Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Хроматина иммунопреципитации для идентификации Arabidopsis взаимодействий белок-ДНК

20.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/53422

⸱

14 января 2016 г.

 ,  ,  , 
1Centro de Biotecnología y Genómica de Plantas (CBGP), Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (INIA)-Universidad Politécnica de Madrid

В этой статье

Краткое содержание

Иммунопреципитации хроматина является мощным средством для идентификации ДНК сайтов связывания белков Arabidopsis в естественных условиях. Это процедура включает в себя хроматина сшивание и фрагментации, иммунопреципитацию с селективными антител против белка интереса, и КПЦР анализ связанного ДНК. Мы опишем простой ChIP анализа, оптимизированный для Arabidopsis растений.

Аннотация

Сложные генные регуляторные сети организуют биологические процессы и переходы в развитии растений. Селективная активация транскрипции и сайленсинг генов опосредуют реакцию растений на сигналы окружающей среды и сигналы развития. Таким образом, понимание механизмов, контролирующих экспрессию генов растений, имеет важное значение для глубокого понимания того, как регулируются биологические процессы в растениях. Описанный здесь метод иммунопреципитации хроматина (ChIP) представляет собой процедуру идентификации ДНК-связывающих сайтов белков в генах или геномных областях модельного вида Arabidopsis thaliana. Взаимодействия с ДНК представляющих интерес белков, таких как факторы транскрипции, белки хроматина или посттрансляционно модифицированные версии гистонов, могут быть эффективно проанализированы с помощью протокола ChIP. Этот метод основан на фиксации белок-ДНК-взаимодействий in vivo, случайной фрагментации хроматина, иммунопреципитации комплексов белок-ДНК специфическими антителами и количественной оценке ДНК, ассоциированной с интересующим белком, методами ПЦР. Использование этой методологии у Arabidopsis внесло значительный вклад в раскрытие транскрипционных регуляторных механизмов, которые контролируют различные биологические процессы в растениях. Такой подход позволил идентифицировать сайты связывания белка хроматина Arabidopsis EBS с регуляторными областями мастер-гена цветущего FT. Влияние этого белка на накопление определенных гистоновых меток в геномной области FT также было выявлено с помощью анализа ChIP.

Введение

В последние годы целый ряд генетических, молекулярных и геномных инструментов были разработаны в модельных видов Arabidopsis THALIANA. Эта технология способствовала чрезвычайно прогресс в понимании того, как развитие растений регулируется. Среди изучаемых процессов развития с помощью арабидопсиса в качестве модели, генетического контроля времени цветения широко проанализированы. Эти исследования показали, что растения модулировать очень точно время цветения в ответ на эндогенные сигналы, такие как гормоны и возраста растения, а также охраны окружающей среды сигналов, таких как фотопериода и температуры, которые синхронизируют цветущих время с естественным циклом времен года 1, 2. Выделение и характеристика мутантов Arabidopsis с изменениями в пору цветения был определяющим в раскрытии сложную сеть генов, которые регулируют время цветения в ответ на эндогенные и экологических факторов. Эти генетические схемы являютсяинтегрированы на уровне нескольких мастер-генов, которые действуют как переключатели цветения, а точные сроки начала цветочным зависит от баланса цветения поощрения и подавляя деятельность, которые работают вверх цветочных генов интеграторов 1,3.

Функциональная характеристика генов, идентифицированных за их роль в контроле цветения начала, опираясь на недавно использования геномных подходов, выявили центральную роль в регуляции транскрипции модуляции времени цветения. В самом деле, многие из мастер-генов цветения кодирования факторов транскрипции 4. Кроме того, ряд хроматина белковых комплексов влиять на экспрессию генов мастер цветения. Ряд Arabidopsis мутантов, выделенных для их измененной время цветения оказалось проводить мутации в генах, кодирующих различные модификаторы хроматина. Различные ремонтом хроматина, которые вводят посттрансляционные изменения в гистонае хвосты, изменить нуклеосом относительно ДНК или обменять канонические гистоны вариантами гистонов необходимы для надлежащего регулирования цветения Arabidopsis 5,6. Некоторые из этих хроматина деятельности ремоделирования катализировать осаждение или удаление ковалентных модификаций, таких как ацетилирование или метилирование гистонов в определенных остатков. Эти знаки гистонов специально признаны специализированных эффекторов, которые вербуют других хроматина комплексов, транскрипционные факторы или компоненты транскрипционного аппарата, чтобы регулировать транскрипционную активность генов цветения.

