Этот метод оценивает инвазию раковых клеток из сфероидов в окружающую 3D-матрицу. Сфероиды генерируются методом культивирования висячих капель, а затем встраиваются в матрицу, состоящую из материалов базальной мембраны и коллагена I типа. В дальнейшем контролируется инвазия из сфероидов.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Раковая клетка Сфероид Анализ для оценки Invasion в 3D Настройка
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Считается, что инвазивный характер линий раковых клеток коррелирует с их метастатическим потенциалом. Большинство традиционных анализов, однако, не исследуют эти инвазивные особенности в трехмерной среде, и полученные данные страдают от ограниченной биологической применимости. Здесь представлен подход к визуализации инвазивной способности клеточных линий в физиологически значимых условиях. Анализ на инвазию сфероидов в раковые клетки сначала использует гравитацию для получения сфероидов в каплях среды, которые свисают с крышки чашки для клеточной культуры. Затем эти сфероиды встраиваются в 3D-матрицу, состоящую из смеси материалов базальной мембраны и коллагена I типа. Затем с течением времени контролируется выход раковых клеток из сфероидов в окружающий матрикс. Описанный здесь метод может быть модифицирован для изучения инвазии после кокультуры различных типов клеток, включения лекарств/ингибиторов или изменений в компонентах внеклеточного матрикса (ВКМ).
Введение
Установлено, что подвижность клеток рака является предиктором метастатическим потенциалом, учитывая, что такое поведение способствует вторжение через базальную мембрану и вступления в кровеносной системе 1. Большинство исследований по подвижности была сосредоточена на том, как клетки ведут двумерной установки (2D), хотя это становится широко признано, что движение клеток в трехмерной (3D) матрицы является более представительным, как эти же клеток фактически ведут себя в естественных условиях 2. Культура системы 3D все чаще используется для изучения клеточных поведения, которые варьируются от клеточной морфологии, кинетики роста в и лекарственной чувствительности 3. Желание контролировать инвазию раковых клеток в контексте 3D-среде привело к синтезу ранее установленных методов, включающих образование клеточных агрегатов 3D (сфероидов) с помощью метода культуры капля крови 4, с последующим встраивания этих сфероидов в 3D внеклеточного матрица (ЕCM), состоящий из коллагена и подвал мембранных материалов 5. Этот метод направлен на улучшение на этих ранее установленных методик, обеспечивая рациональный подход, который может быть легко использован для сравнения вторжение в различных экспериментальных условиях.
Более традиционные способы для оценки подвижности клеток в пробирке царапина заводом анализ и анализ Transwell 6. Бывший анализ показывает подвижность клеток в условиях 2D, и, следовательно, зависит от различных особенностей критических для вторжения в естественных условиях, например, протеазы деятельности 7. Transwell анализ может лучше модель сотового вторжение, когда скважина вставки покрыты ECM субстратов, но только один параметр, то есть внешний вид клеток на противоположной поверхности мембраны измеряется, и многие нюансы вторжения клеток, таким образом, не является очевидным. В отличие от этих методов, сфероида вторжения раковых клеток анализе (рисунок 1 </ STRONG>) позволяет в режиме реального времени мониторинг вторжения клеток в обстановке, которая не только физиологически необходимо, но также позволяет важные линии конкретных особенностей клеточных быть визуализированы, например, индивидуальный против коллектива миграции клеток 8. Этот метод дает также преимущества по сравнению со стандартными анализами 3D роста культуры. Поколение клеточных агрегатов через висит капельным методом изначально ограничивает движение клеток, так что клетки будут стимулы, чтобы вторгнуться после этого ограничение снято. Кроме того, как только что ограничение снято, сотовый выход будет проходить в одном направлении, которые затем могут быть легко количественно.
