитах, включая макрофаги, дендритные клетки (ДК) и амебу 13-16. NADPH-оксидаза представляет собой электрогенный фермент, который высвобождает H+ в цитозоле при потреблении NADPH, и что требует одновременного переноса H+ через сопутствующие каналы HVCN1 вместе с транспортируемыми электронами в просвет фагосомы, чтобы смягчить массивную деполяризацию, которая в противном случае привела бы к самоингибированию фермента 17-21. Наконец, несколько протеолитических ферментов обладают оптимальной активностью при разном pH, поэтому зависящие от времени фагосомные изменения pH могут влиять на то, какие ферменты активны и когда. Важность фагосомного pH подчеркивается такими организмами, как Mycobacterium tuberculosis, Franciscella tularensis и Salmonella typherium, которые нарушают фагосомное уничтожение, по крайней мере, частично, изменяя фагосомный pH 22-24.

У млекопитающих основными фагоцитами являются нейтрофилы, макрофаги и дендритные клетки, и в зависимости от типа клетки, зависимые от времени изменения pH фагосомы могут варьироваться в широких пределах и, по-видимому, играют разные роли. В макрофагах сильное и быстрое закисление, опосредованное АТФ-зависимой протонной помпой вакуолярной АТФазой (V-АТФаза), является одним из ключевых факторов, опосредующих уничтожение 25-27, напоминая механизмы, присутствующие у амеб, использующих фагоцитоз в качестве механизма питания 28. Считается, что в этих клетках ключевую роль играет активация кислых протеаз. Напротив, уничтожение нейтрофилов в большей степени зависит от АФК, а также от HOCl, продуцируемого миелопероксидазой (МПО)11, и pH остается нейтральным или щелочным в течение первых 30 минут, подкисляя только позже 29,30. Предполагается, что нейтральный pH способствует активности окислительных протеаз, таких как некоторые катепсины. У ДК фагосомальный рН является противоречивым, некоторые сообщают об окислении, а другие - о нейтральном или щелочном рН 31,32, но АФК и рН могут оказывать глубокое влияние на способность этих клеток представлять антигены Т-клеткам, что является одной из их основных функций 33.

Важно отметить, что гормоны, хемокины и цитокины могут вызывать сигнальные события, которые вызывают созревание и изменения в поведении фагоцитов, и, в свою очередь, влияют на фагосомальный pH 34,35. Аналогичным образом, лекарственные препараты, например, противомалярийный хлорохин, который также рассматривается в качестве противоопухолевой терапии36, могут влиять на фагосомальный pH и, следовательно, на иммунные исходы. Таким образом, различные клеточные биологи, иммунологи, микробиологи и разработчики лекарств могут быть заинтересованы в измерении фагосомного pH, когда они стремятся понять механизмы, лежащие в основе влияния конкретного генетического нарушения, биологически активного соединения или микроорганизма на врожденные и адаптивные иммунные реакции.

Здесь мы описываем метод измерения фагосомного pH в нейтрофилах, который позволил нам показать важность канала HVCN1 в регуляции фагосомального pH нейтрофилов 19. Метод основан на ратиометрических свойствах флуоресцеина изотиоцианата (ФИТК), флуоресцентное излучение которого на длине волны 535 нм чувствительно к pH при возбуждении на длине волны 490 нм, но не при длине волны 440 нм 37. Когда этот краситель химически связан с мишенью, в данном случае с зимозаном, его можно проследить с помощью широкопольной флуоресцентной микроскопии, где клетки визуализируются по мере их фагоцитоза, а фагосомные изменения pH измеряются в режиме реального времени по мере созревания фагосомы. Фактический pH затем определяется путем проведения калибровочного эксперимента, в котором клетки, подвергшиеся фагоцитозу, подвергаются воздействию растворов с различным pH, содержащих ионофоры нигерицин и монензин, которые обеспечивают быстрое выравнивание pH внутри фагосом с внешним раствором. Затем значения отношения сравниваются с известными значениями pH растворов, с помощью нелинейной регрессии строится калибровочная кривая, и полученное уравнение используется для вычисления pH по значению отношения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

О себе этика: Все манипуляции животных проводились в строгом соответствии с руководящими принципами Исследовательского комитета животных из Университета Женевы.