Иммунопреципитации хроматина (чип) позволяет идентифицировать в естественных условиях ДНК-сайтов связывания белков, представляющих интерес (рис 1). Эта процедура использует способности некоторых химических веществ для сшивания белков с ДНК. Полученные ДНК-белковые комплексы могут быть затем иммунопреципитировали с помощью специфических антител агаINST транскрипционные факторы, хроматин-связывающие белки, или конкретные модификации и гетерологичные эпитопы (как правило, называют "тегов"), присоединенный к белку выбора. ДНК очищают от этих иммуноосажденными может быть использован в качестве матрицы в ПЦР количественной (КПЦР) для оценки реакций для обогащения конкретных последовательностей, представляющих интерес. Таким образом, сайты связывания транскрипционных факторов или распределение гистоновых меток в определенных генов может быть установлено 7,8. Кроме того, в сочетании с нового поколения Секвенирование (NGS), что позволяет массовые параллельные последовательности, чип технология сделала возможным генома идентификации сайтов связывания транскрипционных факторов, а также открытие эпигеномном ландшафтов модификации гистонов. Кроме того, одновременный анализ экспрессии генов позволяет контролировать, как связывание транскрипционных регуляторов или отложение отдельных гистоновых меток коррелирует с транскрипционной деятельноти генов 9.

Использование протоколов чип в Arabidopsis позволило оценить влияние, которое различные транскрипционные регуляторы на организации хроматина мастер генов цветения и как эти структурные изменения влиять на экспрессию генов 5,6. Предыдущие результаты показали, что Arabidopsis локус РАНЬШЕ БОЛТЫ В короткие дни (EBS) действует как репрессор цветения и мутанты в этом гена шоу ускорение цветения и регуляция мастер гена цветения FT. Кроме того, с потерей функции мутации в FT полностью подавить раннее цветение фенотип EBS мутантных растений, что указывает FT требуется для преждевременного цветения EBS мутантов и что EBS является необходимым для подавления этого мастер гена цветения 10 11. EBS кодирует PHD-белок, содержащий, которые могут специфически связываться гистона H3 ди- и trimethylated в гое лизин 4 Остаток (H3K4me2 / 3), что свидетельствует о роли EBS в хроматина опосредованной репрессии FT 12. Использование подхода ChIP показали, что Arabidopsis PHD-белок, содержащий EBS 10,11 связывается регуляторных областей генов цветочной интегратор FT подавить выражение 12. Дополнительные данные, полученные путем использования чиповых технологий показали, что этот белок необходим для поддержания низких уровней ацетилирования гистонов, отличительной чертой активной транскрипции, в хроматина этого гена мастер цветения на начальных этапах развития Arabidopsis. Эти наблюдения, вместе с данными генетических и экспрессии гена, показывают, что это Arabidopsis PHD-содержащий белок играет центральную роль в тонкой настройке времени цветения путем модуляции экспрессии гена цветочные интегратора FT 12. Работа, представленная здесь обеспечивает оптимизированную метод полезен не только для анализа гистонов, но и для другойхроматина белков, ассоциированных и с повышенной эффективностью и уменьшить время эксперимента. Кроме того, в этом докладе показано, как использование протоколов чип новое понимание в отношениях между изменениями в модификации хроматина и транскрипционных состояний генов растений, и как эти хроматина опосредованной механизмов воздействия контроля экспрессии генов на возникновение цветения арабидопсиса.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Сшивание растительного материала (1 час)

