Отслеживание и Количественная процессов развития в С. Элеганс Использование инструментов с открытым кодом

Summary

Здесь показано, как отслеживать и количественно оценивать процессы развития у C. elegans. Представленные методы основаны на инструментах с открытым исходным кодом, которые могут быть легко реализованы. Показано, как реконструировать 3D-модели формы клеток, как вручную отслеживать субклеточные структуры и как анализировать сократительный поток в коре головного мозга.

Abstract

Количественно захвата процессы развития имеет решающее значение для получения механистической модели и ключ для идентификации и описания мутантных фенотипов. Здесь представлены протоколы для подготовки эмбрионов и взрослых С Элеганс животных для кратко- и долгосрочного покадровой микроскопии и методы для отслеживания и количественной оценки процессов развития. Методы, представленные основаны на С. штаммы Элеганс, доступные в Caenorhabditis генетический центр и на программное обеспечение с открытым исходным кодом, которые могут быть легко реализованы в любой лаборатории независимо от системы, используемой микроскопии. Реконструкция модели сотового формы 3D с помощью моделирования программного обеспечения УПМ, руководство отслеживания флуоресцентно-меченых субклеточных структур с помощью программы анализа изображений многоцелевой Endrov и анализ корковой потока сократительной используя PIVlab (времяразрешенная Измерение скорости частиц изображения цифровой Инструмент для MATLAB) показаны. Это обсуждается, как эти способы могут быть развернуты тО количественном захватить другие процессы развития в различных моделях, например, отслеживания клеток и рода трассировки, отслеживание пузырьков потока.

Introduction

С стабильное улучшение флуоресцентных белков, генной инженерии, световой микроскопии и компьютерного программного и аппаратного обеспечения, теперь можно записать развитие многих организмов модели с беспрецедентной пространственно-временным разрешением. Это позволяет исследователям задавать вопросы, которые не могут быть рассмотрены ранее или вновь известные процессы развития в целях поиска недооцененных аспектов. Этот прогресс вызвал поле количественного биологии развития, которая направлена ​​на преобразование качественные, неформальные модели в количественных моделей по капитальному измерений и статистического анализа.

Отслеживание кле....

Protocol

1. Приготовление С Элеганс эмбрионов для Интерв микроскопии с использованием микрошариков

1. Перевести беременных взрослых червей с помощью червя выбор (из платиновой проволоки) в каплю M9 буфера и отчистить бактерии сначала энергично агитировать, а затем передать каждый червь соседней капли M9 с помощью глаз плеть установленный на зубной Pick / пипетки или использовать острый стеклянный капилляр.
2. Развести дисперсии, содержащей 20 мкм диаметром полистирольные шарики в 10 раз M9 буфера (1 л M9 буфер содержит 3 г _КН 2 РО _4, 6 г _Na 2 HPO 4, 5 г NaCl, и, после автоклавирования (20 мин, 120 ° С), добав....

Results

При использовании протоколов 2, 3 и 4, покадровой визуализации половых желез в дикого типа C. Элеганс взрослых осуществляется (штамм OD58 (UNC-119 (ed3) III; ltIs38 [pAA1; пирог-1 :: GFP :: РН (PLC1delta1) + UNC-119 (+)]), выражая мембранный маркер из зародышевой линии промоутер ). Сосредоточение внимания на рубеже гонады, 3D модель зародышевых клеток формируется из данных микроскопии (рис 2). Эта модель позволяет анализировать изменения в размер ячейки в то время как транзит клетки формируют д.......

Discussion

Через объекта слежения в развитии, в частности ядерной слежения, стало возможным выяснить центральные механизмы формирования паттерна С. Элеганс эмбриогенеза ^1,23,24. Расширение этой стратегии в более высокой пропускной способности, это было недавно можно раскрыть дополнительные правила паттерна и предложить метод, как вывести паттерна правила заново ^10. Для многих мутантов, однако, точные дефекты паттерна до сих пор неизвестны. Методы, описанные здесь, являются инструментами, кот.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Стереомикроскоп	Motic/VWR	OT4005S	Стереомикроскоп для диссекции и монтажа
полибисерных микросфер из полистирола,	Полинаука	18329	Сборка эмбриона
20 & микро; m
Полистирольные микросферы,	Polysciences	876	Крепление для взрослых животных
0,1 & микро; m
Предметные стекла для микроскопа	VWR	631-0902	Крепление для взрослого животного
Покровное стекло 18x18 мм	VWR	631-1331	Крепление для эмбриона/взрослого
человека Покровное стекло 24x60 мм	VWR	631-1339	Крепление для эмбриона
Скальпель	VWR	233-5455	Вскрытие эмбриона
Силиконовая трубка	VWR	228-1501	Трубка для рта пипетка
30 мм ПТФЭ мембранный фильтр	NeoLab	Jul-01	Фильтр для ротовой пипетки
Капиллярные трубки	VWR	621-0003	Наконечник для рта пипетка
Vaseline	Roth	E746.1	Крепление для эмбриона/взрослого
Agar	Roth	5210.5	Крепление для взрослого животного
Калий-дигидрогенфосфат	Roth	P018.2	M9 буфер
Ди-натрий-гидрогенфосфат	Roth	P030.2	M9 буфер
Sodium chloride	Roth	3957.1	M9 буфер
VisiScope Вращающийся диск Конфокальная система	Visitron Systems	н/д	Конфокальная микроскопия