Методическая статья

Лазерная захвата микродиссекция человеческого эпителия простаты для анализа РНК

DOI:

10.3791/53405

⸱

26 ноября 2015 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, University of Illinois at Chicago, 2Department of Periodontics, University of Illinois at Chicago

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Целью этого протокола является использование микродиссекции лазерного захвата в качестве эффективного метода выделения чистых популяций типов клеток из гетерогенных тканей предстательной железы для последующего анализа РНК.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Предстательная железа содержит гетерогенную среду стромальных, эпителиальных, нейроэндокринных и иммунных типов клеток. Здоровая предстательная железа состоит из фиброзно-мышечной стромы, окружающей дискретные секреторные просветы, выстланные эпителием, и очень небольшую популяцию иммунных и нейроэндокринных клеток. Напротив, участки рака предстательной железы имеют повышенный диспластический люминальный эпителий со значительно сниженной или отсутствующей стромальной популяцией. Учитывая глубокую разницу между стромальными и эпителиальными типами клеток, крайне важно разделять типы клеток для любого типа последующего молекулярного анализа. Несмотря на эти знания, большая часть исследований экспрессии генов сравнивает доброкачественную простату с раком без микродиссекции, что приводит к смещению стромы в доброкачественных образцах. Микродиссекция с лазерным захватом (LCM) является эффективным методом физического выделения различных типов клеток из среза образца. Цель этого протокола состоит в том, чтобы показать, что РНК может быть успешно выделена из собранного с помощью LCM эпителия предстательной железы человека и использована для последующих исследований экспрессии генов, таких как ОТ-кПЦР и РНКсеквенирование.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Предстательная железа является гетерогенным ткани состоят из секреторного эпителия расположены в железистой ацинусов окружении фиброзно-мышечной стромы, состоящей в основном из гладких мышц 1. Эпителиальный отсек состоит из пяти разных, но организованных типов клеток: базальных клеток, клеток, секреции нейроэндокринных клеток, транзитные делящиеся клетки и стволовые клетки 2. При раке предстательной железы (РПЖ), который возникает из просвета эпителиальных клеток, рост аденокарциномы вызывает очевидный прогрессирующее снижение стромальных купе 3. По этим причинам, образцы ткани будет четкие различия в соотношении стромальных и эпителиальных клеток типа на основе степени РПЖ. Эти различия могут привести к необъективным предположений данных экспрессии генов, полученных из целых тканей без учета микродиссекции нужного типа клеток. Таким образом, чтобы удалить это смещение очень важно, чтобы отделить клеточные типы до экстракции РНК иАнализ экспрессии генов.

Macrodissection или микродиссекции могут быть использованы для физического отделения хорошо охарактеризованных эпителиальные области от окружающей стромы 4 -6. Macrodissection обычно делается с лезвием под микроскопом рассекает и работает хорошо для разделения большого РПЖ узелки из стромы, но не способен удалять доброкачественные эпителий от окружающих стромы (см пример доброкачественной гистологии простаты на рисунке 1). Микродиссекция с помощью лазера (LCM) является значительно более трудоемким, чем macrodissection, но может очень точно анализировать доброкачественной эпителия 4.

Последние публикации из нашей лаборатории показали, что РНК может быть успешно извлечены из LCM либо фиксированных формалином парафин (FFPE) биопсии или замороженной ткани 4,7-9. Основные проблемы в добыче LCM-РНК являются: 1) точно анализировать нужные участки ткани, и 2), чтобы сохранить RЦелостность Н.А. во время LCM и изоляция технологического 4,10. РНК, выделенной из клеток чистых популяций могут быть использованы для анализа экспрессии генов несколькими способами, включая обратной транскрипции количественной ПЦР (RT-КПЦР) 7,8, 11, микрочипов и глубокой характерны чередования 12-14.

Цель этого протокола заключается в изоляции общей РНК из LCM железы эпителия из замороженной ткани для выражения ниже по течению гена анализов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все ткани человека, используемые для этих экспериментов были приобретены через утвержденным протоколом Экспертный совет и / или освобождения в Университете штата Иллинойс в Чикаго.