Самые популярные ECM материалы, используемые для раковых клеток СФЕРОИДОВ анализов являются Матригель и тип коллагена, где каждый из этих компонентов имеет важные и разные роли в оказании влияния на метастатическое поведение. Матригель является секретируется смесь белков, производимых саркомы Engelbreth-Хольм Рой мыши клеток, и обогащается в basemeнт мембранные белки, такие как ламинин, энтактин, и типа IV коллагена 9. По этой причине Матригель в дальнейшем упоминается как "базальной мембраны материалов". Эти базальной мембраны материалы обеспечивают существенные лигандов, необходимые для интегрина адгезии во инвазию раковых клеток 10 в дополнение ко многим другим белкам, которые оказывают различные эффекты на поведение клеток 11. Для сравнения, тип коллагена, обычно получают из кислотных гидролизатов сухожилий и других плотных коллагеновых структур 12, гораздо более простой матричный материал, который служит в качестве основного структурного элемента соединительной ткани и стромы поддерживает тканей и органов тела. Было показано, что физические характеристики коллагена может регулировать количество особенностей подвижности клеток; Например, выравнивание коллагеновых фибрилл на поверхности опухоли стромы-позволяет раковые клетки мигрируют по впоследствии этих фибрилл при вторжении в строму 13, В анализе, представленном здесь, и тип коллагена и подвал мембранных материалов используются в качестве инструментов для изучения 3D раковые клетки стромы-взаимодействий.
Эффект ингибирования или стимуляции путей, которые контролируют вторжение может контролироваться после клетки были встроены в 3D матрице. Клетки могут быть предварительно во время роста в висячей капли или при переходе на 3D-культуры, в зависимости от того, будет ли требовать длительным лечение модулировать вторжения. Для более коротких процедур, рекомендуется, что препарат можно смешивать с шаровидным подвески после сбора, а также в средствах массовой информации, которые будут окружать 3D-культур, по содействию адекватной экспозиции препарата с клетками. Далее, нормальные или ассоциированные с опухолью стромальные клетки могут быть смешаны с материалом матрицы, чтобы оценить их роль в модуляции вторжение опухолевых клеток, или чтобы определить, как и паракринная аутокринная поведение влияет клеточной сигнализации. Эта идея была показано в исследовании, где Совместное культивирование в седловинена рак и эндотелиальных клеток в висячей капли привело к сосудистой сети в сфероидов 14. Наконец, составляющие ECM также может быть изменена, а инвазию раковых клеток воздействию различных подложках 15. Метод, представленный ниже, таким образом, обеспечивают основу для оценки инвазии раковых клеток при различных условиях. В целом было установлено, что не все клеточные линии создаст сфероидов в висячей капли и эпителиальные вид клеточные линии, как правило, образуют правильные сферы.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Генерация сфероидов
- Подготовка одного суспензии клеток для подвешивания падение культуры путем отсоединения прилипшие раковых клеток культур ~ 70% слияния с использованием PBS мыть с последующим воздействием 0,05% раствора трипсина-ЭДТА.
- Нейтрализовать раствор трипсина с клеточной культуральной среде и считать клеток с использованием аликвоты клеточной суспензии. Примечание: Удельный среда культуры клеток будет зависеть от клеточной линии проходят испытания. Последующие АТСС медиа рекомендации, где среда культуры клеток, как правило, DMEM + 10% FBS. Более подробную информацию можно найти в таблице материалов.
- Выполнение разбавление, чтобы обеспечить посева 500-1000 клеток на 20 мкл каплей клеточной культуральной среде.
- Приобретение 10-см чашку и добавляют 5 мл стерильной PBS на на дно. Примечание: Этот шаг защищает висит падает от испарения. Более дешевых "бактериологические класса" посуду можно использовать вместо чашки для культивирования клеток класса, а клетки не будут продолжениедействовать поверхности культурального.
- Использование пипетки многоканальный передать 20 мкл капель разбавленной клеточной суспензии на внутренней поверхности крышки.
- Внесите 40 капель (5 строк 8 капель) на крышке 10 см блюдо.
- Обратить крышку и место над культуре блюдо. Инкубируйте чтобы капля культур при 37 ° С в течение 72 ч, чтобы генерировать сфероидов.
- Переверните крышку в уверенной, пока контролируемым образом. Примечание: Инверсия крышку слишком быстро или слишком медленно может привести капли меняться. Некоторые клеточные линии могут образовывать сфероиды в 48 часов или меньше, в то время как другие могут потребовать более 72 час, чтобы произвести компактные агрегаты.
2. Вложение сфероидов в 3D Matrix
- Разморозить аликвоту фактор роста снижается базальной мембраны материалов при 4 ° С в течение ночи перед вложением сфероидов.
- Дополнительно: Layer скважин с ECM заранее, чтобы предотвратить потенциальную взаимодействие сфероид с ткани cultuRe поверхности.
- Внесите 200 мкл на лунку ECM на 24-луночный планшет.
- Наклоните плиту для того, чтобы контроллер ЭСУД покрывает всю поверхность скважины.
- Осторожно удалить лишнюю ECM с пипеткой.
