Method Article

В режиме реального времени изображений растений клеточной поверхности динамика с переменным углом эпифлуоресцентной микроскопии

DOI:

10.3791/53437

⸱

December 12th, 2015

1Graduate School of Frontier Sciences, The University of Tokyo

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Цель этого протокола заключается в демонстрации того, как контролировать флуоресцентно-меченого динамики белков на завод клеточной поверхности с переменным углом эпифлуоресцентной микроскопии, показывающие мигать точками GFP-тегами ПАТРУЛЬ 1, белка через мембрану, в клеточной коре устьичного комплекса в Резуховидка Таля.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Клеточная поверхность растения является его интерфейсом для восприятия сигналов окружающей среды; она реагирует на биологические изменения клетки, такие как перенос мембран и перестройка цитоскелета. Анализ изображений таких внутриклеточных событий в режиме реального времени и с высоким разрешением улучшит понимание биологии растительных клеток на молекулярном уровне. Эпифлуоресцентная микроскопия с переменным углом наклона (VAEM) — это новый метод, который позволяет получать высококачественные покадровые изображения флуоресцентно меченых белков на поверхности растительных клеток. В данной статье описаны практические процедуры подготовки образцов VAEM, настройки оптической системы VAEM, видеосъемки и анализа изображений. В качестве примера наблюдения ВАЭМ представлены репрезентативные результаты по динамике PATROL1. Это белок, необходимый для движения устьиц, который, как полагают, участвует в доставке протонной помпы к плазматическим мембранам в устьичном комплексе Arabidopsis thaliana. Наблюдение VAEM в режиме реального времени за защитными клетками и вспомогательными клетками семядолей A. thaliana показало, что флуоресцентно помеченные PATROL1 проявлялись в виде точечных структур на плазматических мембранах в течение нескольких секунд, а затем исчезали. Кимографический анализ данных VAEM определил временное распределение присутствия (называемое «временем пребывания») точечных структур. Использование VAEM обсуждается в контексте данного примера.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Поверхность растительной клетки, включая плазматическую мембрану и непосредственно прилегающую к ней цитоплазму, является основной областью восприятия и интеграции растительными клетками биотических и абиотических сигналов из внеклеточной среды. В ответ на эти сигналы компоненты клеточной поверхности, включая белки плазматической мембраны и цитоскелет коры, претерпевают динамические изменения в масштабе от нескольких секунд до1-4 минут. Таким образом, визуализация флуоресцентных белков на поверхности клетки в режиме реального времени и с высоким разрешением может пролить свет на реакцию растения на сигналы окружающей среды на молекулярном уровне.

Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия является мощным инструментом для определения локализации белка с флуоресцентными метками3, однако часто бывает трудно контролировать динамику белка в реальном времени из-за относительно долгого времени захвата. Новым методом мониторинга белков в растительной клетке в режиме реального времени является эпифлуоресцентная микроскопия с переменным углом наклона (VAEM), которая представляет собой адаптацию оборудования, обычно используемого для микроскопии полного внутреннего отражения (TIRF). В микроскопии TIRF источник света с флуоресценцией-возбуждением представляет собой затухающее световое поле, которое создается, когда угол входа лазера достаточно мал, чтобы полностью внутренне отражать свет на границе раздела стекло-вода. Глубина проникновения затухающего светового поля составляет около 100 нм. Микроскопия TIRF является выдающимся инструментом для визуализации отдельных молекул, таких как обнаружение экзоцитоза в клетках животных5. Тем не менее, мимолетный свет не может достичь плазматических мембран или цитоплазмы коры головного мозга в растительных клетках, потому что они имеют толстые клеточные стенки. Недавно биологи растительных клеток адаптировали оборудование для микроскопии TIRF, заметив, что лазер, если его наклонить немного глубже, чем при использовании для индуцирования явлений полного внутреннего отражения, может возбуждать поверхность образцов растительных клеток, что приводит к высококачественнойвизуализации растительных клеток. Глубина подсветки возбуждения изменяется путем регулировки угла входа лазера; Поэтому этот метод описывается как VAEM. Эта оптическая система также называется микроскопией TIRF с переменным углом (VA-TIRFM), поскольку существует вероятность того, что полное отражение может иметь место на границе клеточной стенки-периплазмы7, однако в этой статье используется термин VAEM, как указано в первом сообщении на растениях6.

