Эффективное млекопитающих выражение клеток и Пошаговый Очистка внеклеточной гликопротеинов для кристаллизации

Summary

Это быстрый, экономически эффективный протокол для производства секретируемых, гликозилированных белков млекопитающих и последующей одноступенчатой очистки с достаточным выходом однородного белка для рентгеновской кристаллографии и других биофизических исследований.

Abstract

Производство секретируемых белков млекопитающих для структурных и биофизических исследований может быть сложным, трудоемким и дорогостоящим. Здесь описан эффективный по времени и с минимальными затратами протокол экспрессии секретируемого белка в клетках млекопитающих и одноступенчатой очистки с использованием аффинной хроматографии никеля. Система основана на крупномасштабной транзиторной трансфекции клеток млекопитающих в суспензии, что значительно сокращает время производства белка, поскольку исключает такие этапы, как разработка экспрессирующих вирусов или генерация стабильных экспрессирующих клеточных линий. В этом протоколе используются дешевые трансфективные агенты, которые могут быть легко получены путем простой химической модификации, или недорогие трансфективные агенты, которые увеличивают выход за счет повышения эффективности трансфекции и снижения цитотоксичности. Тщательный контроль и поддержание уровня глюкозы в среде увеличивает выход белка. Контроль созревания нативных гликанов на стадии экспрессии увеличивает конечный выход правильно свернутых и функциональных белков млекопитающих, которые обладают идеальными свойствами для рентгеновской кристаллографии. В некоторых случаях одноступенчатая очистка позволяет получить белок достаточной чистоты для кристаллизации, что продемонстрировано здесь в качестве примера.

Introduction

Понимание структуры белка на атомном уровне является ключевым для выявления молекулярной основы биологических путей и заболеваний. Рентгеновский белок кристаллографии наиболее широко используемый / применимым методом для определения макромолекулярных структур. Основная задача этого метода является получение достаточного количества правильно уложенного, чистого белка. Это становится проблемой, особенно при работе с секретируемых белков млекопитающих, которые подвергаются конкретные пост-трансляционных модификаций.

Бактериально-выраженные белки являются основным источником белков, нанесенных кристаллизовались в базе данных белковых ^1. Бактериальные системы экспрессии в значительной степени предпочтительны, поскольку они быстро, недорого и, как правило, высокие урожаи белка. Тем не менее, внеклеточные домены белков млекопитающих, выраженные в бактерий часто не правильно уложенный, в котором требуется случай повторной укладки и обширные очистки шаги для получения гомогенного FOlded белок. Кроме того, многие белки млекопитающих требуют посттрансляционную гликозилирование достичь правильное сворачивание ^2. Хотя выражение и гликозилирование в дрожжевых клетках насекомых или может преодолеть проблему складывания, после трансляционные модификации, в том числе гликозилирования, существенно отличаются от тех, клеток млекопитающих ^3, уступая белки с неправильными или неоднородных модификаций.

Клетки млекопитающих выразить всю необходимую молекулярные механизмы для обеспечения надлежащего пост-трансляционных модификаций и складывание; Однако, эти системы экспрессии обычно не предпочитают большинство лабораторий, в связи с ограниченными выходами и высокой стоимости реагентов и расходных материалов. Полиэтиленимин (PEI), стандартный трансфекции реагент является относительно дешевым, но накладывает значительный цитотоксичность и низкую эффективность трансфекции, в результате увеличения расходов в клеточной ДНК, СМИ, и культивирование оборудования. Многие альтернативы PEI являются непомерно дорогими. Мы обращаемсяэти проблемы, описывающая комбинацию улучшенных средств для культивирования клеток и химически модифицированные PEI для быстрого и относительно недорогого способа выражения секретируемых белков млекопитающих с последующей одной стадии очистки. Это надежный метод дает достаточные урожаи для функциональных и биохимических исследований ^4, а в некоторых случаях, приводит белка поддаются кристаллизации без дополнительной очистки.

Этот протокол описывает несколько методов, чтобы максимизировать выражение и выход для секретируемых белков млекопитающих в человеческих эмбриональных почек (НЕК) 293F клеток, выращенных в суспензии. Эффективность трансфекции (и стоимость), производство белка и очистку всех значительно усиливается после этого протокола. PEI модифицирован добавлением карбаматов путем одностадийного реакции с раскрытием кольца (PEI-ТМС-25, синтез и свойства описаны подробно в работе ⁵⁾ значительно улучшает эффективность трансфекции, снижает цитотоксичность от катионныхМембрана нарушение и, соответственно, снижает затраты на эксперимент. Кроме того, жизнеспособность клеток и экспрессию белка значительно улучшены с добавлением культуры добавки для снабжения глюкозы и витаминов. Важно для производства гликозилированных белков, лечение с kifunensine, нетоксичный химический ингибитор маннозидаза I, производит белки с определенными, незрелых гликанов, которые могут быть удалены с помощью эндогликозидазой EndoHf с получением белков с одним N-ацетилглюкозамина в месте полнометражный N-связан Glycan ^6. Наконец, секреция белков в бессывороточной, химически определенной среде позволяет быстро, и облегчает очистку для структурных и биохимических исследований. Пошаговый никель-нитрилотриуксусная кислота (Ni-NTA) очистки смолы удаляет большинство видов загрязнения в надосадочной жидкости и в некоторых случаях, может привести белок достаточной чистоты для кристаллизации.