1. Раздел Свежезамороженная простаты на ПЕН-слайд и на заряженных стекло

  1. Накануне или за несколько часов до секционирования образца, чистые инструменты (например, кисти, пинцеты, coplins, лезвия, ручка-слайдов в (если уже не РНКазы), А.Н. этанола безопасно маркер и карандаш) и внутри RT криостат с РНКазы обеззараживания раствор, используя распылитель и лабораторного салфетки.
    1. Разрешить РНКазы обеззараживания решение сидеть в течение 5 мин, затем вытирая, промыть depcH 2 0, чтобы удалить оставшиеся РНКазы обеззараживания решение и окончательный промыть с 70% этанола (приготовленные depcH 2 0).
      Примечание: Очень важно, чтобы поддерживать РНКазы рабочее пространство. Все coplins, инструменты, замороженные монтажа средние, лезвия и горки, используемые должны быть использованы только для свободного работы РНКазыи никогда не используется в стандартной без РНКазы свободной среде. Все инструменты должны быть обработаны с дезактивации решения РНКазы перед каждым экспериментом.
  2. Холодный криостата до -24 ° С.
  3. Место следующие очищенные РНКазы инструментов внутри криостата для охлаждения, по меньшей мере за 30 мин до секционирования: слайд-Коплин заполнены 100% этанола, инструмент, небольших кассет замороженной ткани и монтажной патрона.
  4. Получить замороженные ткани простаты от cryostorage и места в сухой лед-заполненные пеной ведро для транспортировки. Поместите ткань в криостат, чтобы уравновесить в КРИОСТАТ температуру, по крайней мере 30 мин.
    Примечание: Ткани человека простаты для лазерной захвата микро-рассечение может быть свежезамороженной или формалином фиксированной в парафин (FFPE). Временные ограничения и подготовка слайд немного отличаются между источниками ткани. Здесь мы опишем шаги, необходимые для замороженных срезов.
  5. Работа с одной ткани, в то время, и наглец замороженные монтажную среду в Bottoм кассеты и быстро монтировать замороженные ткани простаты в замороженном монтажа среде с использованием охлажденной щипцы.
  6. Поместите кассету с тканью на чиллер в криостат в течение 5 мин, чтобы установить замороженные монтажную среду.
  7. Шприц небольшое количество замороженной монтажной среды на патрон и осторожно нажать установлен ткани нижнюю сторону вверх на замороженных монтажной среды. Пусть установлен в криостате в течение 5 мин, чтобы позволить замороженный монтажа от среднего до полного затвердевания.
  8. Поместите патрон в держатель и затяните.
  9. Блокировка ручку в запертом положении и поместите новое лезвие на криостата. Для последующих молекулярных конечных точек, которые включают стадии амплификации (т.е. КПЦР) целесообразно использовать новое лезвие для каждого пациента, чтобы предотвратить загрязнение (или переместить лезвие над использовать площадь лопасти для следующего образца).
  10. Разблокировать ручку и осторожно продвигать ткань вручную или с помощью педали, чтобы выровнять и выставить ткани с 50 цм разделы нужной экспозиции ткани достигается.
  11. Отрегулируйте криостат до 5 мкм, вырезать одну или две секции и разместить их на заряженной стекло для гематоксилином и эозином (Н & Е) окрашивания (см шаг 2).
  12. Сразу же место скольжение в холодную 100% этаноле в течение 2 мин.
  13. Извлеките заряженный предметное стекло из этанола и дайте ему высохнуть при комнатной температуре, прежде чем приступить к Н & Е окрашивания (шаг 2).
  14. Поместите RT ПЕН-кадра слайд на раме кормильца.
  15. Отрегулируйте криостат до 10 мкм разделов и место на раме слайдов РТ PEN. От одного до четырех разделов может быть места на каждом слайде в зависимости от размера ткани.
  16. Сразу погрузить слайд в холодную 100% этаноле в течение 2 мин.
  17. Снимите PEN-кадров слайды из этанола и не хранить слайд в слайд-поле в эксикаторе поле в -80 ° C морозильнике до готовности для LCM. Три дня это максимальное время хранения для оптимального восстановления РНК.
  18. Перейдите на Шаг 2 для ТОЛЬКО взимается стекло скользнуле. Перейдите на Шаг 3 для PEN-кадра слайда.

2. гематоксилином и эозином-Y (Н & Е) для гистологического пятно наценка

Примечание: если для этой ткани на заряженную стекло и НЕ ПЕН-кадр слайд для LCM.