Цель этого протокола — продемонстрировать практические процедуры использования VAEM для визуализации динамики флуоресцентно помеченных белков на поверхности растительных клеток. Кроме того, для анализа фильма VAEM описан протокол анализа изображений для количественной оценки времени пребывания (продолжительности присутствия) молекул. В качестве примера используется мерцание точками GFP-PATROL1 на клетках устьичного комплекса у семядолей Arabidopsis thaliana. PATROL1 был идентифицирован с помощью прямого генетического подхода в качестве причинного гена мутантного дефекта устьичного ответа у A. thaliana8. PATROL1 является растительным гомологом MUNC-13, который является прайминговым фактором в синаптическом везикуле экзоцитоза8. Считается, что в ответ на сигналы окружающей среды, такие как свет или влажность, PATROL1 обратимо регулирует доставку протонного насоса к плазматическим мембранам в устьичном комплексе. Каждый устьичный комплекс содержит пару защитных клеток8 и вспомогательных клеток9, и для движения устьиц им требуется протонный насос. В этих клетках GFP-меченый PATROL1 локализуется в точечных структурах, которые остаются на плазматической мембране менее 1 минуты9 минут.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка рассады

  1. Стерилизовать семена.
    1. Приготовьте раствор стерилизации путем добавления 500 мкл NaClO (активного хлора: 5,0%) и 1 мкл 10% Triton X-100 до 500 мкл стерильной воды.
    2. Место около 10 трансгенных А. THALIANA семена, несущие GFP-ПАТРУЛЬ 1 8 в 1,5 мл трубки.
    3. Добавить 1 мл 70% раствора этанола и тщательно перемешать путем обращения в пять раз. Оставить на 1 мин.
    4. Заметим, семена опускаются на дно пробирки. В чистом шкафу с ламинарным потоком, осторожно удалите 70% этанола, используя микропипетку, и добавить 1 мл раствора стерилизации. Все хорошо перемешать путем обращения в пять раз и оставить на 5 мин.
    5. Вымойте семена. Тем не менее работы в асептических условиях на чистом столе, аккуратно удалите раствор, используя микропипетку, и добавить 1 мл стерильной воды. Повторите это пять раз. В стерилизованные семена могут храниться в стерильной воде при 4 ° С в течение 2 дней.
  2. ТакW стерилизованных семян на 0,5% геллановой камеди-затвердевает 1/2 среды Мурашига и Скуга пластины (рН 5,8) 9. Лента крышку на пластине с помощью двух слоев хирургической ленты.
  3. Инкубируйте планшет в темноте при 4 ° С с холодильной камере для хранения, O / N.
  4. Передача пластины в камере роста, установленной на 23,5 ° С с 12-часовой / 12-часовой цикле свет-темнота с использованием 100 мкмоль м-2 с-1 белые огни, и инкубируют в течение 7 дней. Саженцы с семядолей около 1 мм длиной, то могут быть собраны.

2. Небо падение Монтаж семядольных образцов

Примечание: важным фактором в подготовке образцов для наблюдения VAEM избегает включения пузырьков воздуха между образцом и покровным стеклом. Пузыри значительно снизить качество изображения VAEM вызывая различия показателя преломления. Простой метод, который мы назвали «Небо падение" монтажа, могут быть использованы, чтобы избежать пузыреймежду А. THALIANA семядоли и защитное стекло. Это должно быть сделано непосредственно перед наблюдения.

  1. Поместите 30 мкл буфера базальной [5 мМ 2- (N -morpholino) -ethanesulfonic кислоты-трис (MES-трис) при рН 6,5, 50 мМ КСl, 100 мкМ CaCl 2] в центре предметное стекло (размер: 76 × 26 мм, толщина: 1,0-1,2 мм).
  2. Снимите семядолей от 7-дневных рассады с использованием рассекает ножницы. Поплавок семядолей с наблюдения стороной вверх на базальной капли буфера (рис 1, шаг 1).
  3. Поместите 30 мкл буфера базальной по центру покровным стеклом (размер: 18 × 18 мм, толщина: 0.12-0.17 мм) (рис 1, этап 2). Поверните крышку стекла вниз мягко. Поверхностное натяжение предотвратит падение буфера от падения. Держите покровного стекла с помощью пинцета на одном краю. Поместите противоположный край на предметное стекло так, чтобы падение буфера составляет примерно выше семядоли.
  4. С краю покровного стекла еще на слайде, и все еще ​​держа противоположный край с помощью пинцета, отрегулируйте положение капли буфера под покровного стекла так, чтобы он непосредственно над семядолей образца (рис 1, шаг 3). Отпусти покровного стекла. Установите падение на образец, в результате препарата без пузырьков воздуха.
  5. Протрите избыточного буфер, используя безворсовые ткани. Сразу Соблюдайте подготовку (см шаг 3).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Там нет необходимости, чтобы запечатать образцов.