  1. Расти Arabidopsis линии, используемые в эксперименте (дикого типа - WT - против мутантов, и / или линии, экспрессирующие с тегами версию своего белка интереса в сравнении с линий, выражающих тег не слит с любого белка) в течение 12-18 дней на больших чашках Петри (150 мм) с МС-агар (1 л: 1x Murashige & Скоог солей, 10 г сахарозы, 0,5 г MES, рН 5,7 (KOH), 1% агара). Кроме того, выращивать растения на горшках, содержащих 3: 1 смесь почвы и вермикулита.
    ВНИМАНИЕ! Формальдегид токсичен при вдыхании, при контакте с кожей и при проглатывании, и должны быть обработаны в химической капотом носить соответствующие средства индивидуальной защиты. Шаги 1.2 - 1.6 должны быть выполнены в соответствии с вытяжкой.
  2. Сделать маленькие отверстия в крышке 50 мл пробирки с лабораторной горелки с подогревом иглы. Добавить 40 мл PBS буфера 1x и 1,08 мл формальдегида в конечной концентрации 1% (37% акций сспособность по). Соберите 1,5 г растительного сырья в этих 50 мл пробирки. Держите труб на льду во время сшивания.
  3. Закрыть 50 мл трубки с крышкой. Место труб в эксикаторе и применять вакуум. Вакуумный проникнуть в ткань в течение 10 мин, затем осторожно освободить вакуум, чтобы предотвратить вспенивание до раствора. Смешайте образец. Повторите дважды. После инфильтрации, наблюдать растительный материал и подтвердить, что он становится слегка прозрачным и, как правило, опускаются на дно пробирки (Рис.2).
  4. Добавить 2,5 мл 2 М глицин до конечной концентрации 0,125 М Применить вакуум в течение 5 мин. Глицин действует как конкурентный ингибитор формальдегида сшивки.
  5. Отменить формальдегида раствор глицина PBS путем инвертирования закрытой трубке 50 мл с отверстиями в крышке.
  6. Промыть ростки дважды 1x PBS и один раз водой отбрасывания моющий раствор, как описано на стадии 1.5. Высушите их на бумажное полотенце и заморозить в жидком nitrogeп.
    Примечание: Замороженную ткань может храниться при -80 ° C в течение нескольких недель.

2. Подготовка антител (1 день)

Примечание: Для иммунопреципитации, использование магнитных шариков конъюгированных с антителами с помощью белка G или белком линкер с высоким сродством к константным доменом тяжелой цепи антитела рекомендуется. ДНК-белковые комплексы можно прикрепить к неспецифически поверхности шариков-конъюгатов антител. По этой причине, необходимо выполнить элементы управления без специфических антител для количественного определения неспецифического связывания фон.

  1. Для каждого иммунопреципитации, подготовить 15 мкл магнитных шариков в 1,5 мл микроцентрифужных трубки. Количество бисера зависит от количества хроматина, используемого для иммунопреципитации, а также на антитела.
  2. Для мытья, добавить 1 мл иммунопреципитации хроматина (чип) буфера для разведения с шариками, перемешать и поставить вращения микроцентрифужной 1,5 мл втбыть в магнитном стойки. Подождите около 1 мин, чтобы шарики приложить к магниту. С 1,5 мл микропробирок еще в стойке, удалить супернатант с помощью пипетки. Повторите дважды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждой линии растений два комплекта иммунопреципитации необходимы: один с бисером и антител (Ab) и второй не антитела (No-Ab) контроля только с магнитных шариков.
  3. Ресуспендируют бисером в 200 мкл буфера для разведения чип. Добавить требуемое количество конкретного Ab к одному из двух трубок, полученных для каждой линии растений (точное разбавление отличается для каждого Ab и должен быть оптимизирован экспериментально или, в случае коммерческих антител, следуя инструкциям производителя). Используйте этот образец для иммунопреципитации. Добавить такое же количество неспецифического IgG к другой трубе, которая будет использоваться в качестве отрицательного контроля.
  4. Инкубируйте O / N на вращающемся колесе при 4 ° С, чтобы антитело приложить к шарикам.