1. Подготовка фагоцитарной Цели

  1. Добавьте 20 мг сухого зимозаном 10 мл стерильной фосфатно-солевой буфер (PBS). Вихревые и тепло в водяной бане кипения в течение 10 мин. Прохладный и центрифуге при 2000 мкг в течение 5 мин.
  2. Удалить супернатант, ресуспендируют в 1 мл PBS и гомогенат в течение 10 мин на водяной бане ультразвуком. Перевести 500 мкл до двух 1,5 мл пробирки. Центрифуга при 11000 мкг в течение 5 мин.
  3. Повторите мыть с 500 мкл PBS. Вареные зимозан может быть аликвоты, замораживали и хранили при -20 ° С.
  4. Промыть зимозаном дважды в 500 мкл свежеприготовленного 0,1 М Na 2 CO 3, рН 9,3, как описано выше (этап 1.2).
  5. Ресуспендируют в 490 мкл После последней промывки. Добавить 10 мкл 10 мг / мл FITC, растворенного в диметилсульфоксиде sulfoxidе (ДМСО), вихревые, накрыть фольгой и инкубируют при перемешивании в течение 4 ч при комнатной температуре.
  6. Для удаления несвязанного красителя, мыть, как описано выше (шаг 1.2), сначала с 0,5 мл ДМСО + 150 мкл PBS, затем 0,5 мл ДМСО + 300 мкл PBS, а затем 0,5 мл ДМСО + 450 мкл PBS, а затем PBS в одиночку.
  7. Граф зимозаном использованием гемоцитометра. Добавить 1 мкл зимозаном 500 мкл PBS, вихря, затем добавить 10 мкл на краю гемоцитометра камеру, где он встречает покровное находиться над центральной сетки. Установите гемоцитометра на ярко-поля микроскопа, снабженного целью 20X.
  8. Сосредоточьтесь на верхней левом углу, содержащей 16 квадратов и рассчитывать все зимозаном частиц в этой области, используя руки Tally счетчик. Повторите с правом нижнем углу. Рассчитывают концентрацию зимозаном используя следующее уравнение: зимозан концентрации = Count / 2 х 500 х 10 4 зимозаном / мл. Маркированный зимозан может быть аликвоты, замораживали и хранили при -20 ° С.
  9. Opsonize меченого зимозаном Wiго кролика против зимозаном антитело при разведении 1: 100. Вихревые и инкубировать в течение 1 часа в водяной бане при 37 °. Промыть 500 мкл PBS, как описано выше (этап 1.2).
    Примечание: Озвучивание настоятельно рекомендуется, особенно после опсонизации, а зимозан имеет тенденцию к образованию комков, которые могут сделать анализ более трудным позже. Опсонизация с 65% об / об крысы или человеческой сыворотки могут быть использованы в качестве альтернативы.
  10. Граф зимозаном помощью гемоцитометра, как описано в шагах 1,7-1,8, и разбавить до 100 х 10 6 частиц / мл. Опсонизация с другими фагоцитирующих стимуляторов, таких как дополнение или нет опсонизация, может быть альтернативно выполнено.

