Методическая статья

Разработка коллоидного золота на основе Иммунохроматографические тест-полоски для обнаружения китообразных миоглобина

DOI:

10.3791/53433

⸱

13 июля 2016 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Veterinary Medicine, National Chiayi University, 2Department of Microbiology and Immunology/Graduate Institute of Biomedical and Biopharmaceutical Sciences, National Chiayi University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает разработку двух моноклональных антител (mAb) класса IgG, сильно реагирующих на миоглобин китообразных. Эти mAb наносятся на иммунохроматографическую тест-полоску из коллоидного золота на основе формата «сэндвич» для дифференциации Mb китообразных от тюленей и других животных.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает разработку иммунохроматографического тест-полоска коллоидного золота на основе формата сэндвича, который может быть использован для дифференциации миоглобина (Mb) китообразных от миоглобина тюленей и других животных. Полоса обеспечивает быстрый и оперативный скрининг на мясо китообразных, тем самым ограничивая его незаконную торговлю и потребление. Были разработаны два моноклональных антитела (mAb) с реакционной способностью к Mb китообразных. Были проанализированы аминокислотные последовательности антигенных реактивных областей Mb от различных животных с целью создания двух синтетических пептидов (общего пептида и специфического пептида) и последующего увеличения mAb (подкласс IgG1). mAb отбирали из гибридом, скринингованных с помощью непрямого иммуноферментного анализа, вестерн-блоттинга и дот-блота. CGF5H9 был специфичен для Mb кроликов, собак, свиней, коров, коз и китообразных, в то время как он показал слабое или полное отсутствие сродства к Mb кур, тунца и тюленей. CSF1H13 может связывать тюленей и китообразных с сильным сродством, но не проявляет сродства с другими животными. В этом исследовании были использованы образцы китообразных из четырех семейств (Balaenopteridae, Delphinidae, Phocoenidae и Kogiidae), и результаты показали, что эти два mAb обладают широкой способностью связываться с Mbs разных китообразных. Эти mAb наносили на иммунохроматографическую тест-полоску коллоидного золота типа «сэндвич». CGF5H9, который распознает многие виды, был мечен коллоидным золотом и использовался в качестве антитела для обнаружения. CSF1H13, который был покрыт на тестовой зоне, обнаружил наличие китообразных и тюленей Mbs. Образцы мышц тунца, курицы, тюленя, пяти видов наземных млекопитающих и 15 видов китообразных были протестированы в трех экземплярах. Все образцы китообразных показали положительные результаты, а все остальные образцы показали отрицательные результаты.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Исторически мясо китообразных потреблялось во многих частях мира, и это потребление продолжается и сегодня1. Из-за трофического уровня китообразных, известно, что в их мясе присутствует высокий уровень ртути и других токсинов2. Таким образом, потребление мяса китообразных может привести к проблемам со здоровьем не только для групп высокого риска, таких как беременные женщины, но идля населения в целом. Кроме того, заражение мяса китообразных зоонозными или потенциально зоонозными патогенами также может произойти в процессе его переработки и хранения4. Даже опытным агентам сложно определить мясо китообразных только по внешнему виду. Поэтому требуется надежный научный метод идентификации, чтобы отличить мясо китообразных от других видов мяса. Это помогло бы ограничить потребление мяса китообразных.

Современные методы идентификации видов включают молекулярные методы и иммунологические методы. Молекулярные методы, такие как полимеразная цепная реакция (ПЦР) и секвенирование ДНК, могут быть использованы для идентификации образцов не только изсырого мяса 5 и разложившихсяобразцов6, но и из обработанных пищевых продуктов, таких как вареная колбаса и корма7,8. Иммунологические методы, такие как иммуноферментный анализ (ИФА), обычно применяются в производстве продуктов питания для определения содержания мяса, например, в свинине9, говядине10 исоме 11. Анализ ДНК на основе ПЦР для идентификации мяса китообразных доступен12 и помог предотвратить незаконную международную торговлю мясом китообразных в Японии, Южной Корее, Филиппинах, Тайване, Гонконге, России, Норвегии и Соединенных Штатах1. Эти методы эффективны и надежны, но они могут занимать часы или дни и включать в себя трудоемкие шаги. Идентификация мяса китообразных обычно основана на молекулярных методах, и в настоящее время иммунологического метода не существует. Для регулирующих органов крайне желательно разработать надежную и быструю методику, которая может быть использована в полевых условиях для идентификации мяса китообразных.

