Методическая статья

Метаболический характеристика поляризованных M1 и M2 из костного мозга макрофагов, используя анализ в реальном времени внеклеточной Flux

DOI:

10.3791/53424

⸱

28 ноября 2015 г.

 ,  , 
1Department of Medical Biochemistry, Experimental Vascular Biology, Academic Medical Center, Amsterdam

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Метаболическое перепрограммирование является характеристикой и предпосылкой для поляризации макрофагов M1 и M2. В данной рукописи описан анализ для измерения фундаментальных параметров гликолиза и функции митохондрий в макрофагах, полученных из костного мозга мышей. Этот инструмент может быть применен для исследования того, как определенные факторы влияют на метаболизм и фенотип макрофагов.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Специфические метаболические пути все чаще признаются критическими признаками подмножеств макрофагов. В то время как индуцированные ЛПС классически активируемые макрофаги M1 или M(LPS) являются провоспалительными, IL-4 индуцирует альтернативную активацию макрофагов, и эти так называемые M2 или M(IL-4) поддерживают разрешение воспаления и заживление ран. Последние данные показывают решающую роль метаболического перепрограммирования в регуляции поляризации макрофагов М1 и М2.

В этой рукописи для оценки метаболических характеристик наивных макрофагов, полученных из костного мозга мышиного мозга, поляризованных M1 и M2. Этот прибор использует датчики pH и кислорода для измерения скорости внеклеточного закисления (ECAR) и скорости потребления кислорода (OCR), которые могут быть связаны с гликолитическим и митохондриальным окислительным метаболизмом. Таким образом, как гликолиз, так и митохондриальный окислительный метаболизм могут быть измерены в режиме реального времени в одном анализе.

Используя этот метод, мы демонстрируем, что воспалительные макрофаги M1 демонстрируют повышенный гликолитический метаболизм и сниженную митохондриальную активность. И наоборот, противовоспалительные макрофаги M2 демонстрируют высокое митохондриальное окислительное фосфорилирование (OXPHOS) и характеризуются повышенной резервной дыхательной способностью (SRC).

Представленный функциональный анализ служит основой для исследования того, как определенные цитокины, фармакологические соединения, нокауты генов или другие вмешательства влияют на метаболический фенотип и воспалительный статус макрофага.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В то время как макрофаги играют центральную роль в практически всех заболеваний, молекулярные механизмы, которые регулируют их фенотип до сих пор не разгадана полностью. Макрофаги проявлять высокую неоднородность и в ответ на микросреды принять различные фенотипы 1. ЛПС (+ IFN,), индуцированного в классическом активирована M1 или М (LPS) макрофаги способствуют воспаление и защитить хозяина против различных типов микроорганизмов угроз из 2. Другие используют IFN, отдельно или в сочетании с TNF, как стимулов, чтобы вызвать M1 поляризацию. ИЛ-4 и / или IL-13 индуцирует активацию макрофагов и альтернативный них М2 или М (ИЛ-4) клетки являются мощными супрессоров и контроллеры текущих иммунных реакций 3. Поляризованные макрофаги отображения отличное регулирование клеточного метаболизма с ЛПС-активированными макрофагами M1 проходит метаболический выключатель к повышению гликолиза 4-6. Окисления, наоборот, усиливается жирных кислот (ФАО) и митохондриальной oxidativе фосфорилирования (OXPHOS) обеспечивает устойчивый энергии в Ил-4-индуцированных М2 макрофаги 7-9. Таким образом, изменения метаболизма является не только характеристикой поляризованных макрофагов подмножеств, он также является необходимым условием для правильной поляризации и воспалительного регулирования. Важно отметить, что ингибирование гликолиза или OXPHOS / ФАО было продемонстрировано, ухудшают M1 или M2 активации соответственно 8,10. Таким образом, выявление метаболические изменения в макрофагах может быть применен в качестве инструмента для оценки состояния поляризации их и воспалительный потенциал.