3. хроматина Добыча (4 ч)

  1. Измельчите тщательно замороженного растительного материала в жидком азоте с использованием ступки и пестика, пока порошок не станет однородным и светло-зеленый. Передача порошок в новую пробирку на 50 мл.
  2. Для шагов 3,2 - 3,6, при работе вытяжного шкафа. Добавить 30 мл экстракционного буфера 1 (EXB 1), и хорошо перемешать, чтобы впитать порошок ткани. С этой ступени на, сохранить образцы при 4 ° С в любое время. Замороженные ткани и жидкие остатки азота вызовет буфер для замораживания. Убедитесь, что полностью таять замороженные ткани путем обращения в трубки в 4-5 раз каждые 2 мин.
  3. Очистка суспензии путем пропускания его через фильтрации ткани с размером пор 22-25 мкм в новую пробирку 50 мл и центрифугируют при 1000 его по мкг в течение 20 мин при 4 ° С.
    Примечание: На этом этапе, ядра и все органеллы будет осаждения. ExB 1 содержит достаточное количество сахарозы, чтобы обеспечить высокую плотность и предотвращать нарушение структуры органелл.
  4. Осторожно удалите супернатант декантацией. В этом ГНАGE, наблюдать зеленый шарик около 2 мл.
  5. Ресуспендируют гранул в 5 мл ExB 2. Ресуспендирование гранул будет трудно в этой точке. Центрифуга при 1000 х г в течение 10 мин при 4 ° С.
    ПРИМЕЧАНИЕ: ExB 2 содержит 1% Тритон Х-100, чтобы помочь разорвать хлоропласты открыть и снять хлорофилл.
  6. Ресуспендируют осадок в 300 мкл буфера для экстракции (3 ExB 3).
  7. В чистом пробирке, добавить 600 мкл EXB 3. Возьмите ресуспендировали осадок со стадии 3.6, внимательно слой его на верхней части чистой EXB 3.
  8. Спин в течение 1 ч при 16000 х г при 4 ° С.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг поможет удаление моющего средства из образца.
  9. Удалить супернатант аспирацией с помощью пипетки. Ресуспендируют осадок в ядерной 300 мкл буфера для обработки ультразвуком, медленно пипетки вверх и вниз, чтобы избежать образования пузырьков, которые могут повлиять на эффективность обработки ультразвуком. Тщательно пипетки всю подвеску, и передать его на чистую 1,5 трубки микроцентрифужных мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: ЭтоБуфер содержит SDS, чтобы лизировать ядра и отпустите хроматина.
  10. Разрушать ультразвуком суспензии лизировать ядра и случайно сдвигу хроматина в небольших фрагментов. Использование условий обработки ультразвуком, которые делают хроматин обогащенного фрагментов между 200-800 п.н. (20-30 циклов с настройками 30 сек ВКЛ / ВЫКЛ 30 сек при 4 ° С для обработки ультразвуком устройство, доступное, описанной в Таблице материалов / реагентов). Проверьте эффективность обработки ультразвуком по электрофоретического разделения полученных фрагментов ДНК в агарозном геле 13, загрузка 2 мкл ультразвуком хроматина (рис 3).
    ВНИМАНИЕ! Убедитесь, что защита от износа оборудования уха во время стадии обработки ультразвуком в случае ультразвуковой прибор не содержится в звуконепроницаемой кабинета.
    Решающий шаг! Фрагментации хроматина во многом зависит от обработки ультразвуком оборудования. Условия обработки ультразвуком должны быть скорректированы, чтобы достичь обогащения в соответствующих размеров ДНК. ВидетьРисунок 3 для примера о том, как оптимизировать фрагментацию хроматина.
  11. Спин решение сразу при 12000 х г в течение 10 мин при 4 ° С. Передача супернатант с помощью пипетки на чистую 1,5 мл микроцентрифужных трубки. Откажитесь от гранул. Возьмем 1/10 супернатанта к новому 1,5 мл микроцентрифужных трубки, пометить его как вход и заморозить при температуре -20 ° С.
  12. Развести хроматин 10x с буфером для разведения чип для разбавления SDS до конечной концентрации 0,1%.
    Примечание: Образцы могут быть заморожены и хранили при -20 ° C в течение нескольких недель.