Protocol

1. Производство миллиграмм количества плазмидной ДНК для крупномасштабных переходных трансфекции

1. Клонирование интересующий белок в с высоким числом копий вектора экспрессии млекопитающих с использованием сайта рестрикции клонирования или другой подходящий метод.
   1. Для получения оптимальных результатов используйте pHLsec ⁷ вектор, который имеет встроенный С-концевой 6His-тега, сильный промотор последовательность Козака и оптимизированы сигнал секреции.
2. Преобразование плазмиды на компетентных клеток.
   1. Добавьте 20 мкл компетентных клетках E.coli на 1 мкг плазмидной ДНК и инкубируют на льду в течение 30 мин.
   2. Теплового шока клетки при 42 ° С в течение 35 сек, затем инкубируют на льду в течение 2 мин.
   3. Добавить 300 мкл ростовой среды микробной (SOC) и инкубируют при 37 ° С в течение 45 минут, встряхивая при 220 оборотах в минуту.
   4. Пластина клеток на агар с соответствующим выбором антибиотика.
      1. Использование 100 мкг / мл карбенициллина если плазмида в векторе pHLsec,
3. Культура колонии в 250 мл бульона Луриа (LB), дополненной 100 мкг / мл антибиотика (карбенициллин) O / N при 37 ° С, встряхивая при 220 оборотах в минуту.
4. Очищают ДНК из культуры с помощью Привет-Speed ​​плазмиды Maxi Kit в соответствии с протоколом производителя.
   1. Элюции ДНК в буфере ЕВ (10 мМ Трис-Cl, рН 8,5), а буфера ТЕ.
   2. Алиготе очищенной плазмиды в количестве, необходимом для трансфекции и хранить при температуре -20 ° С.

2. Масштабная Культура и переходных Трансфекцию 293F клеток

1. Дополнение 1 л 293F носители с 10 мл глютамина и 5 мл ручка / Strep (как 100х). Хранить при 4 ° С. 5 мл ручка / Strep является достаточной прочности в бессывороточной условиях, и снижение концентрации антибиотика повышает жизнеспособность клеток в течение трансфекции, который повышает урожайность белка.
2. Культура 293F клетки в 300 мл среды в 1 л поликарбоната с толку колб Эрленмейера вентилируемой крышкой сс при 37 ° С с _8% CO 2, при встряхивании в стандартном инкубаторе тканевых культур.
3. Развести клетки до 5 ^× 10 5 / мл плотности за один день до трансфекции.
4. В день трансфекции, дополнение культуральной среды путем добавления 10% объема 2% вес / объем Cell Boost в 293F СМИ.
   1. Измерьте концентрацию глюкозы с помощью монитора глюкозы в соответствии с инструкциями изготовителя и использовать добавки, как необходимо для достижения концентрацией глюкозы 500 мг / дл.
5. Добавить kifunensine (1 мкг / мл конечная концентрация) на этом этапе контролировать гликозилирования белков.
6. Рассчитать объем ДНК, необходимые для мкг плазмиды 1 на 1 ^× 10 6 клеток. В стерильных условиях, разбавленной ДНК в 5 мл бессывороточной среды.
7. Рассчитать объем реагента для трансфекции, необходимых для 1 мкг плазмиды на 2 мкл реагента для трансфекции. В стерильных условиях, разбавленные реагента для трансфекции (PEI-ТМС-25) в 5 мл бессывороточной среды.
8. Добавитьтрансфекции реагента в раствор ДНК с шагом в 1 мл, смешивая мягко. Инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре реагент-ДНК комплексов с образованием. Затем добавьте раствор на клетках в каплям моды.
9. Разрешить трансфицированные клетки, чтобы выразить белка для 72-96 часов. Дополнение с ~ 10% объема Cell Boost СМИ ежедневно или по мере необходимости, чтобы держать глюкозы чтения 400-600 мг / дл.