Последовательное анализ, который измеряет макрофагов метаболизм, следовательно, может быть использован для прогнозирования ли препарат, ген сбить или другое лечение влияет макрофагов поляризации и функции. В этом видео, внеклеточный анализатор потока используется для характеристики биоэнергетики профили наивных, М1 и М2 макрофаги.

Эта рукопись подробно оптимизированный протокол, который позволяет измерятьвсех соответствующих параметров гликолиза (гликолиз, максимальная гликолиза и гликолитических резервных) и митохондриальных характеристик функций (общая дыхания, базальная митохондриального дыхания, АТФ производства, утечки протонов, максимальная дыхания и запчасти дыхательных мощности) в одном тесте. Используя эту экспериментальную установку, биоэнергетика можно сравнить между контролем и «измененной» (например, гена сбить, трансгенной сверхэкспрессии или фармакологическое лечение) клетки.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Культивирование и поляризационный из костного мозга Макрофаги

  1. День 0: изолят бедра и голени кости из 6-10-недельных мышей интереса (C57BL / 6 в этом анализе).
  2. Удалить мышечной ткани от костей и поместить кости в 9 см чашки Петри, наполненной ледяной PBS.
  3. Передача кости блюдо 9 см Петри заполнены 70% этанола и осторожно встряхните пластину в течение 30 сек.
  4. Передача кости свежего 9 см чашки Петри, наполненной ледяной стерильной PBS.
  5. Вырезать бедра и голени на обоих концах с стерильными ножницами.
  6. Флеш кости с помощью 10 мл ледяной стерильной PBS с помощью шприца 10 мл и иглу 25 G. Сбор костного мозга в 50 мл пробирку.
  7. Передача клеток костного мозга в новую пробирку 50 мл с помощью иглы 23 G.
  8. Повторите этот шаг с иглой 25 G. Примечание: Эти шаги необходимы, чтобы удалить скопления клеток и остатков костей.
  9. Центрифуга при 300 х г в течение 5 мин при 4 ° С.
  10. Откажитесь от вирernatant и ресуспендирования клеток в среде 40 мл клеточной культуры (RPMI-1640 плюс 2 мМ L-глутамина, 10% FCS, пенициллином (100 Ед / мл), стрептомицина (100 мкг / мл) и 15% отфильтрованного L-929 клетки ( АТСС, CCL-1) -conditioned среду, содержащую M-CSF (или альтернативно 10 нг / мл рекомбинантного M-CSF, а не L-929 клеток-кондиционированной среды).
    Примечание: Генерация L-929 клеток с кондиционером среды подробно ранее в этом журнале в 2013 году 11
  11. Культуры клеток от одной мыши в двух 15 см чашки Петри (не использовать культуру обработке пластин клеток, так как макрофагов не оторваться от этого пластика) в 20 мл культуральной среды на пластине в 37 ° C, 5% CO 2 инкубаторе.
  12. Добавить 10 мл свежего клеток культуральной среды на 3 день, не снимая 20 мл старую культуральную среду.
  13. Замените старый носитель каждой пластины с 20 мл свежей культуральной среды на день 6. Ведение это, не прилипшие клетки также будут удалены.
  14. День 8:
    1. Снять клетки путем инкубации их 5 мВ при 37 ° С в 10 мл физиологического раствора цитрата (135 мМ хлорида калия плюс 15 мМ цитрата натрия в H 2 O, автоклавного) и промывают 10 мл PBS. Граф мозга, полученных макрофаги зрелой кости (BMDM) на 8-й день, используя сотовый счетчика.
    2. Проверка образование взрослых (CD11b + F4 / 80 +) BMDM путем визуального осмотра или с помощью проточной цитометрии. Блока 10 5 клеток с 1/100 анти-CD16 / CD32 в PBS в течение 20 мин в 100 мкл PBS, инкубировать с 1/200 анти-CD11b-FITC плюс 1/200 анти-F4 / 80-APC-Cy7 при комнатной температуре, стирка и анализировать с помощью проточной цитометрии.
      Примечание: мозга, полученных макрофаги Культивирование мыши кость подробно было опубликовано в начале в этом журнале по Ин др. 11.
  15. Семенной 50000 клеток (количество клеток оптимальные должны быть оптимизированы) на лунку в клеточной культуре микропланшет в количестве 100 мкл культуральной среды. Не клеток семян в коррекции фон скважин (A1, A12, H1, H12) и поставить средний только (и не клетки) в этих скважинах Подсказка:. Держите пипетку под углом абой на полпути вниз стороны скважин для наиболее однородного слоя клеток.
  16. Разрешить клетки поселиться в РТ в капот культуре клеток в течение 1 часа. Это будет способствовать равномерное распределение клеток и снизить краевые эффекты. Следить за соблюдением помощью микроскопа и культуры в 37 ° C, 5% CO 2 инкубаторе.
  17. Три часа после посева, стимулируют клетки в течение 24 ч с 10 нг / мл ЛПС, или 20 нг / мл рекомбинантного мыши IL-4, чтобы генерировать M1 или M2 макрофаги, соответственно. Включить необработанные наивно (М0) макрофаги в качестве контроля. Оценка надлежащего M1 и M2 макрофагов поляризации путем измерения ЛПС-индуцированную секрецию IL-6, IL-12, TNF (ИФА) и ИЛ-4 индуцированный аргиназы-1 активность и / или MMR (CD206) и MGL (CD301) поверхностной экспрессии (проточной цитометрии), как описано ранее 3,11.
    Примечание: В этот момент клетки могут быть (предварительно) -обработанной с фармакологическими соединений, представляющих интерес, или макрофагов может быть стимулировано с другими факторами. Так, изменение отдельных скважин между может быть подводные лодкиtantial, желательно использовать по крайней мере 4 и 6 скважин в идеале за состояния.

