Измерение и анализ внеклеточной кислоты производства, чтобы определить гликолитических Оценить

Краткое содержание

Гликолиз является определяющим метаболическим маркером во многих биологических системах. Мониторинг гликолиза путем измерения внеклеточного потока H⁺ является распространенным явлением, но требует количественной и однозначной коррекции. В этой статье мы продемонстрируем, как собирать и корректировать данные о внеклеточном потоке, чтобы различать респираторные и гликолитические источники внеклеточного закисления.

Аннотация

Внеклеточное измерение потребления кислорода и производства кислоты - это простой и эффективный способ мониторинга скорости дыхания и гликолиза¹. Как митохондриальные (дыхание), так и немитохондриальные (другие окислительно-восстановительные реакции) потребляют кислород, но эти реакции можно легко отличить по химическому торможению митохондриального дыхания. Однако, в то время как потребление кислорода митохондриями является однозначным и прямым измерением частоты дыхания², то же самое не верно для производства внеклеточной кислоты и ее связи с гликолитической скоростью ^3-6. Внеклеточная кислота, вырабатываемая клетками, получается как из лактата, образующегося в результате анаэробного гликолиза, так и из CO₂, образующегося в цикле лимонной кислоты при дыхании. Для гликолиза источником гликолитического подкисления является превращение глюкозы в лактат^-+ Н⁺ и экспорт продуктов в пробирную среду. Что касается дыхания, то источником закисления дыхательных путей является экспорт_СО2, гидратация в_{Н2 СО3}и диссоциация в НСО3^-+Н⁺. Пропорции гликолитического и респираторного подкисления зависят от условий эксперимента, включая тип клеток и предоставленный субстрат(ы), и могут варьироваться от почти 100% гликолитического подкисления до почти 100% респираторного подкисления6. Здесь мы демонстрируем методы сбора и расчета данных, необходимые для определения респираторного и гликолитического вклада в общее внеклеточное подкисление целых клеток в культуре с использованием клеток Myoblast C2C12 в качестве модели.

Введение

Общая цель этого метода является точно измерить скорость гликолиза клеток с использованием анализа внеклеточной потока. Количественное измерение скорости гликолиза, используя внеклеточный подкисления является искомым конечная точка многих экспериментах. Тем не менее, общая скорость внеклеточного подкисления является суммой двух составляющих: дыхательная подкисление, в виде СО ₂ (который увлажняет Н _{2 СО 3, то} распадается на НСО ₃ ^- + Н ^+), и гликолитического подкисления, в виде лактата ^- + ^Н +.

Вклады _CO 2 в общей внеклеточной подкисления до недавнего было считать незначительным в измерительной платформы, используемой здесь, в XF24 анализатора ^7. Тем не менее, очевидно, в нескольких других систем, которые CO ₂ может быть одной из основных причин внеклеточной подкисления ^4-5. Несколько статей признать этот конвклад, но не пытайтесь прямой количественный СО ₂ -derived кислоты ^3,8,9. Недавно мы показали, что количественно СО ₂ производство является значительным источником внеклеточной подкисления в этой системе ^6. Кроме того, хотя существует множество метаболических путей, которые генерируют _СО 2 из катаболизма глюкозы, тем осуществляется матричных дегидрогеназ в цикле лимонной кислоты подавляющие Авторы и все другие источники генерации количество _CO 2, которые в пределах экспериментальной ошибки ^6.

Без коррекции _СО 2 производства внеклеточного подкисления, следовательно, является неоднозначным показателем гликолитического скорости и не могут быть использованы в количественном отношении. Нашей предыдущей публикации подчеркивается несколько случаев, когда дыхательная СО _{2 содержит} основную часть общего сигнала подкисления, даже в клетках, как правило, как полагают, в основном, используют гликолиз ^6. Кроме того,дыхательная СО ₂ вклад в общую подкисления широко варьируется в ходе общих метаболических экспериментах профилирования, демонстрируя, что правильно сравнение гликолитического скоростью в разные части эксперимента требует коррекции для _CO 2.