  1. Гидрат секции на заряженном стекло погружением слайдов через градуированного этанола следующим образом: окунуть слайде два раза в 100% этаноле в течение 3 мин, два раза в 95% этаноле в течение 3 мин, один раз в 70% этаноле в течение 3 мин и два раз в дистиллированной H 2 O в течение 3 мин.
    1. Подготовьте кислоты спиртовой раствор: 99 мл 70% этанола + 1 мл 1% HCl и 0,1% раствором бикарбоната натрия: 0,1 г бикарбоната натрия в 100 мл дистиллированной H 2 O
  2. Погрузите слайд в гематоксилин Gill II (0,4%) в течение 5 мин.
  3. Смыть лишнюю пятно в устойчивом струей H 2 O в течение 3 мин.
  4. Погрузите слайд 10 раз в кислой алкоголя
  5. Вымойте слайд в проточной H 2 O в течение 3 мин.
  6. Погрузите слайдв 0,1% раствором бикарбоната натрия в течение 30-60 сек, чтобы включить пурпурно синий цвет.
  7. Вымойте слайд в проточной H 2 O в течение 3 мин.
  8. Промыть слайд в 95% этаноле с 10 провалов.
  9. Погрузите слайд в эозином-Y 2-3 раза для общей 15 сек.
  10. Дегидрировать слайд через этанола градуированной следующим образом: Погрузите слайд два раза в 95% этаноле, два раза в 100% этанола, и два раза в ксилоле (убедитесь, что ткань становится ясно, что указывает на полное обезвоживание).
  11. Установите слайд с неводной постоянного жесткого монтажа среднего и крышкой скольжения.
  12. Пусть слайд высохнуть в течение 30 мин.
  13. Сканирование слайдов с любым всей слайд сканера и печати большого, изображения с высоким разрешением на 8 "х 11" бумаги.
  14. Габаритные зон (как правило, осуществляется с помощью сертифицированных патологоанатом борту) с маркером. Эта разметка является руководство для процедуры LCM.

3. Толуидин Голубой Окрашивание ПЕН-каркасных Слайды

Примечание: Thявляется делается в тот же день в LCM. Используйте depcH 2 O воду для всех решений. Заполните все шаги в РНКазы свободной площади. Все coplins должны быть очищены от РНКазы очищающего раствора.

  1. День LCM удалить ПЕН-кадров слайды из -80 ° C морозильника и гидрата по пологой горки в 90% этанола в течение 2 мин, затем 75% этанола в течение 2 мин.
    1. Подготовьте 0,5% толуидинового синий растворением в воде молекулярного биологии класса, то фильтр стерилизовать через фильтр и хранят 0,2 мкм при комнатной температуре. Этот раствор может быть повторно использован в течение 6 месяцев. Примечание: Настоятельно рекомендуется подготовить решение до, как фильтрация может занять несколько ч.
  2. Пятно ткани простаты пологие горки в 0,5% толуидиновым синим в течение 5-30 сек. Destain ткани путем промывки слайды 2 раза в depcH 2 O в течение 15 сек с последующим 75% этанола в течение 30 сек до 3 мин. Примечание: пятно и destain раз можно регулировать, чтобы обеспечить хорошую окрашивание. Простаты, как правило, в течение пятно.
    3. Перевести ПЕН-кадров слайды РНКазы свободной сухой контейнер на льду.

4. Лазерная захвата микро-рассечение (LCM)