4. Иммунопреципитация интерес белка и спасания ДНК (1 день, 3 часа)

  1. Вымойте бисером покрытием с Ab с шага 2.4 в три раза с 1 мл буфера для разведения ChIP, чтобы удалить излишки антитела, как описано в шаге 2.2. Ресуспендируют в 200 мкл буфера для разведения чипе. Добавить 50 мкл изолированной хроматина. Инкубируйте O / N на вращающемся колесе при 4 ° С.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте Концентрацна хроматина в микрообъема UV-VIS спектрофотометр. 50 мкл выделенной хроматина должны содержать более 10 мкг ДНК.
  2. Для этапах 4,2-4,5 работы в 4 ° C. Вымойте бисером дважды в 1 мл низким содержанием соли промывочного буфера, как описано в шаге 2.2.
  3. Вымойте бисером раз в 1 мл Высокая Солт промывочного буфера.
  4. Вымойте бисером раз в 1 мл LiCl промывочный буфер.
  5. Промыть шарики дважды в 1 мл ТЕ-буфера. После последней промывки, убедитесь, что полностью удалить буфер TE влево в трубке аспирации с помощью пипетки.
  6. Выньте образцы вход (шаг 3.9). Передача 5 мкл вход, к новым 1,5 мл микроцентрифужных трубки и продолжают, как с образцами чипе. Обратный сшивки путем добавления 200 мкл 5% смолой хелатирующего иона, и инкубируют в течение 10 мин при 95 ° С встряхивая каждые 2-3 мин. Спин вниз при 16000 мкг в течение 30 сек и тщательно передачи супернатант в новую пробирку микроцентрифужных с помощью пипетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В то время как траНАЯ способ сшивания разворот включает в себя O / N инкубации с NaCl, инкубации с хелатирующим ионообменной смолы при 95 ° С позволяет эффективно decrosslinking и элюирование ДНК в 10 мин, поэтому делает протокол один день короче.
  7. Добавьте 2 мкл протеиназы К (10 мг / мл) и инкубируют при 37 ° С в течение 30 мин, чтобы переварить белки и освободить ДНК.
  8. Остановка реакции путем инкубации при 95 ° С в течение 10 мин.
  9. Быстро спина при 16000 мкг в течение 30 сек и передавать супернатант в новую пробирку пипеткой.
  10. Очистка ДНК, выделенную с помощью стандартного ДНК-фрагментов набора для очистки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Действовать в соответствии с инструкциями изготовителя.
  11. Передача связывания колонку ДНК из комплекта к новому 1,5 мл микроцентрифужных трубки. Элюции очищенной ДНК добавлением 20 мкл ДНКазы без воды в центре колонны и вращается со скоростью 16000 мкг в течение 60 сек. Остановка точку: Образцы могут храниться при температуре -80 ° С в течение нескольких недель.

    12. 5. Измерение Изобилие сайтов связывания в Иммунопреципитированные ДНК от кПЦР (4 ч)

    Примечание: ДНК, выделенную из осажденного хроматина должна быть проанализирована, чтобы определить, какие ДНК фрагменты были чип-е изд от общего хроматина, из-за его связывания с представляющим интерес белком.