Для измерения скорости гликолиза клеток с использованием скорости внеклеточной подкисления, необходимо преобразовать изменение рН на изменения в общем ^H +, генерируемых и вычесть внеклеточный подкисление вызванное _CO 2 выделяется при работе в цикле лимонной кислоты. Здесь мы опишем простой метод для измерения внеклеточной дебит протонов (с внеклеточной изменения рН и калиброванного буферизации власти анализа среды) и _СО 2 производства (от внеклеточного изменений в _O 2 концентрации), и продемонстрировать, как рассчитать гликолитический скорость На основе этих измерений.

Эта сила метод ENS утилиту внеклеточного подкисления измерения, используя его правильно рассчитать скорость гликолиза, как определено лактата. Без коррекции дыхательных CO _{2 (или} прямого измерения лактата), невозможно определить, если и в какой степени общий уровень кислотности отражает гликолитический скорость, не оправдав интерпретацию экспериментов, использующих общую внеклеточный подкисления в качестве прямого измерения лактата.

РАСЧЕТ

_СО 2 и лактата, в пределах экспериментальной ошибки, только два вклад в производство внеклеточной кислоты, основанные на экспериментах с клетками миобластов ^6. Таким образом, скорость общего внеклеточного подкисления (PPR, дебита протон) может быть определена как:

PPR PPR _малыш = _{соответственно} + PPR _Glyc Уравнение 1

. _content ">, где малыш = общее; соответственно = дыхания; Glyc = гликолитическая гликолитических PPR такова:

PPR PPR _Glyc = _малыш - PPR _{соответственно} Уравнение 2

Вот,

PPR _малыш = РВЦА _малыш / ВР Уравнение 3

где РВЦА = внеклеточного скорости подкисление (миль / ч / мин), и ВР = буферизации питания (миль / ч / пмоль ^Н + в 7 мкл), а

ППР = _{соответственно} (10 ^{рН-PK ₁} / (1 ​​+ 10 ^{рН-PK ₁₎₎} (макс ^Н + / _О 2) (OCR _TOT - OCR _{об / MYX)} Уравнение 4

где К ₁ = комбинированный константа равновесия _СО 2 гидратации и диссоциации в _НСО 3 ^- + Н ^+; макс ^Н + / _O 2 = йе СО ₂ -derived подкисление для конкретного метаболической трансформации, таких как полное окисление глюкозы ^6; OCR = скорость потребления кислорода _(O 2 пмоль / мин), и OCR _{об / MYX} = без митохондриальной OCR.

Уравнение 4 изолирует митохондриальной OCR путем вычитания любого не-митохондриальной OCR (определяется как OCR, которая устойчива к митохондриальной дыхательной ядов ротенона и myxothiazol) и счетов для максимального H ^+, образованное на _O 2 потребляется для каждого субстрата (макс ^Н + / O ₂ ) (см ^6), а также доля _CO 2 порождая ^H + на экспериментальной температуры и рН (10 ^{рН-PK ₁} / (1 ​​+ 10 ^{рН-PK _1).} Для полного окисления глюкозы, митохондриальная кислорода Потребление Оценить (OCR) в точности равна скорости _CO 2, производства. В ограниченном объеме анализа измерения внеклеточной потока, _CO 2, продуктыд дыханием остается в ловушке в среду для анализа. Большая часть захваченных _СО 2 увлажненной, чтобы H _{2 CO 3,} который затем распадается на _НСО 3 ^- + Н ^+. Небольшая часть остается растворенным, но не гидратированного, а другой небольшая часть является гидратированный, но не диссоциируют, как продиктовано термодинамически комбинированным константа равновесия _СО 2 гидратации и диссоциации, чтобы HCO ₃ ^- + Н ^{+ при} температуре эксперимента (37 ° C) и рН (~ 7,4).