2. Live Video микроскопия

  1. Изолировать первичных нейтрофилы мыши, как описано подробно в другом месте 38.
    1. В качестве альтернативы, можно использовать любой тип клеток фагоцитарной. Хранить нейтрофилов на льду в Roswell Park Memorial института (RPMI 1640) с добавлением 5% фетальной телячьей сыворотки (об / об), 200 Е пенициллина / streptomyciN, при концентрации 10 х 10 6 клеток / мл до готовности к использованию. Другие типы клеток могут быть посеяны 1-4 дней раньше.
  2. Добавить 2 х 10 5 (20 мкл) нейтрофилов к центру 35 мм со стеклянным дном тарелки, распространение капельным путем добавления 50 мкл среды и инкубируют при 37 ° С в течение 5 мин, чтобы позволить клетки придерживаться.
  3. Добавить 1 мл сбалансированный солевой раствор Хенкса (HBSS) нагревают до 37 ° С, содержащей специфический ингибитор MPO 4-аминобензойной гидразида (4-ABH, 10 мкМ). Неспецифические ингибиторы MPO, такие как азид натрия (5 мм), также могут быть использованы, но были недавно предложили оказывать дополнительные неспецифические эффекты на рН 39.
  4. Установите блюдо на флуоресценции Widefield микроскопа, снабженного 37 ° С системы отопления и нефти целью 40X. Инкубируйте клетки без изображения в течение 10 мин, чтобы позволить клетки и оборудование для уравновешивания.
  5. Настройте параметры микроскопа приобрести имидж передачи ярко-поле [PHAсебе или дифференциального интерференционного контраста (ДИК), если имеется] с 440 нм или 490 нм возбуждения и 535 нм излучения каждые 30 сек.
  6. Отрегулируйте время экспозиции и частоты сбора в соответствии с микроскопа системы, чтобы избежать слишком много фотообесцвечивание и фототоксичность и в зависимости от экспериментальных задаваемых вопросов. Начните получения изображения.
  7. Через 2 мин, добавить 10 х 10 6 (50 мкл) опсонизированным зимозаном FITC-к центру блюда. Регулировка целевой: коэффициенты клеток в зависимости от типа фагоцитов и цели используется.
  8. Продолжить изображений в течение 30 мин. Через 30 мин остановить приобретение покадровой и запустить таймер. Перемещение на сцену и захватить 10 или более снимков в различных областях в целях изображения других фагосом, все в пределах 5 мин.

3. Калибровка и контрольные эксперименты

  1. Подготовка к калибровке рН решения (рецепты описаны в таблице 1) до дня эксперимента и заморозить в 10 мл аликвоты.Растаяйте калибровочных растворов и теплой до 37 ° С на водяной бане. Проверяют рН с помощью рН-метра и записывать фактическую рН растворов.
  2. Установите перистальтического насоса на дно стакана блюдо до получения изображения и выполнять живого видео микроскопии, как описано выше (раздел 2).
  3. В конце периода сбора 30 мин повернуть насос на удалить решение в чашке, добавить 1 мл первого раствора калибровки и останавливает насос.
  4. Подождите, пока сигнал не стабилизируется, как правило, 5 мин. Повторите с каждой калибровочного раствора.
    1. Выполнение по крайней мере, один калибровочный за день эксперимента, и калибровки, начиная с самой высокой рН и работает последовательно с самым низким, а также начиная с самой низкой рН и последовательно работает в направлении самой высокой.
  5. В качестве контроля, добавляют 100 мкл 100 мкМ йодида ингибитор НАДФН-оксидазы дифенил propionium (ДОИ) разводят в HBSS в клетки в 900 мкл HBSS в стеклянным дном блюда, иинкубировать в течение 10 мин.
  6. Начните приобретение и добавить зимозаном, как описано выше (шаг 2.7). Через 15 мин фагоцитоза, добавить 10 мкл 10 мкМ V-АТФазы ингибитора concanamycin A (CONCA), разбавленный в HBSS и продолжают визуализации в течение дополнительных 15 мин.