  1. Непосредственно перед LCM, сухой слайд на слайде теплее при 42 ° С в течение 15 мин. Сухая только слайд, который будет обработан и не храните отдых на льду, пока к ним готовы.
  2. Включите компьютер и LCM в указанном порядке, силового микроскопа, ключ лазерного, лазерной переключателя, а затем компьютер. Запустите программу Лазерная микродиссекции.
  3. Используйте программное обеспечение для управления микроскопом, чтобы загрузить слайды и сбора трубы. Нажмите на "держатель образца выгрузки", загрузите слайд с секциях на держатель слайдов микроскопа с тканью вниз и вставьте держатель слайдов в соответствующий слот в микроскоп, то нажмите кнопку "Продолжить".
    1. Нажмите на кнопку "пробирок выгрузки", этикетки и нагрузка 0,5 мл трубки на держатель трубки и вставьте его в соответствующее гнездо в приборе. однаждыколпачки закреплены, добавить 35 мкл буфера для лизиса на шапки сбора и попытаться избежать пузырей. Затем нажмите кнопку "OK".
      Примечание: Если испарение вопрос, разбавить буфер следующим образом: 25 мкл буфера для лизиса с 10 мкл depcH2O.
  4. В программном обеспечении, выберите позицию, где слайд был помещен в держатель слайдов. Выберите сбора крышку, чтобы собирать LCM образца.
  5. Визуализировать и сосредоточиться слайд через компьютер на 10X. Используйте программное обеспечение для калибровки лазера, выбрав "Laser", а затем "калибровки". Отрегулируйте мощность, диафрагму и лазера, выбрав "лазерный", а затем "Управление", чтобы лазерный луч, чтобы сократить площадь выбранного полностью и эффективно. Повторите регулировку до тех пор, лазерных сокращений полностью через ткань.
  6. Использование 8 "х 11" патологоанатома наценка в качестве руководства, используйте "нарисовать форму" инструмент для ограничить желаемых областей epitheлиево в целях сбора и избежать любой стромы.
    Примечание: Несколько районов могут быть выбраны в течение одного зрения, но не перейти к другой точке зрения, не первый резки, нажав кнопку "вырезать форму" инструмент.
    1. Если область не получает полностью отрезаны лазером использовать "двигаться и сократить" инструмент, чтобы пойти на него вручную. Продолжать движение цели к новым видом и повторить лазерную резку, пока слайд не будет полностью рассеченные или желаемое количество ткани была собрана (типично 100 доброкачественные желез дают 150-500 нг РНК). (см пример на рисунке 1А).
  7. Осторожно снимите трубки из держателя сбора и закрыть крышки, памятуя о буфере для лизиса и ткани в шапках. Кратко центрифуги в течение 30 сек, чтобы собрать жидкость и ткани в нижней части трубы. Инкубируйте образцы при 42 ° С в течение 30 мин и хранят при -80 ° С до готовности для выделения РНК.

5. Общая Выделение РНК с Filтер на основе набора и анализа качества

  1. Оттаять пробирки на лед, и довести объем раствора до 100 мкл.
  2. Предварительно смочите микро фильтр комплекта изоляции РНК, применяя 30 мкл ofLysis решение к центру фильтра и дайте ему впитаться whileperforming следующие два шага (по крайней мере, 5 мин).
  3. Добавить 3 мкл раствора LCM добавки (входящую в комплект поставки) к лизата и смешать встряхиванием в течение 5 сек. Центрифуга в течение 30 сек, чтобы собрать жидкость на дне пробирки.
  4. Центрифуга предварительно смачивают фильтр для ~ 30 сек при максимальной скорости, чтобы удалить жидкость.
  5. Добавить 1,25 объемов (в данном случае 129 мкл) 100% этанола в смеси лизата, осторожно вихрь или пипетки вверх и вниз. ** Этот метод восстановления больших и малых видов РНК.
  6. Загрузить образец на предварительно смоченный микрофильтр и центрифуге при 10000 х г в течение 1 мин, чтобы связать РНК к фильтру. Затем промыть фильтр микро 180 мкл "промывочного раствора 1, R21; центрифуги при 10000 мкг в течение 1 мин.
    Примечание: С этого момента все центрифугирования должно быть сделано при 13000 мкг, или максимальной скорости.
  7. Вымойте фильтр дважды 180 мкл "решений мытья 2 и 3", соответственно, как указано в протоколе набора. Центрифуга в течение 30 сек, затем выбросить поток через, и спин фильтр в течение 1 мин для удаления остатков жидкости и высушить фильтр.
  8. Передача фильтр к новой пробирку.
  9. Теплый элюирование решение до -95 ° С (входит в комплект).
  10. Применение 10 мкл предварительно нагретую элюции раствора к центру фильтра, закрыть крышку и хранить в течение 5 мин при комнатной температуре. Тогда центрифуги в течение 1 мин, чтобы элюировать РНК, и повторить этот шаг один раз, чтобы получить ~ 20 мкл РНК.
  11. Выполнение обработки ДНКазой I в течение 15 мин при 37 ° С.
  12. Количественная РНК спектрофотометр с оптической плотности при 260 нм. Отношение оптической плотности при длине волны 260 нм и 280 нм используется для оценки чистотыРНК (табл 1) 15.

