Долгосрочное Катетеризация Кишечные лимфы Магистральные и коллекции лимфы в неонатальных Свиней

Лимфатическая система является изученной областью физиологии. Доклинические модели лимфатической катетеризацией встречаются у разных видов животных ^1-8 и используются фармацевтической промышленности и научно - исследовательских институтов для изучения механизмов , участвующих в липида и ^8-12 метаболизма лекарственных средств, ^13-15 метастазирования рака ¹⁶ с экспериментального лечения ¹⁷ и иммунной функции ^{18 -26.} Это исследование исследует использование кишечного лимфатического ствола катетеризацию в отечественной модели свиньи для измерения компонентов метаболизма липопротеинов. Метаболизм липопротеинов участвует в производстве и секреции хиломикронов, а также изменения в связанных липидов и общего белка. Это важные соображения, как существуют значительные различия в липидного обмена между наиболее часто используемых моделях грызунов и человека, и как таковые, с использованием модели свиньи для сбора кишечных лимфы может обеспечить более сопоставимую информацию для изучения липидного меняtabolism у людей ^27-31.

Несколько хирургических методов используются для сбора кишечника лимфу в крупных видов животных: черепную плечо подход (т.е. грудной проток катетеризацию) ^5, боковая верхняя бочка подход ^32-34 и вентральной средней линии или парамедианный подход ^22,35. Это видео подробно описывает хирургическую процедуру в свиней с использованием вентральной средней линии хирургического подхода к катетеризацией кишечного лимфатического ствола. Осторожная хирургическая техника допускает этот метод лимфатической катетеризацией для сбора большого количества лимфы и его составные части в течение длительного периода времени.

Этот метод открывает множество приложений для многих дисциплин, исследующих различные физиологические функции. Приложения могут включать в себя, но не ограничиваются ими, весь липопротеина тела и липидного обмена, иммунологического, генезис и метастазирования опухолей, функции кишечника, и Разработлор и прогрессирование воспалительного заболевания кишечника.

Все процедуры на экспериментальных животных, описанных в обоих видео и рукописи были утверждены по уходу и использованию комитета Institutional животных путем и следовал руководящим принципам, установленным Канадским советом по уходу за животными.

1. хирургической анестезии и хирургических Подготовка новорожденных поросят

1. В отделенной прихожую, Premedicate 25 кг свиней у основания шеи с внутримышечной коктейлем седативно-анестезирующий препарат, содержащий: azaperone (0,3 мг / кг), гидрохлорид кетамина (10 мг / кг), Дексмедетомидин (15 мкг / кг).
   Примечание: Добавить бупренорфин (0,005-0,02 мг / кг) в предварительно анестетика коктейль наркотиков для улучшенного интраоперационного контроля боли.
2. Обезболить свиней с вдыхаемым изофлуран ингаляции газа (4-5% изофлуран в 500 мл-1000 мл / мин O ₂₎ , используя маску. Визуализируйте голосовые связки с помощью ветеринарного ларингеальный сферы (длинная 17-25 см ПРЯМОЛОПАСТНОЙ), а также применять местное 10% лидокаина Spay вокалушнуры. Дайте лидокаин спрей связаться голосовые связки 30-60 сек до интубации, чтобы уменьшить возможность вокального спазма шнура и обструкции дыхательных путей.
3. Интубировать свиней путем пропускания манжетой эндотрахеальной трубки (5,0-7,0 мм Внутренний диаметр (ID)) между голосовыми связками и поддержания анестезии с изофлуран газа (0,5-2,0% изофлуран в 1000-2000 мл / мин O ₂₎ с использованием закрытой схема передыханию обезболивающий системы по всей операции. Оценить уровень анестезии щековыми тон, и обе педали и антимонголоидный разрез глаз рефлекторных реакций. Истекло анестезирующий газ продувается и выводятся за пределы хирургического набора.
4. Очистите внешнюю поверхность уха с 2,0% раствором хлоргексидина хирургический скраб с последующим 70% изопропилового спирта полощут. С внутривенный катетер 20 G, катетеризировать в вену уха, чтобы обеспечить внутривенное введение жидкости (раствор Рингера с лактатом; 5-10 мл / кг / ч) во время операции. Закрепить пульсоксиметр на поверхности слизистой оболочки языка с медскую ленту для контроля частоты сердечных сокращений и насыщенность периферической крови кислородом (SPO _2).
5. Поместите наркозом кота в дорсальной лежачем положении и бритье вентральной части живота от середины грудной клетки каудально к вентральной лобка. Очистите эту область с двумя чередующимися 2,0% хлоргексидина хирургических скрабы и стерильные промывок водой.
6. Передача обезболены свинью хирургического набора и применить окончательный хирургический скраб 70% полоскании изопропилового спирта, дайте ему высохнуть, а затем задрапировать животное.
7. Вставьте ректального датчика температуры примерно 2-4 см в прямую кишку, чтобы контролировать температуру тела. Поместите свиней на грелку воды рециркуляционным для поддержания нормальной температуры тела (38-40 ° C) во время хирургической процедуры.
8. Драпируйте свинья с четырьмя полотенцами драпировками, помещенных в вышележащих шаблон квадранта вокруг живота. Поместите первый драпировка через мечевидного отростка, второй драпировка вдоль латеральной части живота примерно 5 грм сбоку от брюшной средней линии. Поместите третий драпировка через подвздошную гребня таза и четвертой драпировка, как и второй драпировки (хотя на противоположной стороне), расположена вдоль латеральной поверхности живота примерно 5 см латеральнее брюшной средней линии.
9. Поместите большой стол драпировка, с щелевой отверстия, дающего возможность доступа к операционному полю, над нижележащих полотенце драпировки и покрывают свинью и весь операционный стол. Окончательный драпировка представляет собой одноразовый стерильными-драпировки помещается над большим столом драпировкой.