    1. Дизайн праймеров для геномных областей, представляющих интерес с температурой плавления (Tm) 60 ° С, и содержание GC 30% -80%. В хроматин фрагментирован с помощью ультразвука, длина последовательности не усиленного должно быть больше, чем 150-200 нуклеотидов (таблица 1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: полезный инструмент для проектирования грунтовка Грунтовка Программа 3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/). Дополнительные руководящие принципы для дизайна грунтовки доступны в предыдущих докладах 8, 14,15.
    2. Используйте программу BLAST, чтобы убедиться, что праймеры специфичны (особенно промоторы могут использовать аналогичные связывания ТФ последовательностей) и проверить USIN эффективности грунтовкиг 1:10 разведения в воде входного ДНК (шаг 4.9). Некоторые области генома будет очищен лучше, чем другие. Поэтому важно разработать ПЦР-праймеров и проверить их на разбавленную входного ДНК.
    3. Развести очищенную ДНК 1:10 водой и пипеткой 5 мкл разбавленного ДНК в ПЦР-пробирку для каждой реакции.
      Примечание: Развести только количество, требуемое, а ДНК можно присоединить к стенкам 1,5 мл микроцентрифужных пробирках. Многократного оттаивания-замораживания циклов увеличить количество присоединенных молекул ДНК. Для каждого пары праймеров, усиления на входе, Аб-чип и нет-Ab чип должен быть проанализированы.
    4. Для завершения смесь ПЦР, добавьте SYBR Green Master Mix ПЦР до конечной концентрации 1х и 0,5 мкМ каждого праймера. Заполните до 20 мкл с ДНКазы без воды.
    5. Выполните реакцию КПЦР, следуя инструкциям производителя мастер смеси SYBR Green ПЦР.

    Анализ 6. Данные

    ПРИМЕЧАНИЕ: Среди эксстатки способы анализа Чип данные, два наиболее часто используемых. Первый из них является метод обогащения раза, также названный как «относительное обогащение», «сигнала над фоном" или "по сравнению с контролем не-антитела». Второй метод назван как "% ввода".