2. Подготовка Пробирной внеклеточной Flux

  1. Гидратов картридж датчика за один день до проведения анализа:
    1. Поместите картридж датчика вниз рядом с утилитой пластины.
    2. Заполните каждую лунку полезности пластины с 200 мкл раствора калибрующего и опустите картридж датчика на сервисный пластины погружая датчики в калибрующего раствора.
    3. Убедитесь, что уровень раствора калибрующего достаточно высокой, чтобы датчики подводных и место в не-СО 2 37 ° C инкубатора O / N.
  2. Подготовка среды для анализа на день анализа следующим образом:
    1. Теплый 50 мл XF основную среду до 37 ° С.
    2. Добавить 500 мкл 200 мМ L-глутамина, чтобы получить 2 мм конечной концентрации.
    3. Доведения рН до 7,4 с помощью 1 N NaOH и стерилизовать с 0,2 мкм фильтр и хранить в среду для анализа при 37 ° С.
  3. Осторожно удалить клеточную культуральную среду с поляризованными макрофагов и хранить его при температуре -20 ° С для последующего использования (например, ELISA, чтобы исследовать надлежащую макрофагов поляризации). Вымойте клеток с 100 мкл среды для анализа, добавьте 180 мкл среды для анализа на лунку и проверьте под микроскопом, что клетки не были смыты. Поместите культуральный планшет в 37 ° C инкубаторе без CO 2 в течение 1 часа перед анализом перспективе.
  4. Подготовка 10 х впрыска смеси соединений A до D, как описано в таблице 1, тепло до 37 ° С, довести рН до 7,4 и стерилизуют фильтра.
    1. Сделать все соединения в этих смесей при 10x конечной концентрации в культуре клеток скважин и оптимизировать эти концентрации для каждого типа клеток.
  5. Загрузите картридж датчика используя предоставленные направляющие загрузки с указанными объемами (таблица 1) подготовленных 10х инъекции сложных смесей в портах A, B, C и D, respectively.
Смесь / впрыска Соединений Объем добавил, чтобы получить 10x смеси (мкл) Объем среды для анализа (мл) Объем инъекции во время работы (мкл) Конечная концентрация в анализе
2,5 М (45%) глюкозы 300 2.7 20 25 мм
В 5 мМ олигомицин A (ОМ) 9 3.0 22 1,5 мкМ
С 5 мМ FCCP 9 2.7 25 1,5 мкМ
Решение 100 мМ натрия пирувата 300 1 мм
D 5 мМ антимицину А (АА) 15 3.0 28 2,5 мкМ
5 мМ ротенон (Рот) 7.5 1.25 мкМ

Таблица 1. Инъекции смеси.