Иммунохроматографические полоски используются в качестве инструментов обнаружения с преимуществом получения быстрого результата с помощью простого протокола, который подходит для использования в полевых условиях. Принципы работы иммунохроматографической полоски и ИФА очень схожи и включают в себя антитела, антигены и метки. При разработке иммунохроматографических полосок использовалось множество различных этикеток, таких как коллоидное золото, углерод и латекс. В настоящее время этот метод обычно используется для обнаружения антибиотиков, токсинов, бактерий и вирусов13, но редко используется для определения белков в мясе14,15. В данной работе мы предлагаем иммуноферментный анализ с латеральным потоком для быстрого обнаружения миоглобина (Mb) китообразных.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Заявление по этике: Исследование было проведено в соответствии с международными стандартами и утверждены по уходу и использованию комитета Institutional животных (IACUC) Национального университета Цзяи, утверждение ID по: 99022. китообразных использование образца разрешено Совета по сельскому хозяйству Тайваня (исследований разрешения 100M-02.1-C-99).

1. Мышцы Подготовка проб и SDS-PAGE

Примечание: Образцы мышцы от 23 видов , включая 16 видов морских млекопитающих, 5 видов наземных млекопитающих, тунец и курица были использованы в этом исследовании (таблица 1). Китообразных образцы мышц были получены из скрученных лиц, рыбное прилов и конфискации. Кролик, крысы, собаки, и ткани куриные мышцы были получены от болезней животных диагностического центра Национального университета Цзяи. Образцы говядины, свинины, баранины, и тунец были приобретены у местного супермаркета. Мышцы образец тюлень (Phoca vitulina ) была предоставлена ​​Ocean Park Farglory. додецилсульфата натрия электрофорез в полиакриламидном геле (SDS-PAGE), использовали для разделения растворимых белков с различными молекулярными массами в образцах мышц.

  1. Хранить все образцы при -20 ° С до использования.
  2. Предварительно прохладное известковый раствор при -20 ° С. Затем положить 3 г замороженного образца мышцы в него.
  3. Однородный образца с 10 мл холодного забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS) с использованием гомогенизатора тканей.
  4. Центрифуга гомогенизированный образец при 10000 х г в течение 10 мин при температуре 4 ° С. Собирают супернатанты и хранить при -20 ° С до использования.
  5. Подготовка 5 мл 5% концентрирующий гель (3,07 мл дистиллированной воды, 1,25 мл 4-кратным верхнего буфера геля рН 6,8, 625 мкл 40% -ного акриламида, 50 мкл 10% персульфата аммония (APS), и 5 мкл тетраметилэтилендиамина ( TEMED)) и 10 мл 15% разделяющий гель (3,65 мл дистиллированной воды, 2,5 мл 4 раза ниже, гель буфер рН 8,8, 3,75 мл 40% акриламид, 100 мкл 10% APS,и 4 мкл TEMED).
    1. В электрофорез клетке, налить концентрирующий гель (5% акриламид) на верхней части разделительного геля (15% акриламид), после того, как последний затвердеет. Вставьте гель гребень в геле штабелирования.
  6. Выполните СТР в соответствии со следующими условиями: начальное условие запуска: 100 вольт, 20 мин и окончательное условие: 120 вольт, 40 мин.
  7. Пятно гель Кумасси бриллиантовым синим при комнатной температуре в течение 30 мин до тех пор, пока гель не является равномерно синего цвета.
    Примечание: Окрашивание завершена, когда гель уже не видно в растворе красителя.
  8. Destain его с раствором уксусной кислоты (10%) при комнатной температуре в течение 1 часа. Полосы начнут появляться. Продолжить Обесцвечивание при 4 ° С в течение ночи, пока фон не станет прозрачным.