6. Анализ экспрессии генов

Примечание: экспрессии генов длинных видов РНК (мРНК и, как lncRNAs) показано в шаге 6.1 и коротких видов РНК (как микроРНК) показано в шаге 6.2. Различные наборы для RT-количественной ПЦР и количество РНК, необходимой варьируется в зависимости от комплекта (всего 10 нг). Анализ РНК последовательности описан в 6.3.

  1. Обратный Расшифруйте (RT) РНК в кДНК смешивания 5 мкл 20 нг / мкл образца РНК с 5 мкл смеси мастер-RT (RT буфера, дНТФ случайных праймеров, RT фермента, ингибитора РНКазы). Инкубируют реакционную смесь в течение 25 мин при 25 ° С, затем 120 мин при 37 ° С и 5 минут при 85 ° С.
  2. Развести реакции RT 1:10 РНКазы свободной воды и использовать 2,5 мкл за 10 мкл реакции КПЦР с праймерами или праймер / зонд наборы для интересующих генов.
    Примечание: Для облегчения анализа частично деградированных РНК Желательно использовать праймеры FOR короче ампликонов (менее 100 п.о.) 16. (Таблица 2B)
    1. Для анализа экспрессии микроРНК проведение реакции RT путем смешивания 5 мкл 2-10 нг / мкл образца РНК с 5 мкл смеси мастер-RT.
      Примечание: каждый коммерчески доступный ПЦР-технологии обнаружения микроРНК требует использования собственных и специфических праймеров RT.
  3. В качестве альтернативы или в дополнение к RT-PCR, используют следующего поколения последовательности (РНК-SEQ или малые РНК-SEQ) количественно различных видов РНК. Как правило, используют 500 нг РНК для этой процедуры (Таблица 3) и осуществления способа, как указано изготовителем и обнаружения инструмента.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В предыдущем исследовании мы показали, использование LCM собирать эпителиальные и стромальные ткани, чтобы сравнить выражение профилирования РТ-КПЦР мРНК и микроРНК из замороженных тканей и FFPE простаты от того же пациента 4. LCM является трудоемким, особенно если большое количество РНК должны быть собраны для анализа секвенирования следующего поколения. Поэтому, очень важно, чтобы рабочее пространство и инструменты РНКазы. Рекомендуется изучить качества и клеточно-специфичности управления в РНК, собранных (...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Экспрессия генов профилирования из человеческих образцов может быть сложным, не только для качества или количества ткани доступной, но и для различных гистологических лиц, присутствующих в данной ткани образца. Это особенно сложно в простате, в котором доброкачественные ткани в значительной степени из жировой ткани и области рака лишены стромы. LCM облегчает физическое разделение железы стромы и эпителия РНК для более точного подписью двух различных типов клеток (Фигура 1А). По сравнению с macrodissecti...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим доктора Вики Масиас, Анджелину Джангреко и Авани Вайшнав за помощь в оптимизации этой методологии на протяжении многих лет, а также Ян Чжана и доктора Цзянь Ма из Университета Иллинойса в Урбане-Шампейне за анализ секвенирования РНК. Эта работа была поддержана NIH/NCI R01 CA166588-01 (Nonn), American Cancer Society Research Scholar 124264-RSG-13-012-01-CNE (Nonn), NIH/NCI R03 CA172827-01 (Nonn), премией DOD-CDMPR PRCP Health Disparities Idea Award PC121923 (Nonn) и грантом Фонда профилактики рака (Zhou).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
РНаза-ПРОЧЬ MBP7005-11
PEN-мембрана 4,0 мм слайды Leica11600289
Стеклянные слайды, Superfrost PlusFisherBrand12-550-15
Этанол 200 proofDecon labs.2701
DEPC (диэтилпирокарбонат)SigmaD-5758
CryostatLeicaCM3050
Коплины (Банка для окрашивания)IHCWORLDM900-12
Коплины (Штатив для окрашивания)IHCWORLDM905-12
Aperio ScanScopeAperio(Leica)ScanScope®
Toluidine BlueFluka89640-5G
Лазерная система микродиссекцииLeicaLMD7000
0,5 мл Тонкостенные пробирки для LCMThermo ScientificAB-0350
RNAqueous®-Micro Набор для выделения общей РНКAmbionAM1931Thermo Fisher Scientific Brand
NanoDropThermo ScientificND-1000
Qubit 2.0 ФлуориметрLife TechnologiesQ32866Thermo Fisher Scientific
Brand Высокоемкий набор для обратной транскрипции кДНКApplied Biosystems4368814Thermo Fisher Scientific Brand
Универсальный набор для синтеза кДНК II, 8-64 rxnsExiqon203301
TaqMan набор микроРНК RT AppliedBiosystems4366597Thermo Fisher Научная марка
Гематоксилин морилка  Рикка Кемикал Компани3536-16
Эосин-И Ричард АлланНаучный 7111
CS