Таким образом, полное уравнение для расчета PPR _г путем вычитания PPR PPR _соотв от _TOT является:

PPR _Glyc = РВЦА _малыш / ВР - (10 ^{рН-PK ₁} / (1 ​​+ 10 ^{рН-PK ₁₎₎} (макс ^Н + / _O 2) (OCR _малыш - OCR _{об / MYX)} Уравнение 5

яп Таким образом, темпы дыхания и гликолиза, а также связанных с ними темпы производства АТФ, может быть количественно определена из простых измерений (потребления кислорода, внеклеточный подкисления, буферная емкость) и импорта или расчета других необходимых значений ^(Н + / вывода ₂ , п / о, а константа равновесия _K 1) ^6. Эксперимент, описанный здесь расширяется на стандартных методов для использования внеклеточной поток анализатор, таких как конек XF24 ^10,11; для других форматов измерений внеклеточного поток (например, XF ^е 96, или XFP), все объемы ниже должны быть расширены соответствующим образом.

Буферный мощность в среду для анализа может быть измерена путем построения калибровочной кривой либо непосредственно во внеклеточном платформы потока или отдельно с помощью калиброванного рН зонда. Здесь три варианта для измерения буферизации внеклеточным потока среды для анализа даны, в том числе с использованием всех injectiна портах внеклеточного анализатора потока с скважин образцов клеточных бесплатно, либо с использованием только последней инъекции порт в ячейке, содержащей скважин (раздел 1), или с помощью внешнего измерения рН (раздел 2). См.прикрепленную таблицу для полных расчетов, например, данные.

Для измерения буферизации питание с помощью рН-обнаружения возможности внеклеточного инструмента потока, это самый безопасный в использовании бесклеточных скважин, чтобы минимизировать изменение сигнала. Тем не менее, в пределах погрешности, статистической разницы не существует между бесклеточной и клеточно-содержащий скважин при выполнении этого измерения (данные не показаны). Примечание: Изменение описано на стадии 1.7 осуществляет преимущество составляет любых потенциальных изменений в буферизации, предоставляемых добавленных соединений или в присутствии клеток, с недостатком шумной сигнала. Однако, как указано выше, никаких существенных различий не было обнаружено в расчетной мощности между буферным конструкции бесклеточной показанном в таблице 1, идизайн после эксперимента в таблице 2 в экспериментальных условиях, описанных здесь.

Кроме того, на малых диапазонах ΔpH (<0,4 единиц; экспериментально лучше ограниченные до 0,2 единиц), то линейный наклон получается путем построения Д миль / ч / мкмоль H ⁺ адекватно приблизительно логарифмическая зависимость между ΔpH и ^[H +]. Наклон стандартной кривой, следовательно, представляет собой буферную силу в среду для анализа тестируемого рН / нмоль ^H + в 7 мкл или миль / ч / пмоль ^Н + 7 мкл. Мы рекомендуем увеличение средней мощности буферизации или уменьшением плотности клеток в образцах, которые превышают единичное изменение рН 0,2 в течение времени измерения. Время измерения также может быть уменьшена, но это может привести к сокращению установившейся скорости подкисления и ввести ошибку в расчете скорости.

Протокол

1. Измерение Буферизация Сила в внеклеточной Flux инструмент: два варианта

Примечание: расчеты и способы, описанные здесь, были разработаны с использованием внеклеточного Flux Analyzer. Для других инструментов, объем измерения должны быть расширены соответствующим образом.

1. Подготовка 0,1 М HCl в стандартной воде с использованием концентрата HCl (см Материалы и оборудование) в соответствии с инструкциями производителя.
   Примечание: Пример расчета для приготовления инъекций HCl для использования во всех четырех инжекционных отверстий показано в таблице 1:

Таблица 1. Последовательные инъекции HCl в внеклеточного анализа потока также.