2. Синтез пептидов и моноклональных антител Производство

  1. Получение последовательности аминокислот Mb из GenBank включая тунца, курицы, страуса, домашних млекопитающих, тюленей и 18 видовкитообразных (таблица 2).
  2. Выравнивание последовательностей с помощью соответствующего программного обеспечения 16:
    1. Запустите Alignment Explorer , выбрав Align: Редактировать / Построить выравнивания на панели запуска; выберите Создать новый Выравнивание и нажмите кнопку OK. Появится диалоговое окно с вопросом: "Вы создаете ДНК или белка выравнивания последовательностей?"
    2. Нажмите на кнопку с надписью "Протеин"; выберите Данные: Часы работы: Получение последовательности из файла и выбрать файл последовательности; выберите Правка: Выделить все команды меню , чтобы выбрать все сайты для каждой последовательности в наборе данных для создания множественного выравнивания последовательностей.
    3. Выберите Выравнивание: Выравнивание по ClustalW из главного меню для выравнивания выбранных данных последовательностей с использованием алгоритма ClustalW; выберите "BLOSUM" в качестве белка весовой матрицы затем нажмите кнопку OK.
  3. Анализ выравнивание последовательности:
    1. Фокус на 5 антигенной реактивной сиTES 17: участок 1 (AKVEADVA, 15-22), сайт 2 (KASEDLK, 56-62), участок 3 (ATKHKI, 94-99), сайт 4 (HVLHSRH, 113-119) и 5 - сайт (KYKELGY, 145- 151) и найти фрагмент консервативна среди китообразных. * (Звездочка, символ консенсуса в створе (протокол 2.2.3)) указывает на позиции, которые имеют одну, полностью сохраняющийся остаток. Были обнаружены следующие фрагменты сохраняющиеся в китообразных: последовательность KASEDLKKHG (которая включает в себя участок 2) и последовательность HVLHSRHP (которая включает в себя участок 4).
  4. Обобщить фрагменты последовательностей-кандидатов в соответствии с анализом последовательности и конъюгата с белком овальбумином (OVA) в качестве белка-носителя с использованием коммерческих услуг.
    1. Добавить гидрофобные аминокислоты (например, метионин) к N-концу антигенной реактивного сайта для предотвращения пептида из разложения (например, М-KASEDLKKHG).
    2. Удлините С-конец антигенной реактивного сайта для раскрытия основной антигенного сайта на иммуноцита. Кроме того, conjuВорота пептид с OVA путем добавления цистеина (Cys, С) к С-концевой (например, M-KASEDLKKHG-NTVL-C).
  5. Эмульсию адъювант Фрейнда для иммуногена 1 или неполный адъювант Фрейнда для иммуногена 2 с равным объемом каждого синтетического пептида в PBS (3 мл, конечная концентрация 30-50 мкг / 100 мкл).
  6. Инокулируйте иммуноген 1 (0,1 мг) подкожно в каждую из 5 самок мышей линии BALB / C.
  7. Выполните подкожного бустерные инъекции пять раз с использованием иммуногена 2 с двухнедельными интервалами и собирать тест-сывороток путем отбора проб хвост клип из мышей перед каждым усилителем.
  8. Определение титра сывороток для первого скрининга.
    1. Растворить 100 мкг свободного пептида в 25 мл реакционного буфера и аликвоты по 50 мкл раствора в каждую лунку 96-луночного планшета. Добавить раствор реагента сочетания 10 мкл в каждую лунку и смешайте пластину. Инкубируйте планшет в течение 2 ч при комнатной температуре.
    2. Удалить содержимое скважины,мыть каждую лунку 3 раза дистиллированной водой, и блокировать пластины путем добавления 200 мкл блокирующего раствора. Инкубировать в течение 1 часа при комнатной температуре. Удалить содержимое и промыть каждую лунку 3 раза дистиллированной водой.