3. Очистка

1. Декантировать культуру в центрифужную колбу, центрифуги в течение 20 мин при 1300 х г для осаждения клеток и затем собирают супернатант. При необходимости вращаться во второй раз, и / или использовать фильтр 0,22 мкм уточнить супернатант.
2. Добавить 10% объема 10x Ni-NTA связывания буфер (1,5 М NaCl, 0,5 МК ₂ HPO _4, 0,1 М Трис рН 8,5, 50 мМ имидазола).
3. Подготовка колонки тяжести добавлением 2 мл Ni-NTA суспензии в колонне и уравновешивания с 10 объемами колонки (CV) 1х буфере для связывания. Если это возможно, сделать все шаги столбцов в 4 ° C в помещении. АльтернативныеЭли, холод белка и все буферы на льду перед шагом колонны, и держать белок и собрал проточный на льду.
   Примечание: Ni-NTA суспензию 50% смолы по объему и указано связывающая способность производства составляет 50 мг / мл. Бусины Ni-NTA может быть повторно загружают для многократного использования
4. Поток супернатант через смолу и собирать проточные. Повторите этот шаг.
5. Промыть 10 CV промывочного буфера (300 мМ NaCl, 50 мМ К ₂ НРО _4, 20 мМ имидазола рН 8).
6. Элюируют белок в 5 CV буфера для элюции из (мМ NaCl 300, 50 мМ К ₂ НРО _4, 250 мМ имидазола рН 8).
7. Если дегликозилирование требуется:
   1. Для конечного объема 0,5 мл, концентрат элюат с 0,43 мл с помощью центрифугирования концентратор. Если образования осадка, гранул любой мусор центрифугированием при 16000 х г и 4 ° С.
   2. Добавить 50 мкл 500 мМ Na-цитрат, рН 5,5.
   3. Добавьте 20 мкл EndoHf (1 х 10 ⁶ ед / мл). Инкубируют при комнатной температуре в течение 2 часов.
      НеE: Фермент работает оптимальным образом при 37 ° С, что может привести к концентрированного белкового агрегировать. Продлить инкубацию RT, если дегликозилирование, оценивается SDS-PAGE или иммуноблоттинга является неполным. Фермент не обладают активностью при 4 ° С.
   4. Чтобы удалить EndoHf: Промыть 3 раза амилозы смолы в фосфатно-солевом буфере (PBS) или конечного буфера хранения. Инкубируйте белок с смолы в течение 1 ч при 4 ° С. Спин 5 мин при 1000 мкг в гранулах бусы, чтобы и собирать супернатант.
   5. Концентрат белка с использованием соответствующего молекулярного веса центрифугирования фильтр среза и буфер обмена в буфер хранения (150 мм NaCl и 20 мМ HEPES, рН 7,5).

Results

В этом следует результатов этого выражения системы, прилагаемой к домену, секретируемый иммуноглобулин 13 кДа (Ig) от человеческого белка рецептора запуска выраженной миелоидных клеток (2 hTREM2 остатки 19-132). TREM2 тип I трансмембранный белок, содержащий внеклеточный домен одного Ig, который имеет две дисульфидные связи и два N-связанных сайта гликозилирования. В отличие от многих других белков ⁸ доменных Ig, TREM2 не поддаются повторной укладки от бактериальных тел включения ^9. После мутагенеза...

Discussion

НЕК 293F клетки предлагают надежную продукцию белков, требующих пост-трансляционные модификации. Эта система позволяет быстро и масштабируемую выражение изначально свернутых белков, содержащих дисульфидов гликозилирования и фосфорилирования, что в противном случае будет отсутствовать с помощью рутинных больше инструментов экспрессии. Кроме того, эта система может быть использована для экспрессии и очистки нескольких белковых комплексов, просто ко-трансфекции нескольких плазмид. Кроме того, TREM2, эта система широко испо...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Колбы для культур	GeneMate	F-5909B
293 Freestyle Media	Gibco/Life Technologies	12338-018
GlutaMAX	Gibco/Life Technologies	35050-061	Использование вместо глютамина
Hype 5 реагент для трансфекции	Oz Biosciences	HY01500
293фектин реагент для трансфекции	Life Technologies
Реагент для трансфекции PEI	Sigma-Aldrich	408727
Maxiprep Kit	Qiagen	12162
Ni-NTA Superflow	Qiagen	30430
Endo Hf	NEB	P0703L
Амилоза смола	NEB	E8021S
Cell Boost R05.2	HyClone	SH30584.02	Добавка для клеточных культур
GlucCell	CESCO Bioengineering	DG2032	Система мониторинга глюкозы
Opti-MEM	Life Technologies	519850.91	Сыворотка Свободная среда для трансфекции ДНК
Бульон Лурия (LB Media)	Life Technologies	10855-001
GC10 Компетентные клетки	Sigma-Aldrich	G2919