3. Биоэнергетический характеристика поляризованных M1 и M2 BMDM помощью внеклеточного Flux Analyzer

  1. Создайте шаблон анализа с помощью мастера анализа с 2 минут MIX и 3 раза минутах измерять и (по крайней мере) 3 смеси и скорости измерений петли перед каждым из 4 инъекций (Таблица 1) и после последней инъекции.
    Примечание: Эти концентрации действительны для мозга, полученных макрофагов костей и RAW264.7 макрофагов клеточных линий, но должны быть оптимизированы для каждого типа клеток. Добавление пирувата в смеси FCCP необходимо, чтобы питать максимальное дыхание.
  2. Начните бег, нажав начальную дно и следуйте инструкциям установки. Во-первых нагрузка автомобиль-картридж пластина с гидратированных зондов, чтобы калибровка аппаратуры и следующий нагрузки клеточной пластинки.
  3. После анализа, тщательно отбрасывать весь среды для анализа и хранения анализируемый планшет для культивирования клеток при -20 ° С для последующего нормализации клеток с использованием набора для анализа пролиферации клеток, как подробно описано поставщиком.
    1. Вкратце, подготовить 1x буфер клеток лизис путем разбавления компонента B в 20 раз в дистиллированной воде и разбавляют соединение 400-кратной в клетки-буфера для лизиса 1x. Добавить 200 мкл на лунку, инкубировать 5 мин при комнатной температуре и измерить флуоресценцию с ~ 180 нм и ~ возбуждения 520 нм максимумов излучения.
      Примечание: При работе с не-адгезивные клетки или если плохое соблюдение является проблемой, прямой набор пролиферации клеток можно использовать в качестве альтернативы, так как этот протокол не требует отбрасывания всех среде для анализа. Тем не менее, этот прямой протокола немного менее чувствительны по сравнению с протоколом, используемым в этой лаборатории.
  4. После измерения флуоресценции, нормализуютколичество клеток в каждой лунке в виде отношения, в которых среднее число клеток всех наивных макрофагов скважин устанавливается на 1.
    Примечание: Количественную оценку белка (например, с использованием BCA анализ) может использоваться в качестве альтернативного способа нормализации клеток рассчитывает. Тем не менее, в руках Этот анализ менее чувствительным по сравнению с набора для анализа пролиферации клеток.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

После завершения анализа внеклеточной потока и количественного клеток, данные могут быть нормализованы для подсчета клеток и анализировали. Это, как правило, дают Ecar и распознавания участков, как показано на рисунке 1А и 1В рис.

После инъекции глюкозы (А), увеличение РВЦА представляет собой скорость гликолиза. Дополнительное увеличение РВЦА после АТФ-синтазы торможения с олигомицину (B) предоставляет информацию о гликолитического резерва и мощности (рис 1А). При анализе значения OCR, олигомицин инъекции (B) позволяет рассчитать потребление кислорода, используемого для синтеза АТФ митохондрий. FCCP (С) разобщает дыхание митохондрий и соответствующие измерения OCR выход данных о максимальной и свободное дыхательных мощности. Наконец, введение ротенона (Рот) и антимицин А (АА) блокировать митохондриальной комплекс I и III, и остаточное OCR представляет не-митохондриальные минусы кислородаumption (Фигура 1В).