2. Подготовьте разведения стандарта HCl в среде должны быть анализировали как описано в таблице 1 для ряда технических повторов, являющихся CarrIED в одной тарелке, плюс один, чтобы позволить ошибки пипетирования; например, для четырех технических повторов порта впрыска, подготовить запас (1,1 мкл х 5) 0,1 М HCl в (48,9 мкл х 5) анализа среды.
3. Распределить 50 мкл в каждую Порт А картриджа измерения зонда. Повторите эту процедуру для оставшихся портов B, C и D.
4. Запуск внеклеточный анализа потока ¹⁰ со стандартным циклом калибровки, после чего два цикла [2 мин смесь в течение 1 минуты ждать, и 5 измерения мин] для каждого из четырех портов дополнений (рисунок 2).
   1. Программирование эксперимент выше программного обеспечения прибора в соответствии с инструкциями программного обеспечения. Загрузите подготовленную картридж в аппарат и выполнить калибровку в соответствии с инструкциями программного обеспечения.
   2. При появлении в программе, удалите калибрующего содержащие пластину и вставьте пластину, содержащую анализа среды в каждую лунку в прибор; продолжить программу.
5. U петь среднем 8-10 точек, полученных в стационарном состоянии (как правило, в последние 8-10 баллов) до и после каждого порта Кроме того, рассчитать совокупный () разница в рН (ΔpH), вызванного каждой инъекции стандартного кислоты.
6. Участок ΔpH против нмоль Н ^+, содержащиеся в объеме 7 мкл захваченных измерительного зонда. Линейный наклон буферного питания (БП) в миль / ч / пмоль ^Н +.
7. В качестве альтернативы к шагам 1,2-1,3, провести измерения ΔpH следующие анализе, в котором порты A, B, и С, используемого для проведения эксперимента с последующим инъекции HCl в Порт D. Как в таблице 2, четыре параллельных образца технические используется для генерации каждую точку стандартной кривой 5-балльной в 20 экспериментальных скважин (за исключением четырех фон коррекции температуры скважин) внеклеточного потока анализа пластины.

53464table2.jpg "/>
Таблица 2. Одноместный HCl инъекции в внеклеточного анализа потока скважины.

2. Измерение Буферизация питания Использование внешнего измерителя рН

Примечание: Для измерения буферизации мощность среде, используя внешнюю рН зонд, калибровку зонда при 37 ° С и поддерживают эту температуру в течение всех реагентов в ходе эксперимента.

1. Подготовка 0,1 М HCl стандартный в воде с использованием концентрата HCl в соответствии с инструкциями производителя.
2. Теплый рН зонд, стандарты рН, анализ среды, буферизация мощность должна быть измерена, и 0,1 М HCl до 37 ° С на водяной бане.
3. Калибровка рН электрод при 37 ° С в соответствии с инструкциями производителя. Поддержание все реагенты при 37 ° С в течение всего теста с помощью тепла пластину или водяной бане.
4. Аликвоты 10 мл среды для анализа в небольшой стакан или коническую трубку. Монитор рН постоянно используя погруженную рН зонда.
5. Добавить 0,1 М HCl в качествеговорят среду в 10-20 мкл аликвоты.
   1. Убедитесь, смешивая с помощью мешалкой или вручную вращая контейнер после каждого добавления кислоты.
   2. Подождите несколько секунд для измерения рН для стабилизации, а затем записать рН после каждого добавления.
   3. Как показано в таблице 3, чтобы достаточное количество дополнений, чтобы обеспечить точный расчет наклона и охватывают диапазон рН ожидаемое в ходе эксперимента.

Таблица 3. Измерение энергии с использованием буферизации рН-метр. Данные представляют собой типичного эксперимента с шестью 20 мкл добавлением 0,1 М HCl.

6. Участок ΔpH против нмоль H ^{+ добавлены} в 7 мкл, давая линейный наклон, который представляет власть буферизации (рисунок 1).

Рисунок 1. Определение буферизации власть. Стандартная кривая HCl измеряли в таблице 1, Таблица 2 или (здесь), а в таблице 3. Наклон линейной аппроксимации кривой дает силу буферизации (рН / нмоль H ⁺ в 7 мкл). Каждая точка представляет среднее ± SEM п = 9 технические повторов.