    3. Выполните непрямой ELISA (протокол 5,1-5,7) для определения титра сывороток для первого скрининга. Выберите мышь с самым высоким титром (самая высокая оптическая плотность) для сбора селезенке.
  9. За три дня до сбора селезенке, прививают 0,1 мг иммуногена 1 подкожно в мышь, представляя самый высокий титр.
  10. Сбор клеток селезенки от иммунизированных мышей , отобранных и плавким предохранителем с мышиной миеломы F0 (sp2 / 0-AG14) для получения гибридомных клеток для генерации мАт 18.
  11. Через 14 дней после слияния, выбора положительных клонов путем скрининга реакционной способности супернатантов гибридомы в направлении свободного синтетического пептида с использованием непрямой ELISA (Протокол 5,1-5,7).
  12. Развести клетки соответствующего числа на лунку для maximizИНГ доля скважин, которые содержат только один единственный клон (разведение клонирования).
    1. Добавьте 100 мкл культуральной среды клеток во все лунки в 96-луночного планшета, кроме скважины A1, который остается пустым.
    2. Добавьте 200 мкл суспензии клеток в лунке A1. Затем быстро передать 100 мкл от А1 до В1 и перемешать, осторожно пипеткой. Повторите эти 1: 2 разведений вниз по всей колонне, а затем выбросить 100 мкл из H1 так, что она заканчивается тем же объемом, что и над ним скважин.
    3. Добавьте еще 100 мкл среды в колонну 1 с 8-канальный микропипетки. Затем быстро передавать по 100 мкл из каждой из лунок в колонке 1 для тех, кто в колонке 2, используя тот же пипетку, и перемешать, осторожно пипеткой.
    4. Используя те же советы, повторите описанные выше 1: 2 разведений по всей пластине. Откажитесь 100 мкл из каждой из лунок в последней колонке.
    5. Довести конечный объем всех лунок к 200 мкл путем добавления 100 мкл среды в каждую лунку. Выдержите плаТ.Е. ненарушенных при 37 ° C в увлажненной CO 2 инкубаторе.
    6. Проверьте каждую лунку и отметьте все лунки, которые содержат только одну колонию. Проводят два или более клонирований до> 90% из лунок, содержащих отдельные клоны не имеют положительный результат на получение антитела.
  13. Экран клонов с помощью Вестерн-блоттинга и дот-блоттинга (протокол 3.1-4.6). Затем субкультура колонии из колодцев в более крупные сосуды, чтобы расширить клетки для получения мАт. Обычно каждый клон переносят в отдельную лунку в 12-ти или 24-луночный планшет.
  14. Измерьте сродство между моноклональными и мышечных экстрактов из коровы, козы, свиньи, собаки, кролика, тунец, курица, печать и четырех представительных видов китообразных с помощью Вестерн-блоттинга и дот-блоттинга (протокол 3.1-4.6).
  15. Привить выбранных гибридомных клеток (до 3 - х 10 6) внутрибрюшинно мышам , чтобы вызвать асцит. Вздутие живота, как правило, проявляется в течение 7-10 дней после инъекции гибридом. Сбор жидкости с помощью иглы для подкожных инъекций(Менее 20 калибра).
  16. Центрифуга асцитной жидкости (10000 мкг в течение 10 мин) для удаления клеток и мусора. Смесь фильтруют через фильтр 0,45 мкм. Добавить от 1 до 20 мл пробы, 15 мл буфера для связывания, и от 3 до 5 мл буфера для элюции в белковую колонке G-сефарозе. Собирают элюции фракции, содержащей очищенного антитела из асцитической жидкости мышей.
  17. Определение изотипа антитела комплект Изотипирование антител с использованием инструкции производителя.