4. Анализ

  1. Анализ покадровой фильмов и фагосомы снимков.
    Примечание: Следующие инструкции являются специфическими для ImageJ. Шаг за шагом инструкции могут широко варьироваться в зависимости от используемого программного обеспечения, но функции, описанные в этом разделе, доступны в большинстве профессиональных программ для анализа изображений.
    1. Откройте изображение с профессиональным программным обеспечением для анализа изображений. Вычтите фон в 490 канала, рисуя небольшую квадратную ROI с квадратной инструмент выбора многоугольника в области, где нет никаких клеток и нажав Плагины> BG вычитание из ROI. Тогда загрузите же ROI на 440 канала, нажав кнопку Изменить> Выбор> Восстановить выделенные и повторите.
    2. Сделайте соотношение 32-битное изображение в 490 канала, деленная на 440 канала, нажав процесса> Image Calculator ..., выбрав соответствующие изображения в раскрывающихся меню Image1 и image2, выбрав 'Divide' в раскрывающемся меню Операция и проверки результатов флажок 32-бит (с плавающей точкой).
    3. Изменение справочной таблицы цвета кодирования в колоризации отношение-совместимый, нажав на изображение> таблицы поиска> Радуга RGB. Порог отношение изображения по ликвидации 0 и бесконечность пикселей, нажав изображение> Adjust> Threshold .... Отрегулируйте полосы прокрутки, так что зимозан отображается красным цветом и нажмите кнопку Применить, убедившись, что набор фоновых пикселей флажок NaN в выборе.
    4. Добавьте к этому отношение стек с каналом ярко-поля в многоканальной композита, нажав изображение> Цвет> Объединить каналы, и выбора изображения ярко-поля в меню серым выпадающего канала и отношение изображения в выпадающем меню зеленый коридор, и выбравДержите исходные изображения флажок. Сканирование покадровой фильмы или снимки, чтобы определить, который фагосомы которые должны быть проанализированы. Канал ярко-поле полезно для этого.
    5. Нарисуйте регионы процентной (ROI), используя овальную полигон инструмент выбора вокруг фагосом, и добавить их к менеджеру ROI, нажав Анализ> Инструменты> Диспетчер ROI> Добавить. Измерьте их отношение зимозаном интенсивности, нажав Дополнительно> Multi-Мера и де-выбору одной строке на срез флажке.
    6. Для покадровой фильмы, трек Фагосомы по одному, опираясь окупаемости инвестиций, набрав Ctrl + M, чтобы измерить каждый момент времени, и перемещение ROI, когда необходимо отслеживать значения интенсивности в течение долгого времени. Скопируйте измерения в окне результатов в программное обеспечение электронной таблицы.
      Примечание: Анализ 15 (5 времени курсов в эксперименте х 3) независимых экспериментов является идеальным, но более или менее может потребоваться в зависимости от изменчивости наблюдается. Сохранение трансформирования всегда рекомендуется. Некоторые программные пакеты позволяют изображения RegiStration и динамическое обновление трансформирования, облегчая эту часть анализа.
  2. Переход от флуоресценции в значениях рН
    1. Измерьте соотношение 490/440 для фагосом в калибровочных покадровой фильмов, как описано в разделе 4.1.
    2. В таблице, участок значения соотношения с течением времени, и вычислить средние значения соотношении от всех фагосомах в поле зрения (обычно, 5-20) от 5 временных точках в пределах середине периода времени, соответствующего каждой калибровки рН решение. (Смотрите также красные коробки на рисунке 5а.)
    3. Участок эти средние значения 490/440 соотношение против фактического измеряемого рН. Комбинат по крайней мере 3 независимых калибровки в одном графике. Используйте статистическую или числовое пакет программного обеспечения для выполнения нелинейной регрессии (лучше подходит кривая), как правило, сигмоидальной уравнения.
      Примечание: Например, на рисунке 5В уравнение использовали сигмоидальной Больцмана [Y = Низ + ((верх-низ)/ (1 + EXP ((V50-Х) / Наклон))], где значения Y являются 490/440 отношения, Х являются значения рН и сверху, снизу, V50 и наклон параметры, рассчитанные с помощью программного обеспечения.
    4. Используйте полученное уравнение для преобразования значения соотношения рН.
      Примечание: Например, на фиг.5В уравнение получено для калибровочной кривой в присутствии азида натри 490/440 Коэффициент = 1,103 + [(2.89-1.103) / (1 ​​+ EXP ((6,993-рН) /0.9291)] . Решение для рН дает следующее уравнение: рН = 6,993 - 0,9291 * [Ln ((1,178 / (Коэффициент-1,103)) - 1))].