7. После того, как мощность буферизации известно через метод 1 или 2, преобразовать РВЦА сигнал (миль / ч / мин), чтобы PPR (пмоль ^Н + / мин / мкг белка) путем деления Ecar буферизацией мощности (ВР) (миль / ч / пмоль ^Н +) и масштабирование, чтобы содержание белка в каждой лунке:
   PPR _малыш (пмоль ^Н + / мин / мкг белка) = РВЦА (миль / ч / мин) / BP (миль / ч / пмоль ^Н + в 7 мкл) / белка на лунку (мкг) Уравнение 6
8. В качестве альтернативы, используйте те же самые эксперименты в методес 1 или 2 для расчета стоимости буферную емкость (BC), используемый программным обеспечением прибора для автоматического расчета РНП во время сбора данных.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Руководство пользователя инструмент ¹² (стр 107) содержит подробную информацию о расчете и использовании буферную емкость, где до н.э. описывается как
   БК (моль / л) = моль ^H + / (ΔpH объем буфера х (L)) Уравнение 7
   ПРИМЕЧАНИЕ: буферная емкость, как определено в уравнении 7, может быть рассчитана в инструмент или внешний рН зонда анализов, описанных выше. Преобразование между буферным власти и буферной емкости легко сделать (прилагается таблица):
   BC = 1 х 10 ^-9 / BP ((миль / ч / пмоль ^Н + в 7 мкл) / 7 мкл) Уравнение 8
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если известны до проведения анализа, буферная емкость может быть введен непосредственно в программное обеспечение прибора во время эксперимента.
9. Применение этой процедуры и расчеты, используемые выше большинства обычных буферных систем, как описано в предыдущей публикации ^6.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В таблице 4 перечислены электрические буферизации и буферная емкость из нескольких традиционных средств массовой информации.

Таблица 4. Буферизация мощности и буферная емкость отдельных средств массовой информации.

3. Выполнение внеклеточного Flux анализе с использованием клеток миобластов C2C12

Примечание: На шаге 3.4.3, не было никаких различий в наблюдаемых _CO 2 не -derived производство кислоты зависит от наличия карбоангидразы в С2С12 культуры, предполагая, что его присутствие не требуется для полного превращения _CO 2 в _НСО 3 ^- + Н ^+. Тем не менее, для эмпирической проверки этого в разных экспериментальных системах рекомендуется перед омitting карбоангидразы.

1. Культура мыши C2C12 миобластов ¹³ при 37 ° С в атмосфере 95% воздуха / 5% CO ₂ в модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM) с 11,1 мМ глюкозы, 2 мМ глутамина, 10% об / об эмбриональной бычьей сыворотки (FBS), 100 Ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина.
2. 24 ч до анализа, пластина / семян клетки в 100 мкл той же культуральной среде при 20000 клеток / лунку в 24-луночный полистирольный внеклеточного поток Аналитический планшет (см Материалы и методы) без дополнительной покрытием.
3. Развести олигомицин, FCCP и ротенон плюс myxothiazol и HCl (опция) до 10x конечной концентрации в Кребса Рингера фосфат HEPES (KRPH) анализа среды (2 мМ HEPES, 136 мМ NaCl, 2 мМ _NaH 2 PO _4, 3,7 мМ KCl, 1 мМ MgCl _2, 1,5 мМ CaCl _2, 0,1% вес / объем жирных кислот, свободных бычий сывороточный альбумин, рН 7,4 при 37 ° С).
4. Подготовка сотовый
   1. 30 мин перед анализом, мыть адгезивных клеток три раза путем аспирации с Gently удалить среды от скважины, а затем медленно добавляя 500 мкл KRPH.
   2. Инкубируйте клетки после третьего шага стирки при 37 ° С в атмосфере воздуха (не менее 5% CO _2, который будет изменить рН этой бикарбоната среде без).
   3. При запуске анализа, заменить KRPH в скважинах с 500 мкл свежей KRPH содержащей 500 U / мл карбоангидразы и либо глюкозу (10 мм) или только среду, без дополнительной подложке.
5. Загрузка картриджа датчика
   1. Пипеткой 50 мкл аликвоты каждого 10x соединения, полученного на стадии 3.3 в патронных портов внеклеточного потока картриджа датчика следующим образом (конечные концентрации в тесте также приведены): порт A: 2 мкг / мл олигомицину, Порт B: 0,5 мкм FCCP, Порт C : 1 мкМ ротенон, 1 мкМ myxothiazol, порт D: HCl (если калибровке в-анализа кислоты, как описано выше, и в таблице 2).
      ПРИМЕЧАНИЕ: для назначения полной торможения дыхательной цепи, описанные здесь, 1 мкМ Моиxothiazol могут быть использованы взаимозаменяемо с 1 мкМ антимицином А.
6. Внеклеточной анализ потока:
   1. Выполните стандартную внеклеточный анализа потока для определения дыхательного контроля, как описано в ^10.