3. Вестерн-блот

  1. Готовят 2x буфера загрузки, содержащий бета-меркаптоэтанола (BME) путем смешивания 950 мкл 2х Laemmli буфера для образца с 50 мкл BME. Развести мышечных супернатантов (протокол 1,1-1,4) в загрузочном буфере с соответствующим соотношением для получения хороших сигналов: 1:50 (китообразные и печать) и 1: 5 (домашних животных и тунца) при использовании поликлональной кроличьей антитела против человеческого Mb, и 1: 1 (свинья, кролик, курица и тунец), 1: 5 (коровы, козы и собаки) и 1:25 (китообразные и печать), когдаntibody от супернатанта гибридомы.
  2. Образец тепла при температуре 95 ° С в течение 5 мин. Загружают образцы в лунки SDS-PAGE гель (4% акриламид укладку и 12% акриламид разделяющего) вместе с маркерами молекулярной массой. Выполнить геля в течение 5 мин при 50 В, то увеличить напряжение до 150 В, чтобы закончить бег в течение приблизительно 1 ч.
  3. Поместите гель в буфере передачи 1х в течение 15 мин. Передача выделенного белка на нитроцеллюлозу (NC) мембраны после того, как они отделены друг от друга СТР. Передача может быть сделано при 100 V в течение 60-90 мин.
  4. Готовят блокирующий раствор: 1X PBS, содержащим 0,1% Tween 20 с 5% обезжиренного сухого молока. Блок мембраны NC в 25 мл блокирующего раствора при комнатной температуре в течение 1 часа. Промыть три раза в течение 5 мин каждый с 15 мл фосфатно-буферным солевым раствором с Tween 20 (PBST).
  5. Инкубируйте мембраны и первичное антитело (асцитической жидкости или супернатанта гибридомы) в 10 мл буфера для разведения антитела разбавили 5% блокирующего раствора при 4 ° С в течение ночи.
  6. Промыть MEMBRANе три раза снова с PBST для очистки от чрезмерного антитела.
  7. Инкубируйте мембрану с щелочной фосфатазы-конъюгированные антитела из козы против мышиного IgG в соотношении 1: 1250 в блокатора растворе при осторожном перемешивании в течение 1 ч при комнатной температуре.
  8. Промыть мембрану снова и инкубировать ее в 5-бром-4-хлор-3-индолил фосфат хлорид / п-тетразола (BCIP / NBT) фосфатазы смесь субстрата в течение 10 до 20 мин до развития окраски.
  9. Остановить реакцию путем промывки мембраны в нескольких сменах дистиллированной воды.

4. Дот-блот

  1. Развести мышечных супернатантов (протокол 1,1-1,4) в 5% бычьего сывороточного альбумина (БСА) в PBST с соответствующим соотношением для получения хороших сигналов: 1: 5 для домашних животных и тунца, и 1:25 для китообразных и печатью. Пятно 5 мкл проб на мембрану. Минимизация область, которую раствор проникает (обычно диаметром 3-4 мм), применяя его медленно.
  2. Высушите мембрану при комнатной температуре (например, </ EM> в ламинарном потоке в течение 30-60 мин), блокируют его с блокирующим раствором в чашке Петри в течение 1 ч при комнатной температуре, и промыть его с помощью PBST.
  3. Инкубируйте мембрану с первичным антителом (МАт из супернатанта гибридомы в соотношении 1: 10000 или асцитной жидкости при 1: 100 000 разведенного в 5% блокирующего раствора) в течение 1 ч при комнатной температуре.
  4. Использование PBST, чтобы промыть мембрану три раза в течение 5 мин каждый, чтобы удалить избыток антитела, а затем инкубируют его с вторичным антителом (щелочная фосфатаза-конъюгированным козьим антимышиным IgG в соотношении 1: 1,250 в 5% блокирующем растворе) в течение 1 ч при комнатной температуре ,
  5. Промойте мембрану снова и инкубировать ее в смеси фосфатазы субстрата BCIP / NBT в пределах от 10 до 20 мин до развития окраски.
  6. Остановить реакцию путем промывки мембраны в нескольких сменах дистиллированной воды.

5. Непрямой ИФА

  1. Приготовьте промывочный буфер (0,002 М имидазола-солевом буферном растворе с 0,02% твина 20). Промыть пластины 3 раза с промывкойбуфер между каждым следующим шагом (протокол 5,2-5,5).
  2. Приготовьте 1:25 разбавление мышечных супернатантов (протокол 1,1-1,4) в буфере для нанесения покрытия. Coat 96-луночный ELISA-пластину с 100 мкл разведенного супернатантов при температуре 4 ° С в течение ночи и блокируют его с блокирующим буфером (1% BSA в PBS) в течение 1 ч при комнатной температуре.
  3. Приготовьте 1: 2000 разведение очищенного мАт с разбавленным буфером и добавляют 100 мкл разведенного мАт в каждую лунку. Инкубируйте планшет в течение 1 ч при комнатной температуре.
  4. Добавить козий против мышиного IgG, конъюгированного с пероксидазой хрена (1: 200 разбавлении в разбавленном буфере) для дальнейшей инкубации.
  5. Добавить субстрата пероксидазы в каждую лунку (100 мкл / лунку) и инкубируют в течение 10-15 мин.
  6. Остановить реакцию фермента пероксидазы стоп-раствора (100 мкл / лунку), когда наблюдается развитие окраски.
  7. Считать оптическую плотность при 450 нм с использованием микропланшет-спектрофотометра.