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ниже приведены представительные результаты эксперимента, где phagosomal рН первичных нейтрофилов мыши, выделенных из костного мозга дикого типа или Hvcn1 - / - мышей по сравнению. Для успешного эксперимента, важно, чтобы получить достаточное количество Фагосомы в поле зрения в течение всего срока действия покадровой фильма, избегая слишком много Фагосомы, которые впоследствии будут более трудно сегмента во время анализа изображений. Рисунок 1 показывает примеры хороших и п...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Хотя больше времени, чем альтернативных методов, таких, как спектроскопии и FACS, которые используют подобную стратегию использования конфиденциальной рН красителя в сочетании с целями, но измеряют среднее значение рН населением фагосом, микроскопия имеет ряд преимуществ. Первое, что внутренняя и внешняя связаны, но не усвоены, частицы могут быть легко отличить без добавления других химических веществ, таких, как трипанового синего или антител, чтобы утолить или обозначить внешние частицы, соответственно. Во-вторых, что...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы получают финансовую поддержку от Швейцарского национального научного фонда через операционный грант N° 31003A-149566 (для N.D.) и Благотворительный фонд сэра Джулса Торна за рубежом через субсидию для молодых исследователей (для P.N.).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Порошок Зимозан АSigma-AldrichZ4250Существуют различные поставщики
Флуоресцеин изотиоцианатSigma-AldrichF7250Различные поставщики существуют
антизимозанные антитела (Zymosan A Биочастицы опсонизирующего реагента)Life TechnologiesZ2850Sigma-Aldrich O6637 является эквивалентным продуктом. В качестве альтернативы можно использовать 25% сыворотку в качестве опсонизирующего реагента.
4-Аминобензойный гидразид (4-ABH)Santa Cruzsc-204107Токсичный, используйте перчатки, различные поставщики существуют
Дифенилениодония хлорид (DPI)Sigma-AldrichD2926Токсичный, используйте перчатки, различные поставщики существуют
Конканамицин А (ConcA)Sigma-Aldrich27689Токсичный, используйте перчатки, различные поставщики существуют
НигерицинСигма-ОлдричN7143Токсичный, используйте перчатки, различные поставщики существуют
Monensin EnzoALX-380-026-G001Токсичный, используйте перчатки, различные поставщики существуют
Фосфатный буферный раствор (PBS)Life Technologies14200-075Токсичный, используйте перчатки, различные поставщики существуют
баланс Хэнка солевой растворLife Technologies14025092Рингер сбалансированный раствор соли или другие прозрачные физиологические буферы могут быть замененным.
Карбонат натрия (Na2CO3)Sigma-AldrichS7795Существуют различные поставщики
2-(N-морфолино)этансульфоновой кислоты (MES)Sigma-AldrichM3671 Существуют различные провайдеры
4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-этансульфоновая кислота (HEPES)Sigma-AldrichH3375Существуют различные поставщики
N-метил-D-глюкамина (NMDG)Sigma-AldrichM2004 Существуют различные провайдеры
Этиленгликоль-бис(2-аминоэтиловый эфир)-N,N,N′,N′-тетрауксусная кислота (EGTA)Sigma-Aldrich3777Существуют различные поставщики
Tris(гидроксиметил)аминометан (Tris)Sigma-AldrichT1503 Существуют различные провайдеры
Хлорид калия (KCl)Sigma-AldrichP9333Существуют различные поставщики
Существует хлорид натрия (NaCl)Sigma-AldrichS7653Существуют различные поставщики
Существуют хлорид магния (MgCl2)Sigma-AldrichM8266Существуют различные поставщики
Абсолютный этанол (EtOH)Sigma-Aldrich2860Существуют
различные поставщикиЧашки Петри со стеклянным дном 35 мм (флюоводородные)World Precision InstrumentsFD35-100Ибиди-прозрачные чашки или покровные стекла с соответствующими камерами визуализации могут быть обеспечены
Ультразвуковая водяная баняO. Kleiner AGВместо этого можно использовать ультразвуковую баню, существуют различные поставщики инструментов
ГемоцитометрMarienfeld GmbHСуществуют
различные поставщики инструментовШирокоугольный микроскоп для визуализации в реальном времениCarl Zeiss AGСуществуют различные поставщики инструментов, но микроскоп должен быть способен отображать возбуждение/излучение в соотношении 440/535 и 490/535. Конфокальные установки с вращающимся диском и возможностями яркого поля могут быть заменены, но зимозан имеет тенденцию чаще выходить из фокуса.  
Перистальтический насос (Dynamax RP-1)RaininСуществуют различные поставщики приборов
Schott Gerate GmbHСуществуют различные поставщики приборов Ручной
счетчикMilian SAСуществуют различные поставщики приборов