3. VAEM Наблюдательные Приобретение Кино

Примечание: Система TIRF микроскоп 9 используется в настоящем исследовании описывается следующим образом: инвертированный микроскоп оснащен блоком TIRF и TIRF объектив с числовой апертурой 1,49. Для компьютерного управления угла лазерного входа, используется блок управления. Зеленый флуоресцентный белок (GFP), возбуждается с 488 нм оптической накачкой полупроводниковым лазером, и тон флуоресценции детектируется посредством 510-550 нм полосового фильтра, чтобы предотвратить флуоресценции от хлоропластов. Измеренная максимальная величина выходного волокна власти 13.0-13.5 мВт. Для обнаружения, электрон умножения прибор с зарядовой связью (ПЗС-ЭМ) головка камеры системы и C-Mount блок изменения увеличения камеры используются.

  1. Калибровка лазерной центровки и фокусировки в соответствии с инструкциями изготовителя.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг является решающим для точными наблюдениями VAEM. Настоятельно рекомендуется, что периодические проверки процедур настройки лазера пути, соответствующие вашим микроскопом, осуществляются.
    1. Определите центральную позицию подсветкой с пути света линзы объектива без на потолке микроскопии комнате. Чтобы отметить центральное положение, положить цветную печать круг на потолке (рис 2, стадии 1, 2).
    2. Осветите потолок с объективом (рис 2, стадия 3, 4). Перемещение IСветовая область в центральное положение (рисунок 2, пункт 5). Фокус лазер (рисунок 2, шаг 6). Тонкая настройка позиции сфокусированного лазерного к центру (рис 2, шаг 7).
  2. Установите образец на столик микроскопа и выберите ячейки для наблюдения с использованием яркое освещение поля.
  3. Убедитесь, что флуоресцентный белок можно наблюдать в клетках, и установите Z ось позицию на поверхности клеток с использованием эпифлуоресцентной освещения (рис 3а).
  4. Выполните VAEM наблюдения.
    1. Наклоните угол входа лазерного луча постепенно с коробкой управления. В то же время, мониторинг в режиме реального изображения тщательно. Первоначально изображение будет смазанным (3В).
    2. По мере увеличения угла лазерных изображение VAEM станет менее размыты, в конечном итоге производить четкое изображение (рис 3C и D). В этот момент, остановить increaпеть угол лазерного. Если сигнал флуоресценции теряется, уменьшается до меньшим углом.
    3. Тонкая настройка угол лазерного запись, чтобы получить лучшее изображение. Тонкая настройка г -Axis положение может также улучшить изображение. При необходимости, отрегулируйте параметры (оптические мощности лазера, длина волны и наборов фильтров) и параметры датчика изображения [размер изображения, время экспозиции, усиления, дигитайзер и электронно-умножения (EM) GAIN].
      ПРИМЕЧАНИЕ: В случае с TIRF микроскоп оборудования описано выше, представитель параметры следующим образом. Увеличение объектива только в передней части камеры: 2X; Мощность лазера: 1,0 мВт; Размер изображения: 512 × 512 пикселей; Время экспозиции: 100 мс; Выигрыш: 5 ×; Дигитайзер: 11 МГц; Е. М. усиления: 100.
  5. Приобретать фильм как мульти-страницы файл изображения в TIFF, используя коммерческое программное обеспечение микроскопа. Здесь, фильм из GFP-меченых точек мигающих на поверхности клеток устьичные.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Типичные условия захвата изображений являются ВОЛСминимумы. Режим съемки: поток в ОЗУ; Количество кадров: 600; и размер многостраничный файл TIFF: ~ 302 Мб.