2. Абдоминальная хирургия и катетеризация кишечника лимфатической Магистральные

1. Сделайте разрез кожи на 20 см с скальпелем, чтобы выставить основные мышцы живота. Надрезать брюшной мышечные слои с однополярного электрокоагуляции (20 Вт) настройки, чтобы выставить париетальной брюшины. Открыть 20 см линейный сегмент париетальной брюшины с Metzenbaum ножницами, чтобы получить доступ к брюшной полости и лимфатический сосуд.
2. Смочить все ткани с теплым (37 ° С) стерильного солевого раствора в течение всей хирургической процедуры. Аккуратно поднимите большой сегмент кишечника, включая рак толстой кишки, слепой кишки, подвздошной и тощей из брюшной полости и экстериоризоваться его на левый фланг свиньи, чтобы получить доступ к верхней части живота, печени и лимфатический сосуд. Закрепите выводили кишечник в положении с дополнительными полотенцесушители шторами, чтобы сформировать стропу, чтобы мягко поддерживать кишечник.
3. Найдите лимфатический сосуд, он лежит около 4 см черепно-медиальной правой почечной вены, 6 см каудально-medial- вентральной из кавальных бригадиров и под висцеральной аспектом правой доли печени вблизи поджелудочной железы ^22,36,37. Определить лимфатический сосуд в виде полупрозрачной структуры , примыкающего к правой вентральной сегмент воротной вены ^36,37.
4. Отделить лимфатическую VESSэль от окружающих фасции, осторожно дразня прочь прилагаемую ткань с Q-Tip аппликаторов. После того, как боковые стороны судна отделены от окружающих тканей, создают "Туннель" отверстие под сосуд с тонкой тупым наконечником пинцет.
5. Проходят три 2-0 шелковыми швами под лимфатический сосуд с тонким пинцетом. Перевязывать наиболее хвостового швом сначала закупорить, и заполнить расширяют сосуд с лимфой. Целенаправленно оставить концы этой нити относительно длинной (4 см), чтобы закрепить катетер в лимфатический сосуд. Поместите две другие шовные материалы разделены 1,0 см друг от друга и составляют примерно 1,0-1,5 см черепных обеспеченному хвостового швом. Оставьте эти два швами с «одной свободной лигатуры галстука", чтобы позволить для более быстрого закрепления катетера в сосуд.
   Примечание: Сегмент лимфатический сосуд, расположенный между наиболее хвостового лигирования швом и средним швом (из двух черепных швов) является местом для катетеризацией. Что касается суратура материал, 2-0 полиглактином шовный материал может заменить 2-0 шелковыми швами, если требуется.
6. Вырезать небольшое отверстие в сосуд с ирисами ножницами и расширяют сосуд с мелкими тупыми щипцами. Вставьте приблизительно 1,0-1,5 см специализированной трубки катетера (4,06 Внешний диаметр (OD) X 2,31 мм ID) со скошенным концом в сосуд и связать два черепных швов, чтобы закрепить катетер на месте. Используйте длинные шовные концы хвостового швом, чтобы закрепить катетер в сосуд.
7. Промыть выводили кишечник с большим количеством теплого солевого раствора и осторожно вернуть его в брюшной полости, обеспечивая правильное анатомическое расположение кишечника.
8. Экстериоризироваться катетер на левой середине фланг (5-10 см вентрально от paralumbar ямки). Делают разрез кожи скальпелем и проходить троакара из брюшной полости к поверхности кожи, чтобы создать отверстие для экстериоризацию катетера. Используйте большой пинцет Келли экстериоризоваться катетер из брюшной CAVности через отверстие троакара.
9. Закройте париетальной брюшины с простым непрерывным швом узор 2-0 полиглактином швом с круглым (коническим) иглы. Закройте брюшной мышечные слои с помощью простого прерванного паттерна шовного с 2-0 полиглактином швом на круглом иглы.
10. Закройте кожу в субкутикулярных модели с 2-0 полиглактином швом на разделочной иглы. Закрепите экстериоризированного катетер к коже с рисунком шовного кошелек-струнной и 2-0 нейлоновой нити на разделочной иглы.
11. Поместите специальную куртку на свинье, все еще под наркозом, чтобы облегчить его размещение и уменьшить стресс свиньи во время восстановления.