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yeung, T., Grinstein, S. Lipid signaling and the modulation of surface charge during phagocytosis. Immunol Rev. 219, 17-36 (2007).
  2. Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. The cell biology of phagocytosis. Annu Rev Pathol. 7, 61-98 (2012).
  3. Fairn, G. D., Grinstein, S. How nascent phagosomes mature to become phagolysosomes. Trends Immunol. 33 (8), 397-405 (2012).
  4. Nunes, P., Demaurex, N., Dinauer, M. C. Regulation of the NADPH oxidase and associated ion fluxes during phagocytosis. Traffic. 14 (11), 1118-1131 (2013).
  5. Binder, B., Holzhutter, H. G. A hypothetical model of cargo-selective rab recruitment during organelle maturation. Cell Biochem Biophys. 63 (1), 59-71 (2012).
  6. Hurtado-Lorenzo, A., et al. V-ATPase interacts with ARNO and Arf6 in early endosomes and regulates the protein degradative pathway. Nat Cell Biol. 8 (2), 124-136 (2006).
  7. Weisz, O. A. Acidification and protein traffic. Int Rev Cytol. 226, 259-319 (2003).
  8. Huynh, K. K., Grinstein, S. Regulation of vacuolar pH and its modulation by some microbial species. Microbiol Mol Biol Rev. 71 (3), 452-462 (2007).
  9. De Vito, P. The sodium/hydrogen exchanger: a possible mediator of immunity. Cell Immunol. 240 (2), 69-85 (2006).
  10. Moreland, J. G., Davis, A. P., Bailey, G., Nauseef, W. M., Lamb, F. S. Anion channels, including ClC-3, are required for normal neutrophil oxidative function, phagocytosis, and transendothelial migration. J Biol Chem. 281 (18), 12277-12288 (2006).
  11. Winterbourn, C. C., Kettle, A. J. Redox reactions and microbial killing in the neutrophil phagosome. Antioxid Redox Signal. 18 (6), 642-660 (2013).
  12. Seredenina, T., Demaurex, N., Krause, K. H. Voltage-Gated Proton Channels as Novel Drug Targets: From NADPH Oxidase Regulation to Sperm Biology. Antioxid Redox Signal. , (2014).
  13. Kotsias, F., Hoffmann, E., Amigorena, S., Savina, A. Reactive oxygen species production in the phagosome: impact on antigen presentation in dendritic cells. Antioxid Redox Signal. 18 (6), 714-729 (2013).
  14. Grimm, M. J., et al. Monocyte- and macrophage-targeted NADPH oxidase mediates antifungal host defense and regulation of acute inflammation in mice. J Immunol. 190 (8), 4175-4184 (2013).
  15. West, A. P., et al. TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS. Nature. 472 (7344), 476-480 (2011).
  16. Bloomfield, G., Pears, C. Superoxide signalling required for multicellular development of Dictyostelium. J Cell Sci.. 116 (Pt 16), 3387-3397 (2003).
  17. Ramsey, I. S., Moran, M. M., Chong, J. A., Clapham, D. E. A voltage-gated proton-selective channel lacking the pore domain. Nature. 440 (7088), 1213-1216 (2006).
  18. El Chemaly, A., Demaurex, N. Do Hv1 proton channels regulate the ionic and redox homeostasis of phagosomes? Mol Cell Endocrinol. 353 (1-2), 82-87 (2012).
  19. El Chemaly, A., Nunes, P., Jimaja, W., Castelbou, C., Demaurex, N. Hv1 proton channels differentially regulate the pH of neutrophil and macrophage phagosomes by sustaining the production of phagosomal ROS that inhibit the delivery of vacuolar ATPases. J Leukoc Biol. , (2014).
  20. Decoursey, T. E. Voltage-gated proton channels. Compr Physiol. 2 (2), 1355-1385 (2012).
  21. Ramsey, I. S., Ruchti, E., Kaczmarek, J. S., Clapham, D. E. Hv1 proton channels are required for high-level NADPH oxidase-dependent superoxide production during the phagocyte respiratory burst. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (18), 7642-7647 (2009).
  22. Sturgill-Koszycki, S., et al. Lack of acidification in Mycobacterium phagosomes produced by exclusion of the vesicular proton-ATPase. Science. 263 (5147), 678-681 (1994).
  23. Clemens, D. L., Lee, B. Y., Horwitz, M. A. Virulent and avirulent strains of Francisella tularensis prevent acidification and maturation of their phagosomes and escape into the cytoplasm in human macrophages. Infect Immun. 72 (6), 3204-3217 (2004).