4. Анализ кимографе для количественного определения GFP-меченых Dot Residence времени, используя программное обеспечение Фиджи

  1. Установите Фиджи ('Фиджи Просто ImageJ "), программное обеспечение, следуя инструкциям 10 авторов (http://fiji.sc/Fiji).
  2. Запустите Фиджи и открыть полученную многостраничный файл TIFF с помощью меню Фиджи "Файл-Открыть".
  3. Поместите линию на участке интерес, используя инструмент Фиджи барное меню "Прямая линия Выбор инструмента". При желании, использовать "Сегментированный Line Tool Selection" или "Freehand Tool Line Selection". В результатах, представленных здесь, прямая линия 100 пикселей (что соответствует 8,0 мкм) помещали на дочерней клетки (фиг.4А).
  4. Сделать кимографе изображение, используя меню "Изображение Fiji-Стеки-динамический Reslice "(http://fiji.sc/Dynamic_Reslice) (4В). При желании, "Отразить по вертикали" и "Поворот на 90 градусов" в окне флажок, также доступны (не используется в результатах, представленных здесь). X- и Y-ось в кимографа изображения указывают на положение линии (100 пикселей, соответствующее 8.0 мкм) и время наблюдения (600 пикселей, соответствующее 60 сек), соответственно. Если кимограф изображения не является удовлетворительным, положение и тип (прямой, сегменты и от руки) линии на изображении мульти-страницы могут быть изменены. В изменения линии, кимограф изображения динамически меняется. Сохранить кимографе изображение в виде файла TIFF с помощью меню "Файл Фиджи-Сохранить как-Tiff".
  5. Измерение длины сгустка в ориентации оси времени.
    1. Для выполнения уменьшения шума, применить Gaussian фильтр к кимографе изображений с помощью меню Фиджи "Process-Фильтры-Gaussian Blur". К "Сигма (РадВМС) "параметр перестраиваемый (1 Радиус пикселя используется для представленных результатов).
    2. Сегмент сигнальные регионы по пороговой, используя меню "Изображение Fiji-Adjust-Порог".
      ПРИМЕЧАНИЕ: Есть несколько алгоритмов Thresholding, чтобы выбрать из. В представленных результатов, "Йен" алгоритм был выбран (рис 4C).
    3. Подготовьте для измерения времени (у) ось длину BLOB с помощью меню "Анализ-Set измерений". Проверьте "прямоугольник", ограничивающие в окне "Набор измерений». В идеале набор зона должна быть как можно меньше, чтобы исключить шум. Здесь минимальная площадь была установлена ​​на уровне 50 пикселей. Измерьте время (у) ось длину BLOB с помощью меню "Анализ-Анализ частиц". Для получения значения результат и доказать достоверность регионов измерения, проверить "Показывать результаты" и "Добавить в менеджера </ EM> "коробки.
    4. Значения в колонке «Рост» являются время (у) ось длины для измеряемой каплю (рис 4D). Сохраните значения с помощью меню Таблица результатов "Файл-Сохранить как" и рассчитать и обрабатывать набор данных BLOB изображения продолжительности с использованием статистического пакета и / или электронных таблиц (рис 4д).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом видео статьи, протоколы для VAEM наблюдения GFP-ПАТРУЛЬ 1 в А. THALIANA семядолей устьичных сложные клетки обеспечены. Небо падение монтаж простой способ получения, которые могут помочь уменьшить возникновение воздушных пузырьков в VAEM препаратов А. THALIANA семядоли (Рисунок 1). Слишком сильный лазера входа и / или г-позиционирования образцов для VAEM обеспечит нечетких снимков. Если это произойдет, то рекомендуется, чтобы начать снова с позиции непосредственно над образцом, с...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом видео статьи, протоколы приведены для мониторинга и измерения динамических характеристик GFP-ПАТРУЛЬ 1 точек на устьичного комплекса Arabidopsis THALIANA. Как показано здесь, VAEM наблюдения является мощным инструментом для живых изображений клеток растений поверхностей. В условиях эксперимента, используемых здесь для контроля GFP-ПАТРУЛЬ 1, было очень мало флуоресценции фотообесцвечивание в образце, используемом в течение 1 мин захвата видео, потому что очень чувствительны EM-ПЗС позволяет использовать ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Автор не имеет ничего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Я благодарен доктору Масару Фудзимото за его технические предложения по VAEM. Я также благодарен профессору Ко Иба и доктору Мими Хасимото-Сугимото за предоставление трансгенных растений GFP-PATROL1 и обсуждение PATROL1. Я благодарю профессора Сэйитиро Хаседзаву за его постоянную поддержку моей работы. Эта работа была поддержана грантом KAKENHI No 25711017 Японского общества содействия науке (JSPS).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Инвертированный микроскопOlympusIX-73
TIRF OlympusIX3-RFAEVAW
TIRF объективOlympusUAPON 100 × ОТИРФ NA = 1,49
Блок управления углом лазераChuo SeikiQT-AK
Полупроводниковый лазер с оптической накачкойCoherentSapphireTM LP USB 488-20 CDRH Laser
510– Полосовой фильтр 550 нмOlympusU-FBNA
EM CCD камераHamamatsu PhotonicsImagEM C9100-13
Блок изменения увеличения камеры с креплением C OlympusU-TVCAC
MetaMorph программное обеспечениеMolecular DevicesMetaMorph версия 7.7.11.0
TIRF микроскопияинструкция OlympusAX7385Инструкция: Система полного внутреннего отражения (Напечатано в Японии 24 августа 2012 г.)
Иммерсионное маслоOlympusImmersion Oil Typr-Fne = 1.518 (23 градуса)