3. Послеоперационное восстановление и лимфы Коллекция

1. Примерно за 10 минут до прекращения ингаляционной анестезии, управлять bupenorphine (0,1 мг / кг) внутримышечно, чтобы обеспечить немедленное после операции обезболивание. Продолжить bupenorphine (0,1 мг / кг) каждые 12 ч в течение 24-48 ч для поддержанияпослеоперационное обезболивание.
2. Монитор свиней для послеоперационных осложнений каждые 8-12 ч в течение периода 7 дней.
3. Собирают лимфу в 500 мл полипропилен вымытые бутылки, покрытые этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), и дополненной антибиотиками; пенициллин (6000 МЕ), стрептомицин (6 мг) и амфотерицином В (3 мг) каждые 12 ч в течение периода 7 дней.

4. Количественное липопротеина ApoB48, триглицерида, холестерина и общего белка Собранные из Лимфы

1. Центрифуга лимфы образца при 1,800 мкг в течение 5 мин при температуре 4 ° С. Собирают супернатант и использовать его для определения количества триглицеридов, холестерина и общего белка.
2. Разделить супернатант на три образца: неразведенном образце, образец разводили 1:20 дистиллированной водой и окончательного образца, разбавленного 1: 100 с дистиллированной водой.
3. Используйте неразбавленный супернатант для измерения уровня холестерина, с помощью коммерчески доступного набора.
4. Используйте в 1:20 и 1:100 разведенные образцы для измерения триглицеридов и уровни общего белка с коммерчески доступного набора и кислотостойкой общего белка анализа бицинхониновой соответственно.

5. Количественное липопротеина ApoB48, собранный из Лимфы ³⁸

1. Определить концентрацию липопротеинов ApoB48 с адаптированной иммунной Вестерн - блоттинга методом ^38. Отдельная общая лимфы с 3-8% трис-acetate- додецилсульфат натрия сульфат электрофорез в полиакриламидном геле (SDS-PAGE).
2. Передача Разделенные белки в поливинилиденфторидом мембраной (0,45 мкм) и инкубировать их с козьим поликлональных антител апоВ (1: 4000), а затем связать его с анти-козьими вторичными антителами.
3. Количественная липопротеинов ApoB48 с хемилюминесценции с использованием линейного денситометрическую сравнения с очищенными грызунами стандарта ApoB48 белка.

Лимфатической катетеризацию кишечника лимфатической ствола неонатальных свиней позволяет собирать около 1 л / 24 ч центральной лимфы в течение 7 дней. Лимфы, собранные в этом эксперименте содержали компоненты липидного обмена, а именно общего белка лимфы, ApoB48 липопротеинов, триглицеридов, общего белка и холестерина. Таблица 1 Основные представительные количества этих липидных компонентов из консервированной лимфатических образцов трех свиней. Следует отметить, что лимфоток и липидные компоненты находятся на одной линии с значениями центральной лимфы сообщили другими исследователями после катетеризацией кишечных лимфатических сосудов (лимфоток 570 ± 158 до 979 ± 284 мл / 24 ч 25, 360 ± 120 MLL / 24 ч до 1080 ± 720 мл / 24 ч 26; триглицерид 687 ± 110 мг / дл 9; холестерин 63,1 ± 5,6 мг / дл 9); с указанием правильной установки катетера в лимфатический сосуд.

Рисунок 1. Представитель Вестерн - блот - анализ демонстрирует вклад ApoB48 и ApoB100 липопротеинов в неонатальный передельного кишечника лимфы. Лимфатические собраны из трехсвиней отделено с использованием протокола с градиентом плотности ультрацентрифугирования в 1,006 г / мл. На рисунке показано небольшое количество загрязнений с приблизительно 15% плазмы , полученной ApoB100. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Таблица 1. Компоненты кишечника лимфы , собранные от новорожденных поросят 7 дней после хирургии. Результаты повторных MEASures лимфо- и выражается в виде среднего SD (n = 3)

Авторам нечего раскрывать.