  24. Alpuche-Aranda, C. M., Swanson, J. A., Loomis, W. P., Miller, S. I. Salmonella typhimurium activates virulence gene transcription within acidified macrophage phagosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (21), 10079-10083 (1992).
  25. Lukacs, G. L., Rotstein, O. D., Grinstein, S. Determinants of the phagosomal pH in macrophages. In situ assessment of vacuolar H(+)-ATPase activity, counterion conductance, and H+ 'leak'. J Biol Chem. 266 (36), 24540-24548 (1991).
  26. Watanabe, K., Kagaya, K., Yamada, T., Fukazawa, Y. Mechanism for candidacidal activity in macrophages activated by recombinant gamma interferon. Infect Immun. 59 (2), 521-528 (1991).
  27. Ip, W. K., et al. Phagocytosis and phagosome acidification are required for pathogen processing and MyD88-dependent responses to Staphylococcus aureus. J Immunol. 184 (12), 7071-7081 (2010).
  28. Clarke, M., Maddera, L. Phagocyte meets prey: uptake, internalization, and killing of bacteria by Dictyostelium amoebae. Eur J Cell Biol. 85 (9-10), 1001-1010 (2006).
  29. Jankowski, A., Scott, C. C., Grinstein, S. Determinants of the phagosomal pH in neutrophils. J Biol Chem. 277 (8), 6059-6066 (2002).
  30. Segal, A. W., Geisow, M., Garcia, R., Harper, A., Miller, R. The respiratory burst of phagocytic cells is associated with a rise in vacuolar pH. Nature. 290 (5805), 406-409 (1981).
  31. Savina, A., et al. NOX2 controls phagosomal pH to regulate antigen processing during crosspresentation by dendritic cells. Cell. 126 (1), 205-218 (2006).
  32. Rybicka, J. M., Balce, D. R., Chaudhuri, S., Allan, E. R., Yates, R. M. Phagosomal proteolysis in dendritic cells is modulated by NADPH oxidase in a pH-independent manner. EMBO J. 31 (4), 932-944 (2012).
  33. Mantegazza, A. R., et al. NADPH oxidase controls phagosomal pH and antigen cross-presentation in human dendritic cells. Blood. 112 (12), 4712-4722 (2008).
  34. Balce, D. R., Allan, E. R., McKenna, N., Yates, R. M. gamma-Interferon-inducible lysosomal thiol reductase (GILT) maintains phagosomal proteolysis in alternatively activated macrophages. J Biol Chem. 289 (46), 31891-31904 (2014).
  35. Sanjurjo, L., et al. The scavenger protein apoptosis inhibitor of macrophages (AIM) potentiates the antimicrobial response against Mycobacterium tuberculosis by enhancing autophagy. PLoS One. 8 (11), e79670(2013).
  36. Yuan, Z., Zhi, L., Li-Juan, Z., Hong-Tao, X. The Utility of Chloroquine in Cancer Therapy. Curr Med Res Opin. , 1-12 (2015).
  37. Ohkuma, S., Poole, B. Fluorescence probe measurement of the intralysosomal pH in living cells and the perturbation of pH by various agents. Proc Natl Acad Sci U S A. 75 (7), 3327-3331 (1978).
  38. El Chemaly, A., et al. VSOP/Hv1 proton channels sustain calcium entry, neutrophil migration, and superoxide production by limiting cell depolarization and acidification. J Exp Med. 207 (1), 129-139 (2010).
  39. Levine, A. P., Duchen, M. R., Segal, A. W. The HVCN1 channel conducts protons into the phagocytic vacuole of neutrophils to produce a physiologically alkaline pH. bioRxiv. , (2014).
  40. Al-Fageeh, M. B., Smales, C. M. Control and regulation of the cellular responses to cold shock: the responses in yeast and mammalian systems. Biochem J. 397 (2), 247-259 (2006).
  41. Yui, N., et al. Basolateral targeting and microtubule-dependent transcytosis of the aquaporin-2 water channel. Am J Physiol Cell Physiol. 304 (1), C38-C48 (2013).
  42. Griffiths, G. On phagosome individuality and membrane signalling networks. Trends Cell Biol. 14 (7), 343-351 (2004).
  43. Poburko, D., Santo-Domingo, J., Demaurex, N. Dynamic regulation of the mitochondrial proton gradient during cytosolic calcium elevations. J Biol Chem. 286 (13), 11672-11684 (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

ZymosanFITCpH

Похожие статьи