Примечание: Для каждого сегмента эксперимента, определить смесь, подождать, и время измерения необходимо, а также количество циклов в сегменте.

ПРИМЕЧАНИЕ: Данные в таблице 5 были собраны в течение двух циклов анализа по 2 мин смеси, 1 мин ожидания, и 5 мин меры для каждого сегмента, с трех циклов анализа происходящих после Порт D добавлением различных количеств HCl (для калибровки буферизации Мощность, как в таблице 2).

Таблица 5. внеклеточной поток конфигурации анализа.

4. Measuriнг конечная точка концентрации лактата

Примечание: Для проверки косвенного анализа, описанного здесь, в какой-то другой системе, точка концентрации лактата конец к концу внеклеточного эксперимента потока могут быть определены непосредственно в обычном 96-луночного планшета путем измерения начальной скорости (в течение 2 мин) снижения ^НАД + НАДН → катализируемой лактатдегидрогеназы, подробно описанной в предшествующих публикации ^6. Для данных, представленных в Представитель Результаты, концентрация лактата конечная точка в содержащей глюкозу аналитические лунки был ~ 40 мкм.

1. Подготовьте 2x гидразина среды: 1 М Трис, 20 мМ ЭДТА, 400 мМ гидразин, рН 9,8 при 22 ° С). Непосредственно перед началом анализа, добавить ^NAD + до 4 мм и лактатдегидрогеназы (ЛДГ) до 40 Ед / мл. Окончательный анализ состава среды (1x): 500 мМ Трис, 10 мМ ЭДТА, 200 мМ гидразина, 2 мМ ^НАД +, 20 ед / мл ЛДГ.
2. Сразу же после внеклеточный анализа потока, удалить 100мкл среды для анализа из каждой лунки внеклеточного потока анализа пластины и передачи в лунку непрозрачной (черный) 96-луночного планшета.
3. Для каждого образца, добавьте 100 мкл 2x гидразина среду.
4. Сразу загрузить пластину в микропланшетного и начать мониторинг флуоресценции NADH при возбуждении 340 нм / 460 нм излучения.
5. Запишите начальную скорость примерно на 2 мин.
6. Запустите подобный эксперимент, чтобы построить стандартную кривую начальную скорость от концентрации лактата для добавленных концентрации лактата от 0 до 50 мкм.
7. Рассчитать концентрацию лактата в каждой экспериментальной скважины с использованием стандартной кривой.

5. Измерение содержания белка

1. Удалить остатки среды для анализа из каждой лунки аналитического планшета.
2. Вымойте лунки три раза 250 мкл BSA-Free KRPH, будьте осторожны, чтобы свести к минимуму оплывание клеток из нижней поверхности скважины.
3. Добавить 25 мкл лизис Рипасреда (150 мМ NaCl, 50 мМ Трис, 1 мМ EGTA, 1 мМ ЭДТА, 1% об / об Тритон Х-100, 0,5% вес / об дезоксихолат натрия, 0,1% об / об SDS, рН 7,4 при 22 ° С) В каждую лунку планшета для анализа.
4. Инкубируйте пластины на льду в течение 30 мин.
5. Перемешивают пластину на шейкере при 1200 оборотах в минуту в течение 5 мин.
6. Измерение концентрации белка стандартными методами, например, путем анализа BCA, гарантируя, что состав буфера для лизиса совместимы с методом измерения. Содержание белка в эксперименте на рисунке 2 составляла ~ 4 мкг / лунку.