- Инкубируйте планшет до лунки, не являются сухими: 3 ч при комнатной температуре или в течение ночи при 4 ° С.
- Дополнительно: Layer скважин с ECM заранее, чтобы предотвратить потенциальную взаимодействие сфероид с ткани cultuRe поверхности.
- Соберите сфероидов, наклоняя крышку блюдо культуры ткани и объединения средств массовой информации. Перевести средства массовой информации с сфероидов в 1,5 мл микроцентрифужных трубки.
- Разрешить 10 мин для сфероидов, чтобы поселиться в нижней части трубки микроцентрифужных. Сфероиды должны быть видны на глаз.
- Смешать 100 мкл мембранных материалов подвал с 100 мкл холодного (4 ° С) Тип I коллагена в отдельном предварительно охлажденной трубки. Храните смесь при 4 ° С, чтобы предотвратить либо гель затвердевание преждевременно.
- Используйте предварительно охлажденные советы пипетки, если переноса небольших объемов.
- Дайте осторожность присмешивания базальной мембраны материалы и коллагена типа я, чтобы предотвратить образование пузырьков воздуха. Примечание: Воздушные пузырьки могут помешать визуализации позже в протоколе, если они стали встроенные в гель.
- Аспирируйте сфероидов из 40 мкл нижней части трубки микроцентрифужных, и в сочетании с базальной мембраной материалов / типа коллагена смесь. Будьте осторожны, чтобы предотвратить образование пузырьков воздуха при смешивании. Примечание: раствор, содержащий 100 мкл подвал мембранных материалов, 100 мкл коллагена типа I, и 40 мкл сфероидов создаст достаточно материала для 4-х независимых 3D культур. Это может быть расширена вверх или вниз.
- Пипеткой 40 мкл капли вязкой смеси в центрах скважин на 24-луночный планшет. Хранить цилиндрический уровень, чтобы предотвратить смесь проникнуть в сторону скважины. Примечание: один столбец на 24-луночного планшета - 4 скважины - рекомендуется для каждого состояния, подлежащего испытанию.
- Поместите пластину IntOA 37 ° С инкубатор и оставить в покое на 30 минут. 3D-культура будет полимеризоваться в течение этого периода.
- Медленно погрузить 3D культур в 1 мл клеточной культуральной среде.
- Убедитесь, что средства массовой информации теплая при добавлении его в лунки для дальнейшего продвижения полимеризации геля.
- Важным шагом: Осторожно добавить СМИ к 3D культур. Пипетки СМИ слишком быстро в лунки может привести к отряда 3D культур от поверхности ткани культуры.
3. Мониторинг и анализ сфероида вторжения
- Вторжение Изображение из сфероидов в окружающую 3D матрицы на временных точках решили следователем. Приобретение фотографии с использованием инвертированного микроскопа с 20-кратным объективом. Примечание: Идеальное моменты времени будут отличаться в зависимости от клеточной линии проходят испытания. Более инвазивные клеточные линии начнут свою эвакуацию из сфероидов вскоре после посева и, следовательно, принять первоначальный снимокс в течение нескольких часов после посева. Как правило, фотографии сделаны при 0 ч (после посева), 24 ч, 48 ч и. Вторжение обычно заключает от 24 до 48 ч после посева.
- Количественного инвазивной способности с использованием программного обеспечения для анализа изображений, как изображения J.
- Анализ вторжение как расстояние клеток от края сфероида.
- Используйте стрит Tool, чтобы отметить радиус и / или максимальный инвазивной расстояние.
- Нажмите "Анализ" в верхнем меню, а затем нажмите кнопку "Мера", чтобы отобразить измерения длины.
- Анализ вторжение в общей инвазивного области вне сфероида.
- Используйте Freehand Tool Рисование проследить границу эллипсоида и / или общей инвазивного области.
- Нажмите "Анализ" в верхнем меню, а затем нажмите кнопку "Мера", чтобы отобразить измерения площади.
- Используйте плагин как инструменты ROI Manager, чтобы создать измерения для стека изображений.
