Иммунопреципитации хроматина является мощным средством для идентификации ДНК сайтов связывания белков Arabidopsis в естественных условиях. Это процедура включает в себя хроматина сшивание и фрагментации, иммунопреципитацию с селективными антител против белка интереса, и КПЦР анализ связанного ДНК. Мы опишем простой ChIP анализа, оптимизированный для Arabidopsis растений.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Хроматина иммунопреципитации для идентификации Arabidopsis взаимодействий белок-ДНК
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Сложные генные регуляторные сети организуют биологические процессы и переходы в развитии растений. Селективная активация транскрипции и сайленсинг генов опосредуют реакцию растений на сигналы окружающей среды и сигналы развития. Таким образом, понимание механизмов, контролирующих экспрессию генов растений, имеет важное значение для глубокого понимания того, как регулируются биологические процессы в растениях. Описанный здесь метод иммунопреципитации хроматина (ChIP) представляет собой процедуру идентификации ДНК-связывающих сайтов белков в генах или геномных областях модельного вида Arabidopsis thaliana. Взаимодействия с ДНК представляющих интерес белков, таких как факторы транскрипции, белки хроматина или посттрансляционно модифицированные версии гистонов, могут быть эффективно проанализированы с помощью протокола ChIP. Этот метод основан на фиксации белок-ДНК-взаимодействий in vivo, случайной фрагментации хроматина, иммунопреципитации комплексов белок-ДНК специфическими антителами и количественной оценке ДНК, ассоциированной с интересующим белком, методами ПЦР. Использование этой методологии у Arabidopsis внесло значительный вклад в раскрытие транскрипционных регуляторных механизмов, которые контролируют различные биологические процессы в растениях. Такой подход позволил идентифицировать сайты связывания белка хроматина Arabidopsis EBS с регуляторными областями мастер-гена цветущего FT. Влияние этого белка на накопление определенных гистоновых меток в геномной области FT также было выявлено с помощью анализа ChIP.
Введение
В последние годы целый ряд генетических, молекулярных и геномных инструментов были разработаны в модельных видов Arabidopsis THALIANA. Эта технология способствовала чрезвычайно прогресс в понимании того, как развитие растений регулируется. Среди изучаемых процессов развития с помощью арабидопсиса в качестве модели, генетического контроля времени цветения широко проанализированы. Эти исследования показали, что растения модулировать очень точно время цветения в ответ на эндогенные сигналы, такие как гормоны и возраста растения, а также охраны окружающей среды сигналов, таких как фотопериода и температуры, которые синхронизируют цветущих время с естественным ци....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Сшивание растительного материала (1 час)
- Расти Arabidopsis линии, используемые в эксперименте (дикого типа - WT - против мутантов, и / или линии, экспрессирующие с тегами версию своего белка интереса в сравнении с линий, выражающих тег не слит с любого белка) в течение 12-18 дней на больших чашках Петри (150 мм) с МС-агар (1 л: 1x Murashige & Скоог солей, 10 г сахарозы, 0,5 г MES, рН 5,7 (KOH), 1% агара). Кроме того, выращивать растения на горшках, содержащих 3: 1 смесь почвы и вермикулита.
ВНИМАНИЕ! Формальдегид токсичен при вдыхании, при контакте с кожей и при проглатывании, и должны быть обработаны в химической капотом носить ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Восемь основных шагов можно выделить в этом протоколе чип для идентификации в естественных условиях взаимодействия белок-ДНК, в том числе растет и уборки растительного материала, сшивания хроматина, хроматина изоляции, фрагментации хроматина, селективного выделения комплексов между ДНК и интересующий белок иммунопреципитацией, переваривания белков, ДНК, очистки и анализа КПЦР (рис 1). Важнейшим шагом в протоколе чип фиксация ДНК-белковых взаимодействий в реакции сшивания. Как правило, формальде.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Протокол чип описано здесь является воспроизводимым и мощная техника анализа взаимодействий между белками и специфических последовательностей ДНК в естественных условиях в Arabidopsis растений. Успешной идентификации сайтов связывания для белков, представляющих интерес требует адекватного выбора органах растений или стадий развития, где соответствующие взаимодействия фактически происходит. Кроме того, очень важно, чтобы получить соответствующую фиксацию растительного материала и оптимальную резку хроматина с по.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Благодарности
Авторы хотели бы выразить признательность The Plant Cell за разрешение использовать некоторые данные, опубликованные в этом журнале, для уточнения репрезентативных результатов, описанных здесь на рисунке 4. Эта работа была поддержана Европейской сетью начального обучения им. Марии Кюри 7FP EpiTRAITS (Соглашение о гранте 316965) и Министерством экономики и конкурентоспособности Испании (гранты BIO2010-15589 и BIO2013-43098-R).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| MES | Sigma | M8250 | |
| MS (смесь базальных солей Мурашиге и Скуга) | Sigma | M5524 | |
| Формальдегид 37% | Sigma | F8775-25 | Использовать под вытяжным шкафом |
| смесь ингибиторов протеазы cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EDTA-free, EASYpack | Roche | 5892791001 | |
| Bioruptor Стандартное ультразвуковое устройство | Diagenode | B01010002 (UCD200TO) | |
| Glycine | Sigma | 50046 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Магнитные шарики Dynabeads в сочетании с белком А или белком G | Life Technologies | 10003D/10001D | Проверить производителя s руководство по сродству антител |
| Miracloth | Merck Millipore | 475855 | |
| Triton X-100 Surfact-Amps Моющее средство | Life Technologies | 85112 | |
| (мышь, крыса, кролик и гелип;)-IgG | Diagenode | C15400001, C15420001, C15410206 | |
| магнитный штатив - DynaMag-2 | Life Technologies | 12321D | |
| H3K9/14ac поликлональное антитело - Premium | Диагенод | C15410200-10 | |
| Chelex 100 Смола | Bio-Rad | 142-2832 | |
| Протеиназа K | Life Technologies | 17916 | |
| Anti-Myc Tag антитело, клон 4A6 | Millipore | 05-724 | |
| LightCycler 480 SYBR Green I Master | Roche | 4707516001 |
Ссылки
- Andres, F., Coupland, G. The genetic basis of flowering responses to seasonal cues. Nat Rev Genet. 13 (9), 627-639 (2012).
- Capovilla, G., Schmid, M., Pose, D. Control of flowering by ambient temperature. J Exp Bot. 66 (1), 59-69 (2015).
- Jarillo, J. A., Piñeiro, M.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