6. Получение коллоидного золота-меченого мАт

Примечание: Цвет раствора коллоидного золота и смесь всегда должна быть красной. Отрегулируйте рН, концентрацию биосфера, скорость центрифуги, когда черный осадок заметили. Шаги 6.1 и 6.2 являются шаги по оптимизации.

  1. Добавить очищенный обнаружение мАт (50 мкг / мл, 3 мкл) в 100 мкл коллоидного раствора золота с значениями рН колеблется от 5-9. Минимальный рН, который сохраняет красный цвет в течение двух часов, считается оптимальным рН. Примечание: В данном исследовании, 0,1 М карбоната калия используется для регулировки коллоидный золота (40 нм), рН раствора до 8,0 (оптимальное значение рН).
  2. Добавляют различные количества очищенного обнаружения мАт (500 мкг / мл, 1-20 мкл) в 100 мкл коллоидного раствора золота при рН 8,0. Примечание: Оптимальная концентрация в данном исследовании, составляет 6 мкг / мл (отсутствие черного осадка).
  3. В соответствии с приведенными выше результатами, добавьте 60 мкг очищенного обнаружения мАт по каплям к 10 мл коллоидного раствора золота. Эмульгировать смесь осторожно при комнатной температуре в течение 10 мин. Объявлениег 2 мл 5% раствора БСА в PBS (рН 7,4) к смеси и осторожно эмульгировать при комнатной температуре в течение 15 мин, чтобы уменьшить фоновых помех.
  4. Центрифуга смесь при 10000 х г в течение 30 мин при температуре 4 ° С.
  5. Удалить супернатант с неконъюгированного антитела тщательно и подвесить Полученные гранулы в 4 мл PBST, содержащем 1% бычьего сывороточного альбумина и 0,1% Tween 20, и повторяют центрифугирование и подвески несколько раз.
  6. Приостановка финальные преципитаты в 1 мл PBST и хранить его при температуре 4 ° C до использования.

7. Строительство Иммунная Газа

Примечание: На рисунке 1 показана конструкция иммунной полосы. Подготовить и собрать полоски в низкой влажностью лабораторных условиях окружающей среды (<20% относительной влажности) в течение длительного срока хранения (> 1 год). Размеры прокладок и мембраны: площадка парного 300 мм х 10 мм, впитывающей подушечки 300 мм х 24 мм, образец накладка 300 мм х 24 мм, NC мембрана 300 мм х 25 мм, картонная 300х 80 мм.

  1. Добавить коллоидное золото-меченых решение MAB со стадии 6.6 с микропипетки насытить сопряженную площадку, а затем высушить его при температуре 37 ° С в течение 1 часа перед сборкой.
  2. Распределить специфического антигена захвата мАт (500 мкг / мл) на испытательной зоне, и кроличьи антитела мыши IgG (500 мкг / мл) на контрольной зоне для обнаружения мАт на мембране НК с использованием пипетки или immunostrip принтера. Поддерживать расстояние (> 5 мм) между двумя зонами, чтобы избежать помех.
  3. Вставить сопряженную панель, абсорбирующей прокладки и мембраны NC на монтажном столе с двухсторонней ленты.
    Примечание: перекрывающийся колодки с каждой стороны мембраны NC примерно 2 мм. Недопустимом строительство полосы приведет к неполному теста.
  4. Поместите образец площадку над сопряженного площадки (2 мм) и вставить его на монтажном столе.
  5. Создание 6 мм шириной полосы с помощью резака бумаги. Упаковать полоски в мешок алюминиевой фольги с осушителем, и хранить их при температуре 4 ° С до использования.