figure-results-1
Рисунок 1: параметры обмена веществ, полученные из анализа потока XF внеклеточной. (А) следующие параметры клеточного гликолиза рассчитываются из значений Ecar (в миль / ч / мин): гликолиз, максимальная мощность гликолиза и гликолитических резерв. Измерения (В) OCR (в пмоль / мин) используются для вычисления следующих основных параметров функции митохондрий: базальной дыхания, АТФ, утечки протонов, максимальная дыхания и дыхательной свободное мощности. Gluc = глюкоза; ОМ = олигомицин А; FCCP = карбонилцианид 4- (трифторметокси) фенилгидразон; А. А. = антимицин А; Рот = Ротенон Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

После запуска, Ecar и OCR измерения 1 TILл 15 для каждой лунки могут быть экспортированы в Excel, а также следующие параметры гликолиза может быть рассчитана из измерений Ecar следующим образом:

Номера для гликолиза подкисление = ср. РВЦА (1,2,3)

Гликолиз = ср. РВЦА (4,5,6) - ср. РВЦА (1,2,3)

Максимальная мощность гликолиза = ср. РВЦА (7,8,9) - ср. РВЦА (1,2,3)

Гликолитические резерв = AVG. РВЦА (7,8,9) - ср. РВЦА (4,5,6)

От темпов OCR, в ближайшие метаболические характеристики могут быть определены:

Номера для митохондриального дыхания = ср. (OCR 13,14,15)

Базальная дыхание = ср. (OCR 4,5,6) - ср. (OCR 13,14,15)

Производство АТФ = ср. (OCR 4,5,6) - ср. (OCR 7,8,9)

Протон утечки =ср. (OCR 7,8,9) - ср. (OCR 13,14,15)

Максимальная дыхание = ср. (OCR 10,11,12) - ср. (OCR 13,14,15)

Запасной дыхания способность (SRC) = ср. (OCR 10,11,12) - ср. (OCR 4,5,6)

figure-results-2
Рисунок 2:. Метаболические характеристики наивно (M0), LPS- (М1) и IL-4 (М2) поляризованные макрофаги Для каждого измерения, среднего и стандартной ошибки среднего (SEM) 8 отдельных скважин представлены. (А) Внеклеточные ставки подкисления (Ecar, в миль / ч / мин) и (б) темпы потребления кислорода (OCR, в пмоль / мин) измеряются для дифференциально-поляризованного (М1 и М2) и наивных макрофагов (M0). Все измерения были нормализованы для подсчета клеток (как измерено с CyQuant) и среднее количество клеток из наивных макрофагов был установлен в 1. Впроекция А = глюкоза; B = олигомицин; С = FCCP; D = A + антимицин Ротенон. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Как показано на фиг.2А, активации макрофагов LPS индуцирует с увеличена гликолитических метаболизм. Различия между LPS и ИЛ-4 обработанных макрофагах еще более очевидным, когда, глядя на уровень потребления кислорода (OCR) на рисунке 2В. В самом деле, в то время как максимальная окислительного метаболизма сильно подавлен в М (ЛПС), ИЛ-4 индуцирует базальной и особенно максимальный дыхание в М2 макрофаги. Следует отметить, что увеличение гликолиза довольно уникальным для M (ЛПС) и макрофагов не обязательно характеристика M1 макрофагов, так как М (IFN, макрофаги), не отображаются повышения гликолиза.