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Konopka, C. A., Bednarek, S. Y. Comparison of the dynamics and functional redundancy of the Arabidopsis dynamin-related isoforms DRP1A and DRP1C during plant development. Plant Physiol. 147 (4), 1590-1602 (2008).
  2. Fujimoto, M., et al. Arabidopsis dynamin-related proteins DRP2B and DRP1A participate together in clathrin-coated vesicle formation during endocytosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107 (13), 6094-6099 (2010).
  3. Higaki, T., Sano, T., Hasezawa, S. Actin microfilament dynamics and actin side-binding proteins in plants. Curr. Opin. Plant Biol. 10 (6), 549-556 (2007).
  4. Rosero, A., Žársky, V., Cvrčková, F. AtFH1 formin mutation affects actin filament and microtubule dynamics in Arabidopsis thaliana. J. Exp. Bot. 64 (2), 585-597 (2013).
  5. Axelrod, D. Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology. Traffic. 2 (11), 764-774 (2001).
  6. Konopka, C. A., Bednarek, S. Y. Variable-angle epifluorescence microscopy: a new way to look at protein dynamics in the plant cell cortex. Plant J. 53 (1), 186-196 (2008).
  7. Wan, Y., Ash, W. M., Fan, L., Hao, H., Kim, M. K., Lin, J. Variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy of intact cells of Arabidopsis thaliana. Plant Methods. 7 (27), (2011).
  8. Hashimoto-Sugimoto, M., et al. A Munc13-like protein in Arabidopsis mediates H+-ATPase translocation that is essential for stomatal responses. Nat. Commun. 4, 2215(2013).
  9. Higaki, T., Hashimoto-Sugimoto, M., Akita, K., Iba, K., Hasezawa, S. Dynamics and environmental responses of PATROL1 in Arabidopsis subsidiary cells. Plant Cell Physiol. 55 (4), (2014).
  10. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  11. Chebli, Y., Kaneda, M., Zerzour, R., Geitmann, A. The cell wall of the Arabidopsis pollen tube-spatial distribution, recycling, and network formation of polysaccharides. Plant Physiol. 160 (4), 1940-1955 (2012).
  12. Fujimoto, M., Suda, Y., Vernhettes, S., Nakano, A., Ueda, T. Phosphatidylinositol 3-kinase and 4-kinase have distinct roles in intracellular trafficking of cellulose synthase complexes in Arabidopsis thaliana. Plant Cell Physiol. 56 (2), 287-298 (2015).
  13. Li, X., Wang, X., Yang, Y., Li, R., He, Q., Fang, X., Luu, D. T., Maurel, C., Lin, J. Single-molecule analysis of PIP2; 1 dynamics and partitioning reveals multiple modes of Arabidopsis plasma membrane aquaporin regulation. Plant Cell. 23 (10), 3780-3797 (2011).
  14. Li, R., Liu, P., Wan, Y., Chen, T., Wang, Q., Mettbach, U., Baluska, F., Samaj, J., Fang, X., Lucas, W. J., Lin, J. A membrane microdomain-associated protein, Arabidopsis Flot1, is involved in a clathrin-independent endocytic pathway and is required for seedling development. Plant Cell. 24 (5), 2105-2122 (2012).
  15. Staiger, C. J., Sheahan, M. B., Khurana, P., Wang, X., McCurdy, D. W., Blanchoin, L. Actin filament dynamics are dominated by rapid growth and severing activity in the Arabidopsis cortical array. J. Cell Biol. 184 (2), 269-280 (2009).
  16. Ueda, H., et al. Myosin-dependent endoplasmic reticulum motility and F-actin organization in plant cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107 (15), 6894-6899 (2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Variable Angle Epifluorescence MicroscopyPlant Cell Surface DynamicsFluorescent Protein TrackingReal time ImagingKymograph AnalysisResidence Time MeasurementGuard Cell ObservationSubsidiary Cell AnalysisPATROL1 Protein DynamicsArabidopsis thaliana

Related Articles