8. Перекрестная реактивность Тест

  1. Однородный 0,03 г сырого образца мышечной с 1 мл PBS (содержащей 0,1% BSA) в центрифужной пробирке объемом 1,5 мл с использованием бамбуковой палкой или размола стержень.
  2. Держа полоску на конце, противоположном тестовых областей и окунуть образцовой прокладки часть в образец в течение 5-10 мин и наблюдать результат непосредственно.
    1. Дополнительно: Соберите 500 мкл супернатанта и перенести его в новую центрифужную пробирку.
      Примечание: Этот шаг предлагается, если сигнал не является очевидным, когда полоса непосредственно замачивают в супернатант.
  3. Проверьте различные образцы мышц в трех экземплярах.
    Примечание: Здесь мы протестировали тунец, курица, печать, 15 видов китообразных и 5 видов наземных млекопитающих.
  4. Есть пять независимых инспекторов повторить 8.3 пять раз, то есть, использовать 575 полос в общей сложности.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Моноклональные характеристики антител

Мы разработали два IgG 1 мАт (CGF5H9 и CSF1H13) , распознающие два синтетических пептидов (MKASEDLKKHGNTVLC и AIIHVLHSRHPAEFGC), соответственно, китообразных Mb, и они были использованы для создания сэндвич-типа коллоидного золота иммунохроматографический тест - полоски для быстрого обнаружения китообразных Mb. на рисунке 2 показано , что CGF5H9 обнаруживает китообразных и других млекопитающих как единый окраш...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Использование синтетического пептида, конъюгированного с белком-носителем является удивительно более эффективным по сравнению с родственным белком. Для техники сэндвич на основе, поскольку моноклональное антитело разработано с использованием эпитопов с известными относительные пути, два мАт в данном исследовании, вероятно, мешать взаимодействию друг с другом с антигеном-мишенью, эпитоп не. Кроме того, реакционная способность между нативного белка и антитела у мышей , иммунизированных с синтетическим пептидом-конъюгат мо...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим коллег из Тайваньского общества китообразных, Центра морской биологии и исследования китообразных Национального университета Ченг Кунг, Океанического парка Фарглори и Центра диагностики болезней животных Национального университета Цзяи за сбор образцов. Этот проект был профинансирован за счет гранта WCY от Совета по сельскому хозяйству Тайваня (100AS-02.1-FB99).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Фосфатно-солевой буферAMRESCOJ373
Protein G HP SpinTrap GE  Healthcare28-9031-34спиновая колонка, содержащая белок G сефарозу
IsoStrip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping KitRoche11493027001Изотипирующие полоски, предварительно покрытые антителами против мышиного Ig подкласса и легкой цепи
Mini Trans-BlotBio-Rad170-3935
Нитроцеллюлозная мембранаWhatmanZ613630
антитела Блокираторное решение LTK BioLaboratoriesДля минимизации неспецифических взаимодействий связывания неспецифических IgG в образцах
субстрата BCIP/NBT фосфатазы KPL50-81-00
Детектор белка HRP Microwell Kit, антимышиныйKPL54-62-18
Nunc Immunoplate MaxiSorp ELISA plateThermo  Fisher ScientificEW-01928-08
Мультискан  Считыватель EX ELISA Термо  Электрон  Корпорация51118170
Решение для коллоидного золота (40 нм) REGA biotechnology Inc.40-50 нм подходит для иммунополоскового
бычьего сывороточного альбуминаGibco15561-020
Экспресс-тест immno-strip принтерREGA biotechnology Inc.AGISMART RP-1000 Подходит только для мелкосерийного производства иммунополосок в целях исследований и разработок
Компоненты полос (мембраны с ЧПУ, прокладки для образцов (стекло #33, S& S), сопряженные прокладки (#16S, S& S) и абсорбирующие прокладки (CF6, Whatman))REGAbiotechnology Inc.
Фройнд с адъювантом и неполным Фройндом s adjuvant Sigma-AldrichF5881, F5506Используется для производства водно-масляных эмульсий иммуногенов
Акриламид, гелевого буфера, персульфата аммония (APS), тетраметилэтилендимина (TEMED)  ProtechGel препарат для SDS-PAGE
Coomassie brilliant blue R-250Bio-Rad1610436Окрашивание белка в гелях SDS-PAGE
Laemmli и β-меркаптоэтанолBio-Rad1610737, 1610710Разбавление образцов белка перед загрузкой на гели SDS-PAGE