В целом, это внеклеточный анализ потока показывает, THAт ИЛ-4-индуцированной М2 макрофаги характеризуются повышенной окислительного метаболизма, и особенно высокий запасной дыхательной емкости (SRC), в то время как LPS-активированными макрофагами дисплей усиливается обмен веществ и гликолиза не обладают свободное дыхания потенциала.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Целью нашей лаборатории, чтобы понять, как макрофагов поляризации и функции, могут влиять на конечную цель, чтобы улучшить результат атеросклероза и других воспалительных условиях 12. Для оценки макрофагов поляризации, один, как правило, измеряет LPS (+ IFN,), индуцированного и IL-4-индуцированных экспрессию генов M1 и M2 маркерных генов (КПЦР), определяет IL-6, IL-12, TNF и NO секрецию (по ELISA и Грисс реакция) и рассматривает ИЛ-4 индуцированный CD71, CD206, CD273 и CD301 поверхности выражение (цитометрическим) и активность аргиназы 3,13. Кроме того, апоптоз анализы (по аннексина-V / окрашивания PI), фагоцитоз анализа (с флуоресцентные шарики латекса и / или pHrodo E.coli) и формирование пенистых клеток анализа (по поглощению DiI-oxLDL, LipidTOX нейтрального липида) окрашивания может быть выполнена с оценить функциональность макрофагов 14. Кроме того, внеклеточный анализ потока могут быть выполнены, чтобы измерить биоэнергетики профили поляризованного Macмакрофаги как новый и альтернативной функциональной считывания.

Эта рукопись показывает, что макрофагов поляризации вызывает метаболический перепрограммирование с ЛПС-индуцированной макрофагами коммутации к увеличению гликолиза в качестве источника энергии. С другой стороны, ИЛ-4-индуцированные М2 макрофаги использовать митохондриальную окислительное фосфорилирование в качестве основного источника АТФ. Важно отметить, что метаболический перепрограммирование не только дает энергию для конкретных требований М1 и М2 поляризованных макрофагах. В самом деле, метаболические изменения влияют метаболитов концентраций, которые являются прямыми регуляторами макрофагов фенотипа 10,15,16. Следовательно, макрофагов метаболизм не только характеристика (как показано здесь на рисунке 2), но также водителем различных состояний поляризации макрофагов и это новое знание поддерживается быстрый рост научно-исследовательской сфере immunometabolism в течение последних нескольких лет.

Тем не менее, надежные измерения метаболических профилей в макрофаги остается сложной и имел свои ограничения. В этом исследовании, внеклеточный анализатор потока применяется для решительно измерить гликолиза, гликолитический резерв, максимальный гликолитический потенциала, без гликолитический подкисление, базальную и максимальную дыхание, производство АТФ, свободное дыхания потенциала, утечку протонов и без дыхание митохондрий в режиме реального времени в минимальном количестве макрофагов.

Таким образом, мы изменили и улучшили протоколы производителя следующим образом. Стандартная Мито Стресс-тест (# 103015-100) предлагает использовать среду с глюкозой и пирувата и протокол с 3 инъекции (OM, FCCP, А.А. / красный). Мы решили начать с анализа глюкозы / пируват-среде, свободной, добавить глюкозу в качестве первой инъекции в порту A (как в гликолиза стресс-тест # 103020-100) и добавить пирувата вместе с разобщающий FCCP в порту С. В этом случае все соответствующие параметры гликолиза получены из измерений Ecar 1-9 и всей соответствующей информации о mitochondriаль функция из измерений OCR 4-15.

Обратите внимание, что очень важно, чтобы придать пируват вместе с FCCP топлива максимальный дыхание на разобщение. Перед использованием этой комбинированной протокол, следует также проверить, что 2-дезокси-D-глюкоза (2-DG) снижает уровень Ecar после анализа на базальных значений (1-3), и что записанные скорости Ecar 4-6 действительно из-за гликолиза. Кроме того, нужно понимать, что концентрации соединений и число клеток, используемые в этой рукописи действительны для мозга, полученных макрофагов костей и RAW264.7 макрофагов клеточных линий и должен быть оптимизирован для других типов клеток. Кроме того, следует отметить, что M-CSF, который используется для генерации мозга, полученных макрофаги костного способствует М2-типа противовоспалительное фенотип. Поэтому Представленные результаты от мозга, полученных макрофагов кости могут быть не полностью сопоставима с измерениями с первичной ткани резидентных макрофагов или макрофаги клеточных линий, которые не требуют M-CSF в течение клеточного culturiнг.