- Анализ вторжение как расстояние клеток от края сфероида.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Использование сфероида вторжения анализа (фиг.1), панель раковых клеточных линий испытывали на их способность к образованию сфероидов, а также на сумму клеток выхода выставлены после имплантации в 3D матрице, состоящей из базальной мембраны материалов и типа коллагена (Таблица 1). Эти результаты показывают, что не каждый рак линия создаст хорошо сформированные сфероидов, где клеточные линии, обладающие эпителиальных морфологию в пробирке, как правило, производят регулярные и гл...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Это исследование оценивали эффективность панели линий раковых клеток в сфероида вторжения анализа (таблица 1). Как правило, мы находим, что сфероид образование усиливается в более эпителиальных вид клеточных линий, где присутствие межклеточных соединений способствует формированию сфероид-как архитектуры. Известные клеточные линии, которые прошли в переход эпителиальных мезенхимальных, как MDA-MB-231 клеток не образуют сфероидов в висячей капли культуры наиболее вероятного из-за их снижения E-, N- и Р-ка...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Благодарности
Поддерживается NIH гранты P30 CA051008 и T32 CA009686 (ATR).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Matrigel Growth Factor Reduced | Corning | CB-40234 | |
| Коллаген типа I, Крысиный хвост, 100 мг | Millipore | 08-115 | |
| DMEM | Life Technologies | 11995-065 | |
| RPMI 1640 Medium | Life Technologies | 11875-093 | |
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| 0,05% трипсин-ЭДТА | Life Technologies | 25300-054 | |
| Фетальная бычья сыворотка, термоинактивированная | Omega Scientific | FB-12 | |
| 100 мм обработанная TC посуда | Corning Incorporated | 430167 | |
| 24-луночные пластины с TC-обработкой | NEST Линии Biotechnlology | 702001 | |
| Olympus IX-71 Inverted Microscope | |||
| Cell поддерживали в DMEM + 10% FBS, с расчетом на BT-474 и LNCaP клетки, которые содержали в RPMI + 10% FBS. |
Ссылки
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Metastasis: Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nat Rev. Cancer. 2 (8), (2002).
- Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions. J Cell Sci. 116 (12), 2377-2388 (2003).
- Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130 (4), (2007).
- Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. J Vis Exp. 51, (2011).
- Del Duca,, Werbowetski, D., T,, Del Maestro,, F, R. Spheroid preparation from hanging drops: characterization of a model of brain tumor invasion. J Neuro-Oncol. 67 (3), (2004).
- Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro cell migration and invasion assays. J Vis Exp. 88, (2014).
- Ramos-DeSimone, N., Hahn-Dantona, E., Sipley, J., Nagase, H., French, D. L., Quigley, J. P. Activation of matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) via a converging plasmin/stromelysin-1 cascade enhances tumor cell invasion. J Bio Chem. 274 (19), Forthcoming.
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nature Rev. Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
- Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: Basement membrane matrix with biological activity. Semin Cancer Biol. 15 (5), 378-386 (2005).
- Shaw, L. M., Chao, C., Wewer, U. M., Mercurio, A. M. Function of the integrin α6β1 in metastatic breast carcinoma cells assessed by expression of a dominant-negative receptor. Cancer Res. 56 (5), 959-963 (1996).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), (2010).
- Rajan, N., Habermehl, J., Coté, M. -F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nat Protoc. 1 (6), (2006).
- Provenzano, P. P., Eliceiri, K. W., Campbell, J. M. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Med. 4 (1), (2006).
- Timmins, N. E., Nielsen, L. K. Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method. Methods Mol Med. 140, 141-151 (2007).
- Brenner, W., Groß, S., Steinbach, F., Horn, S., Hohenfellner, R., Thüroff, J. W. Differential inhibition of renal cancer cell invasion mediated by fibronectin, collagen IV and laminin. Cancer Lett. 155, 199-205 (2000).
- Nieman, M. T., Prudoff, R. S., Johnson, K. R., Wheelock, M. J. N-cadherin promotes motility in human breast cancer cells regardless of their E-cadherin expression. J Cell Biol. 147 (3), Forthcoming.
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), (2013).
- Sodek, K. L., Brown, T. J., Ringuette, M. J. Collagen I but not Matrigel matrices provide an MMP-dependent barrier to ovarian cancer cell penetration. BMC Cancer. 8 (1), 223-2210 (2008).
- Nguyen-Ngoc, K. V., Ewald, A. J. Mammary ductal elongation and myoepithelial migration are regulated by the composition of the extracellular matrix. J Microsc. 251 (3), 212-223 (2013).
- Glinskii, A. B., Smith, B. A., Jiang, P., Li, X., Yang, M., Hoffman, R. M., Glinsky, G. V. Viable circulating metastatic cells produced in orthotopic but not ectopic prostate cancer models. Cancer Res. 63 (14), 4239-4243 (2003).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