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Robards, M. D., Reeves, R. R. The global extent and character of marine mammal consumption by humans: 1970-2009. Biol. Conserv. 144, 2770-2786 (2011).
  2. Booth, S., Zeller, D. Mercury, food webs, and marine mammals: implications of diet and climate change for human health. Environ. Health Perspect. 113, 521-526 (2005).
  3. Endo, T., et al. Total mercury, methyl mercury, and selenium levels in the red meat of small cetaceans sold for human consumption in Japan. Environ. Sci. Technol. 39, 5703-5708 (2005).
  4. Tryland, M., et al. Human pathogens in marine mammal meat. Norwegian Scientific Committee for Food Safety (VKM). , (2011).
  5. Matsunaga, T., et al. A quick and simple method for the identification of meat species and meat products by PCR assay. Meat Sci. 51, 143-148 (1999).
  6. Dalebout, M. L., Helden, A. V., van Waerebeek, K., Baker, C. S. Molecular genetic identification of southern hemisphere beaked whales (Cetacea: Ziphiidae). Mol. Ecol. 7, 687-694 (1998).
  7. Dalmasso, A., et al. A multiplex PCR assay for the identification of animal species in feedstuffs. Mol. Cell. Probes. 18, 81-87 (2004).
  8. Kesmen, Z., Sahin, F., Yetim, H. PCR assay for the identification of animal species in cooked sausages. Meat Sci. 77, 649-653 (2007).
  9. Liu, L., Chen, F. -C., Dorsey, J. L., Hsieh, Y. -H. P. Sensitive Monoclonal Antibody-based Sandwich ELISA for the Detection of Porcine Skeletal Muscle in Meat and Feed Products. J. Food Sci. 71, 1-6 (2006).
  10. Kotoura, S., et al. A Sandwich ELISA for the Determination of Beef Meat Content in Processed Foods. Food Sci. Techno. Res. 15, 613-618 (2009).
  11. Hsieh, Y. H., Chen, Y. T., Gajewski, K. Monoclonal antibody-based sandwich ELISA for reliable identification of imported Pangasius catfish. J. Food Sci. 74, 602-607 (2009).
  12. Ross, H. A., et al. DNA surveillance: web-based molecular identification of whales, dolphins, and porpoises. J.Hered. 94, 111-114 (2003).
  13. Ngom, B., Guo, Y., Wang, X., Bi, D. Development and application of lateral flow test strip technology for detection of infectious agents and chemical contaminants: a review. Anal. Bioanal. Chem. 397, 1113-1135 (2010).
  14. Muldoon, M. T., Onisk, D. V., Brown, M. C., Stave, J. W. Targets and methods for the detection of processed animal proteins in animal feedstuffs. Int. J. Food Sci. Technol. 39, 851-861 (2004).
  15. Rao, Q., Hsieh, Y. H. Evaluation of a commercial lateral flow feed test for rapid detection of beef and sheep content in raw and cooked meats. Meat Sci. 76, 489-494 (2007).
  16. Tamura, K., et al. MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods. Mol. Biol. Evol. 28, 2731-2739 (2011).
  17. Atassi, M. Z. Antigenic structure of myoglobin: the complete immunochemical anatomy of a protein and conclusions relating to antigenic structures of proteins. Immunochemistry. 12, 423-438 (1975).
  18. Zhang, C. Hybridoma technology for the generation of monoclonal antibodies. Methods Mol. Biol. 901, 117-135 (2012).
  19. Kao, D. J., Hodges, R. S. Advantages of a synthetic peptide immunogen over a protein immunogen in the development of an anti-pilus vaccine for Pseudomonas aeruginosa. Chem. Biol. Drug Des. 74, 33-42 (2009).
  20. Dolar, M. L., Suarez, P., Ponganis, P. J., Kooyman, G. L. Myoglobin in pelagic small cetaceans. J. Exp. Biol. 202, 227-236 (1999).
  21. Lo, C., et al. Rapid immune colloidal gold strip for cetacean meat restraining illegal trade and consumption: implications for conservation and public health. PLoS ONE. 8, e60704(2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Colloidal Gold Immunochromatographic Test StripCetacean Myoglobin DetectionMonoclonal Antibody DevelopmentPeptide Sequence AnalysisWestern Blot AnalysisDot Blot AnalysisIndirect ELISA ScreeningMuscle Sample HomogenizationNitrocellulose Membrane AssemblyRapid Field Detection

Похожие статьи