По сравнению с существующими методами, этот протокол требует минимальное количество макрофагов и быстро обеспечивает практически все основные метаболические характеристики клеток. Это приводит к достаточно избыточных клеток для выполнения других иммунологических анализах, и даже клетки, используемые для профилирования биоэнергетической еще может быть использована для других предназначена после анализа. Кроме того, особенно 96-луночный планшет формата позволяет оценить несколько условий в реальном времени, в то же время. Тем не менее, разница между отдельных скважин может быть значительным, и поэтому использование по крайней мере 4 скважин в состоянии часто желательно. Взятые это ограничение во внимание, описанный анализ внеклеточного поток по-прежнему позволяет работать более чем 10 экспериментальных условий (п = 6) сразу, что гораздо больше, чем традиционные методы.

В целом, эта статья предоставляет простой и воспроизводимый функциональный анализ, позволяющий измерения всю необходимую гликолиза и митохондриального параметровметры в поляризованных макрофагов подмножеств. Этот метод может служить в качестве будущего приложения для оценки функции макрофагов и оценить эффект различных манипуляций (например, ген сбить, новые фармацевтические препараты и т.д.) на (метаболического) фенотипа макрофагов в. Таким образом, внеклеточные потока данных может быть использован в сочетании с другими анализами, чтобы углубленный характеристику состояния активации макрофагов.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Свободный доступ к этой статье спонсируется конек Bioscience.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ян Ван ден Босхе получил грант Junior Postdoc от Нидерландского фонда сердца (2013T003) и грант VENI от ZonMW (91615052). Менно де Винтер является признанным исследователем Нидерландского фонда сердца (2007T067), получает грант Нидерландского фонда сердца (2010B022) и является стипендиатом AMC. Мы также выражаем признательность Нидерландской инициативе по исследованию сердечно-сосудистых заболеваний, Голландской федерации университетских медицинских центров, Нидерландской организации исследований и разработок в области здравоохранения и Королевской академии наук Нидерландов за поддержку проекта GENIUS «Создание наилучших научно обоснованных фармацевтических мишеней для лечения атеросклероза» (CVON2011-19). Мы выражаем признательность компании Seahorse Bioscience за то, что она сделала возможной публикацию в открытом доступе. Авторы благодарят Рикельта Хауткупера и Винсента де Бура (Лаборатория генетических метаболических заболеваний, Академический медицинский центр, Амстердам, Нидерланды) за всю предыдущую помощь в работе с анализатором морских коньков.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Иглы 23G и 25GBecton Dickinson#300800 и #300600К промытому костному мозгу
10 мл шприцыBecton Dickinson#307736К промытому костному мозгу
чашки ПетриGreiner#639161К культивированию клеток костного мозга
CyQUANT Cell Proliferation Assay kit Молекулярные зонды#C7026Для количественного определения клеток в более поздний момент времени (работает только для адгезивных клеток)
Набор для анализа прямой пролиферации клеток CyQUANT Молекулярные зонды#35011Для количественного определения клеток сразу после анализа (неадгезивные клетки)
XFe96 микропланшет клеточной культурыSeahorse Bioscience#101085-00496 луночный планшет, в котором культивируются клетки и в котором проводится
анализ рекомбинантный мышиный интерлейкин-4 (IL-4)Peprotech#214-14-BИспользуется для индуцированной активации
альтернативных макрофаговлипополисахарид (ЛПС)Сигма#L2637картридж
датчика морского конька для провоспалительного стимула Seahorse Bioscience#102416-100Содержит зонды для измерения pH и O2
Seahorse XF Calibrant Seahorse Bioscience#100840-000Требуется гидратация зондов в течение ночи 
Базовая среда XF Seahorse Bioscience#102353-100Бесбуферная среда, позволяющая эффективно измерять изменения pH
L-глутаминLife Technologies#25030-081
D-(+)-глюкозаSigma#G8769Способствует гликолизу после добавления в клетки
олигомицина A Sigma#75351Ингибирует митохондриальную АТФ-синтазу
FCCP ( Карбонилцианид 4-(трифторметокси)фенилгидразон)Sigma#C2920Разъединяет митохондриальное дыхание
100 мМ Раствор пирувата натрияLonza#BE13-115EОбеспечивает максимальное митохондриальное дыхание без необходимости гликолиза
АнтимицинА Sigma#BE13-115EA8674Ингибирует комплекс III митохондрий
RotenoneSigma#BE13-115EA8674R8875Ингибирует комплекс I митохондрии
Casy Cell CounterRoche Diagnostics#05 651 697 001Инструмент для подсчета клеток
anti-CD16/CD32eBioscience#14-0161Fc-рецептор блокирует проточную цитометрию
anti-F4/80-APC-eFluor780 eBioscience#47-4801Антитело к окрашиванию макрофагов
anti-CD11b-FITCeBioscience#11-0112Антитело к окрашиванию макрофагов