    1. Анализ данных по кратным методом обогащения.
      1. Создать таблицу с образцами имен и значений Ct сырья, которые были получены после реакции КПЦР.
      2. Для каждого образца, вычитают из его сырой значение КТ необработанное значение Ct, полученного по соответствующим контролем Нет-Ab. ПРИМЕЧАНИЕ: После этой математической операции, значение Ct для образца Нет-Ab будет равняться 0.
      3. Рассчитать кратное обогащение операции возведения в базе 2 и экспоненты (мощности), равную отрицательной остатка, полученного на стадии 6.1.2 (таблица 2).
        кратное обогащение = 2 - (Ct (образец) - Ct (Нет-Ab))
        ПРИМЕЧАНИЕ: В этом метод обилие конкретного фрагмента ДНК в образце чип-е изд сравнивается с обилием этого фрагмента в управлении Нет-Ab. Предположение этого метода состоит в том, что уровень фонового сигнала воспроизводима между различными наборов праймеров, образцы, и репликации экспериментов. Тем не менее, это'noise' уровни сигналов действительно изменяются между наборами праймеров, образцов и экспериментов.
    2. Анализ данных по% от метода ввода.
      1. Создать таблицу с образцами имен и значений Ct сырья, которые были получены для них после реакции КПЦР.
      2. Отрегулируйте значения Ct сырье для входных выборок путем вычитания значения логарифма 2 от фракции всего добываемого хроматина, который был взят в качестве входных данных.
        ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе вычитается величина равна 3.32, а был взят в качестве вклада в этом протоколе 10% от общего хроматина. Вход 2 (10) равна 3,32.
      3. Рассчитать% ввода путем умножения на 100 значение работы возведения с база 2 и показатель (мощности) равна оставшейся части скорректированных значений входных вычитается из сырых значений Ct образца (Таблица 3).
        В% от исходного = 100 * 2 (скорректированная вход - Ct (образец))
        Примечание: С помощью этой процедуры, соотношение между специфической ДНК изобилии в образце чип-е изд к общему изолированные хроматина (входной выборки) рассчитывается. Более подробная информация о анализа данных чип может быть найден в Хэринга соавт. 8.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Восемь основных шагов можно выделить в этом протоколе чип для идентификации в естественных условиях взаимодействия белок-ДНК, в том числе растет и уборки растительного материала, сшивания хроматина, хроматина изоляции, фрагментации хроматина, селективного выделения комплексов между ДНК и интересующий белок иммунопреципитацией, переваривания белков, ДНК, очистки и анализа КПЦР (рис 1). Важнейшим шагом в протоколе чип фиксация ДНК-белковых взаимодействий в реакции сшивания. Как правило, формальде...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Протокол чип описано здесь является воспроизводимым и мощная техника анализа взаимодействий между белками и специфических последовательностей ДНК в естественных условиях в Arabidopsis растений. Успешной идентификации сайтов связывания для белков, представляющих интерес требует адекватного выбора органах растений или стадий развития, где соответствующие взаимодействия фактически происходит. Кроме того, очень важно, чтобы получить соответствующую фиксацию растительного материала и оптимальную резку хроматина с по...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Авторы хотели бы выразить признательность The Plant Cell за разрешение использовать некоторые данные, опубликованные в этом журнале, для уточнения репрезентативных результатов, описанных здесь на рисунке 4. Эта работа была поддержана Европейской сетью начального обучения им. Марии Кюри 7FP EpiTRAITS (Соглашение о гранте 316965) и Министерством экономики и конкурентоспособности Испании (гранты BIO2010-15589 и BIO2013-43098-R).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
MESSigmaM8250
MS (смесь базальных солей Мурашиге и Скуга)SigmaM5524
Формальдегид 37% SigmaF8775-25Использовать под вытяжным шкафом
смесь ингибиторов протеазы cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EDTA-free, EASYpackRoche5892791001
Bioruptor Стандартное ультразвуковое устройствоDiagenodeB01010002 (UCD200TO)
GlycineSigma50046
QIAquick PCR Purification KitQiagen28104
Магнитные шарики Dynabeads в сочетании с белком А или белком GLife Technologies10003D/10001DПроверить производителя s руководство по сродству антител
MiraclothMerck Millipore475855
Triton X-100 Surfact-Amps Моющее средствоLife Technologies85112
(мышь, крыса, кролик и гелип;)-IgGDiagenodeC15400001, C15420001, C15410206
магнитный штатив - DynaMag-2Life Technologies12321D
H3K9/14ac поликлональное антитело - Premium ДиагенодC15410200-10
Chelex 100 СмолаBio-Rad142-2832
Протеиназа KLife Technologies17916
Anti-Myc Tag антитело, клон 4A6Millipore05-724
LightCycler 480 SYBR Green I MasterRoche4707516001