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schauer, I. G., Rowley, D. R. The functional role of reactive stroma in benign prostatic hyperplasia. Differentiation. 82, 200-210 (2011).
  2. Peehl, D. M. Primary cell cultures as models of prostate cancer development. Endocrine-related cancer. 12, 19-47 (2005).
  3. McNeal, J. E., Haillot, O. Patterns of spread of adenocarcinoma in the prostate as related to cancer volume. The Prostate. 49, 48-57 (2001).
  4. Nonn, L., Vaishnav, A., Gallagher, L., Gann, P. H. mRNA and micro-RNA expression analysis in laser-capture microdissected prostate biopsies: valuable tool for risk assessment and prevention trials. Experimental and molecular pathology. 88, 45-51 (2010).
  5. Long, Q., et al. Global transcriptome analysis of formalin-fixed prostate cancer specimens identifies biomarkers of disease recurrence. Cancer research. 74, 3228-3237 (2014).
  6. Long, Q., et al. Protein-coding and microRNA biomarkers of recurrence of prostate cancer following radical prostatectomy. The American journal of pathology. 179, 46-54 (2011).
  7. Giangreco, A. A., et al. Differential expression and regulation of vitamin D hydroxylases and inflammatory genes in prostate stroma and epithelium by 1,25-dihydroxyvitamin D in men with prostate cancer and an in vitro. model. The Journal of steroid biochemistry and molecular biology. , (2014).
  8. Giangreco, A. A., et al. Tumor suppressor microRNAs, miR-100 and -125b, are regulated by 1,25-dihydroxyvitamin D in primary prostate cells and in patient tissue. Cancer prevention research. 6, 483-494 (2013).
  9. Mihelich, B. L., et al. miR-183-96-182 cluster is overexpressed in prostate tissue and regulates zinc homeostasis in prostate cells. The Journal of biological chemistry. 286, 44503-44511 (2011).
  10. Bevilacqua, C., Makhzami, S., Helbling, J. C., Defrenaix, P., Martin, P. Maintaining RNA integrity in a homogeneous population of mammary epithelial cells isolated by Laser Capture Microdissection. BMC cell biology. 11, 95(2010).
  11. Gregg, J. L., Brown, K. E., Mintz, E. M., Piontkivska, H., Fraizer, G. C. Analysis of gene expression in prostate cancer epithelial and interstitial stromal cells using laser capture microdissection. BMC cancer. 10, 165(2010).
  12. Hart, M., et al. Comparative microRNA profiling of prostate carcinomas with increasing tumor stage by deep sequencing. Molecular cancer research : MCR. 12, 250-263 (2014).
  13. Smalheiser, N. R., Lugli, G., Thimmapuram, J., Cook, E. H., Larson, J. Endogenous siRNAs and noncoding RNA-derived small RNAs are expressed in adult mouse hippocampus and are up-regulated in olfactory discrimination training. Rna. 17, 166-181 (2011).
  14. Song, C., et al. Expression profile analysis of microRNAs in prostate cancer by next-generation sequencing. The Prostate. 75, 500-516 (2015).
  15. Deng, M. Y., Wang, H., Ward, G. B., Beckham, T. R., McKenna, T. S. Comparison of six RNA extraction methods for the detection of classical swine fever virus by real-time and conventional reverse transcription-PCR. Journal of veterinary diagnostic investigation : official publication of the American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians, Inc. 17, 574-578 (2005).
  16. Kong, H., et al. Quantitative assessment of short amplicons in FFPE-derived long-chain RNA. Scientific reports. 4, 7246(2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

RNAseq

Похожие статьи