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41, 14-20 (2014).
  2. Hoeksema, M. A., et al. IFN gamma Priming of Macrophages Represses a Part of the Inflammatory Program and Attenuates Neutrophil Recruitment. J Immunol. , (2015).
  3. Vanden Bossche, J., et al. Pivotal Advance Arginase 1 independent polyamine production stimulates the expression of IL 4 induced alternatively activated macrophage markers while inhibiting LPS-induced expression of inflammatory genes. Journal of leukocyte biology. 91, 685-699 (2012).
  4. Pearce, E. L., Pearce, E. J. Metabolic pathways in immune cell activation and quiescence. Immunity. 38, 633-643 (2013).
  5. Yang, L., et al. PKM2 regulates the Warburg effect and promotes HMGB1 release in sepsis. Nature communications. 5, 4436(2014).
  6. Freemerman, A. J., et al. Metabolic reprogramming of macrophages glucose transporter 1 (GLUT1) mediated glucose metabolism drives a proinflammatory phenotype. The Journal of biological chemistry. 289, 7884-7896 (2014).
  7. Tavakoli, S., Zamora, D., Ullevig, S., Asmis, R. Bioenergetic profiles diverge during macrophage polarization implications for the interpretation of 18F FDG PET imaging of atherosclerosis. J Nucl Med. 54, 1661-1667 (2013).
  8. Vats, D., et al. Oxidative metabolism and PGC 1beta attenuate macrophage mediated inflammation. Cell metabolism. 4, 13-24 (2006).
  9. Huang, S. C., et al. Cell intrinsic lysosomal lipolysis is essential for alternative activation of macrophages. Nature immunology. 15, 846-855 (2014).
  10. Tannahill, G. M., et al. Succinate is an inflammatory signal that induces IL 1beta through HIF 1alpha. Nature. 496, 238-242 (2013).
  11. Ying, W., Cheruku, P. S., Bazer, F. W., Safe, S. H., Zhou, B. Investigation of macrophage polarization using bone marrow derived macrophages. J Vis Exp. (76), (2013).
  12. Hoeksema, M. A., et al. Targeting macrophage Histone deacetylase 3 stabilizes atherosclerotic lesions. EMBO Mol Med. 6, 1124-1132 (2014).
  13. Vanden Bossche, J., et al. Alternatively activated macrophages engage in homotypic and heterotypic interactions through IL 4 and polyamine induced E cadherin catenin complexes. Blood. 114, 4664-4674 (2009).
  14. Van den Bossche, J., et al. Inhibiting epigenetic enzymes to improve atherogenic macrophage functions. Biochem Biophys Res Commun. 455, 396-402 (2014).
  15. Galvan Pena, S., O Neill, L. A. Metabolic reprograming in macrophage polarization. Frontiers in immunology. 5, 420(2014).
  16. Zhu, L., Zhao, Q., Yang, T., Ding, W., Zhao, Y. Cellular metabolism and macrophage functional polarization. International reviews of immunology. 34, 82-100 (2015).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

M1M2

Похожие статьи