Результаты

Рисунок 2 показывает исходные данные для типичного эксперимента. Последние 10 точек измерения от записи точка-точка, так и OCR (рН затененной вертикальные полосы) были использованы для расчетов. Первоначальные опасения, что среднее значение (измерение средняя точка) каждого цикла анализа не обеспечивают достаточную разрешение скорости для точного расчета, в частности, так как, казалось, было небольшое отставание между портом того и постоянной скоростью государственной подкисления, не оправдались, как это не появляется в значительной степени способствовать ошибки в расчетах (не показан). Кроме того, если правильно буферная емкость вводится во время экспериментальной установки, PPR можно прочитать непосредственно из инструмента сбора данных считывания, отображая выход PPR в программном обеспечении прибора или в формате PC-совместимый доступной в качестве одного из параметров выходных данных.

ftp_upload / 53464 / 53464fig2.jpg "/>
Рисунок 2. Типичные внеклеточные потока следы O _{2 и} H ^+. OCR и рН следы на примере эксперимента в таблице 5, содержащем 10 мМ глюкозы в начале анализа. Порт D имеют различные концентрации HCl для калибровки мощности буферизации (не показан на этих усредненных следов). Данные предыдущей публикации ^6. Каждая точка представляет среднее ± SEM из N = 8 биологических повторяет. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Анализ данных представительств результатов

Использование таблицы, показанной в таблице 6, который в качестве вложения, значения данных из отдельных скважин может быть введен в колонках с желтыми заголовками. Все шесть колонок в право вычисляются на основе этих записей. Пример в таблице 6 показаны расчеты PPR PPR _{соответственно} и _Glyc использованием Ecar и данные OCR из отдельных скважин для нативных условиях с добавлением или без добавления сахара, до порта A добавлением олигомицина. Технические повторов на каждую биопрепарата обычно в среднем, чтобы дать отдельные значения выходов в последних четырех столбцах, то данные из различных биологических препаратов в среднем с соответствующим распространения статистических данных об ошибках в ВР, и эти четыре значения.

Таблица 6. Расчет дыхательной и гликолитического подкисления. Колонны главе желтым указывают значения вводится из расчета (например, ВР, макс ^Н + / _О 2), или от сбора данных (например, РВЦА _малыш, OCR). PS: //www.jove.com/files/ftp_upload/53464/53464table6.jpg "целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой таблице |. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот стол в качестве таблицы Excel ,

Вклады гликолиза и дыхания в PPR после коррекции

Рисунок 3 показывает графический вывод данных, рассчитанных в таблице 6 в родных для ставок гликолиза и дыхания подкисления, ставки следующие олигомицин того (Порт A), и ставки следующие FCCP того (Порт B). Эти данные ясно показывают, как пропорции дыхательной и гликолитического изменения подкисления с выбором подложки (глюкозы по сравнению с контролем (CTL) ни с нами) и митохондриальной статуса (родной функции против фармакологически измененной функции).

">
Рисунок 3. Протон дебит (PPR) из гликолитических и дыхательной источников. PPR от дыхания (открытые участки) и гликолиза (заполненные участки) из С2С12 клеток, рассчитанных с использованием уравнения 5 с добавлением глюкозы (три левых бар) или без добавления сахара (три правых бар). Данные ^6. Все данные представляют собой среднее ± SEM из N = 8 биологических повторяет.