Ссылки

  1. Andres, F., Coupland, G. The genetic basis of flowering responses to seasonal cues. Nat Rev Genet. 13 (9), 627-639 (2012).
  2. Capovilla, G., Schmid, M., Pose, D. Control of flowering by ambient temperature. J Exp Bot. 66 (1), 59-69 (2015).
  3. Jarillo, J. A., Piñeiro, M. Timing is everything in plant development. The central role of floral repressors. Plant Science. 181 (4), 364-378 (2011).
  4. Pajoro, A., et al. The (r)evolution of gene regulatory networks controlling Arabidopsis plant reproduction: a two-decade history. J Exp Bot. 65 (17), 4731-4745 (2014).
  5. He, Y. Chromatin regulation of flowering. Trends Plant Sci. 17 (9), 556-562 (2012).
  6. Jarillo, J. A., Pineiro, M., Cubas, P., Martinez-Zapater, J. M. Chromatin remodeling in plant development. International Journal of Developmental Biology. 53 (8-10), 1581-1596 (2009).
  7. Saleh, A., Alvarez-Venegas, R., Avramova, Z. An efficient chromatin immunoprecipitation (ChIP) protocol for studying histone modifications in Arabidopsis plants. Nat Protoc. 3 (6), 1018-1025 (2008).
  8. Haring, M., et al. Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods. 3, 11(2007).
  9. Kaufmann, K., et al. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) of plant transcription factors followed by sequencing (ChIP-SEQ) or hybridization to whole genome arrays (ChIP-CHIP). Nat Protoc. 5 (3), 457-472 (2010).
  10. Gomez-Mena, C., et al. early bolting in short days: An Arabidopsis mutation that causes early flowering and partially suppresses the floral phenotype of leafy. Plant Cell. 13 (5), 1011-1024 (2001).
  11. Piñeiro, M., Gomez-Mena, C., Schaffer, R., Martinez-Zapater, J. M., Coupland, G. EARLY BOLTING IN SHORT DAYS is related to chromatin remodeling factors and regulates flowering in Arabidopsis by repressing FT. Plant Cell. 15 (7), 1552-1562 (2003).
  12. Lopez-Gonzalez, L., et al. Chromatin-dependent repression of the Arabidopsis floral integrator genes involves plant specific PHD-containing proteins. Plant Cell. 26 (10), 3922-3938 (2014).
  13. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor. Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (1989).
  14. Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. J. Vis. Exp. , e3998(2012).
  15. Wong, M. L., Medrano, J. F. Real-time PCR for mRNA quantitation. Biotechniques. 39 (1), 75-85 (2005).
  16. Dedon, P. C., Soults, J. A., Allis, C. D., Gorovsky, M. A. A simplified formaldehyde fixation and immunoprecipitation technique for studying protein-DNA interactions. Anal Biochem. 197 (1), 83-90 (1991).
  17. Yu, C. W., et al. HISTONE DEACETYLASE6 interacts with FLOWERING LOCUS D and regulates flowering in Arabidopsis. Plant Physiology. 156 (1), 173-184 (2011).
  18. Zhou, J., et al. Genome-wide profiling of histone H3 lysine 9 acetylation and dimethylation in Arabidopsis reveals correlation between multiple histone marks and gene expression. Plant Mol Biol. 72 (6), 585-595 (2010).
  19. Lafos, M., et al. Dynamic regulation of H3K27 trimethylation during Arabidopsis differentiation. PLoS Genet. 7 (4), e1002040(2011).
  20. Barcala, M., Fenoll, C., Escobar, C. Laser microdissection of cells and isolation of high-quality RNA after cryosectioning. Methods Mol Biol. 883, 87-95 (2012).
  21. Carter, A. D., Bonyadi, R., Gifford, M. L. The use of fluorescence-activated cell sorting in studying plant development and environmental responses. Int J Dev Biol. 57 (6-8), 545-552 (2013).
  22. Deal, R. B., Henikoff, S. The INTACT method for cell type-specific gene expression and chromatin profiling in Arabidopsis thaliana. Nat Protoc. 6 (1), 56-68 (2011).
  23. Zeng, P. Y., Vakoc, C. R., Chen, Z. C., Blobel, G. A., Berger, S. L. In vivo dual cross-linking for identification of indirect DNA-associated proteins by chromatin immunoprecipitation. Biotechniques. 41 (6), 694-698 (2006).
  24. Das, P. M., Ramachandran, K., vanWert, J., Singal, R. Chromatin immunoprecipitation assay. Biotechniques. 37 (6), 961-969 (2004).
  25. Kaufmann, K., et al. Target genes of the MADS transcription factor SEPALLATA3: integration of developmental and hormonal pathways in the Arabidopsis flower. PLoS Biol. 7 (4), e1000090(2009).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Arabidopsis Thalianaсвязывание транскрипционного фактораанализ модификаций гистоновпроцедура кросс-линкингафрагментация с помощью соникациииммунопреципитация на магнитных частицахколичественная ПЦР (qPCR)регуляция гена FT
Хроматина иммунопреципитации для идентификации Arabidopsis взаимодействий белок-ДНК
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.