Обсуждение

Внеклеточной подкисления является легко измерить указание сотовой метаболизма. Чтобы правильно определить скорость гликолиза сотовой (как определено лактата) важно знать буферизации силу в среду для анализа, и для преобразования внеклеточного измерений параметров потоков потребления кислорода и подкисления протона темпы производства. При выполнении этого расчета, подкисление в результате _CO 2 выпущен в цикле лимонной кислоты могут быть вычтены, оставляя подкисление, которая является результатом лактата.

Несколько различных способов приведенные здесь, чтобы измерить силу буферизации для этой коррекции нести различные преимущества и недостатки. Внешний измерений с использованием рН электрод обладает высокой точным и воспроизводимым, но может не соответствовать небольшие различия в обнаружении рН введенной флуорофоров, содержащихся в планшет для анализа, добавлением соединений в процессе анализа, или в присутствии третон сами клетки. В-пластины измерения рН решать эти вопросы, но и ввести в разной степени экспериментального шума.

_CO 2 поправка к РВЦА позволяет впервые однозначными и количественного расчета скорости гликолиза, и показывает изменение в дыхательной и гликолитического вклад в общую РВЦА в ходе эксперимента. Использование уравнения 5 и измерения OCR, РВЦА и буферизации власть, гликолитическая ставка может быть рассчитана с помощью простого таблицу представленную (таблица 6). При желании ⁶ Эта скорость может быть проверена путем измерения лактата после специальной. В клетках, где пентозофосфатный путь обладает высокой активностью, применение ингибиторов пути, такие как 6-aminonicotinamide может быть полезно, чтобы изолировать гликолитических скорость. Расчет взносов как CO ₂ ^- и лактата, полученных ^Н + из общего измеряется внеклеточной подкислением Оценить и кислород Consumptионная Оценить является бесценным инструментом для использования внеклеточные данные потока сделать мощные и количественные заявления о метаболической активности.

Используя методики, описанные здесь, включая различные модификации для измерения буферизации мощности и оптимизации внеклеточный эксперимент потока для клеток исследуемых и данных желании скорость гликолиза в интактных клетках может быть определена количественно в широком диапазоне условий эксперимента. Этот метод ограничен клетками, которые могут расти в прикрепленной культуре на (или клетки или органеллы, которые могут быть придерживались) полистирольный поверхность. Это самый надежный при культивируемые клетки однородны и сливной, хотя полезные данные могут еще быть получены в диапазоне этих условиях. Расчеты требуют некоторые знания о метаболизме клеток, как максимум H ⁺ O ₂ / колеблется от 0,65 до 1,0 для полного окисления различных субстратов и больше для частичного окисления ^6, однако, если клетки кNown окислять глюкозу, значение 1.0 можно предположить.

Хотя отношение к метаболическим всех характеристик, этот способ может быть особенно полезным при использовании в системах, в которых сдвиг между дыхательной и гликолитического метаболизма, чтобы поддерживать питания сотовой АТФ является критическим фенотип, в том числе характеристики стволовых клеток и опухолевых полученных раковых клеток. Понимание метаболических нарушений контроля в этих и других контекстах позволит в большей степени сложности и точности в экспериментальной разработки и анализа этих типов клеток.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Pherastar FS	BMG	н/а	считыватель микропланшетов
Seahorse XF-24	Seahorse Bioscience	н/а	прибор внеклеточного потока
Seahorse XF оценочная пластина Seahorse Bioscience		V7-PS	расходный материал
XF калибрант	Seahorse Bioscience	100840-000	раствор
HCl стандарт	Sigma	38280	химический
олигомицин	Sigma	O4876	химический
FCCP	Sigma	C2920	химический
ротенон	Sigma	R8875	химический
миксотиазол	Sigma	T5580	химический
DMEM	Corning	10-013-CV	средний компонент
FBS	Corning	35-010-CV	средний компонент
пенициллин/стрептомицин	Corning	30-002-CI	среднекомпонентная
карбоангидраза	Sigma	C2624	химическая
96-луночная пластина для анализа	Corning	CLS3991	расходный
NAD+	Sigma	N7004	химический
LDH	Sigma	L1254	химический