Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Ортотопическая задних конечностей трансплантации у мышей

12K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/53483

⸱

12 февраля 2016 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Vascularized Composite Allotransplantation (VCA) Laboratory, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Visceral, Transplant and Thoracic Surgery, Innsbruck Medical University, 3Center for Vascularized Composite Allotransplantation, Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Chang Gung Memorial Hospital and School of Medicine, 4Department of General, Visceral and Transplant Surgery, Charite Berlin

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Этот роман модель для ортотопическая задней трансплантации конечностей у мышей, применяя без шовный технику манжеты для супер-микрососудов анастомоза, представляет собой мощный инструмент для механистической иммунологические исследования в естественных условиях, связанных с васкуляризированных композитного аллотрансплантации (СВУ).

Аннотация

In vivo животные модельные системы, и в частности мышиные модели, превратились в мощные и универсальные научные инструменты, необходимые для фундаментальных и трансляционных исследований в области трансплантационной медицины. Широкий спектр реагентов доступен исключительно в этих условиях, включая моно- и поликлональные антитела как для диагностических, так и для интервенционных применений. Кроме того, огромное количество генотипированных, инбредных, трансгенных и нокаутирующих штаммов позволяет детально изучить индивидуальный вклад гуморальных и клеточных компонентов в сложное взаимодействие иммунного ответа и делает мышей золотым стандартом иммунологических исследований.

Васкуляризированная композитная аллотрансплантация (VCA) очерчивает новую область трансплантации с использованием аллотрансплантатов для замены «подобное на подобное» у пациентов с травматической или врожденной потерей тканей. В данном хирургическом методическом протоколе показано использование бесшовной манжеты для супермикрососудистого анастомоза в модели трансплантации задних конечностей ортотопической мыши. В частности, модель позволяет сравнивать установленные парадигмы трансплантации солидных органов с новой формой трансплантации, состоящей из различных компонентов тканей. Уникальность этой модели заключается в том, что она позволяет проводить трансплантацию жизнеспособного васкуляризированного компартмента костного мозга и ниши, которые могут оказывать благотворное влияние на баланс иммунного принятия и отторжения. Этот метод предоставляет инструмент для изучения распознавания аллоантигенов и отторжения и принятия аллотрансплантата, а также позволяет проводить исследования функциональной регенерации нервов для дальнейшего продвижения этой новой области трансплантации.

Введение

Конец девяностых ознаменовался первыми днями реконструктивной трансплантации с первой успешной пересадкой руки, проведенной во Франции в 1998 году. С тех пор использование СВК для реконструкции разрушительных дефектов тканей успешно применяется у широкого круга пациентов. На сегодняшний день в мире насчитывается 76 реципиентов 112 верхних конечностей, а также 31 лицо 1-3. Кроме того, было проведено несколько других типов СВК, таких как брюшная стенка 4, гортань 5, трахея 6, васкуляризированные суставы 7 и даже пенис 8. Кроме того, недавно сообщалось о живорождении ребенка после трансплантации матки 9. Этот растущий мировой опыт свидетельствует о том, что реконструктивная трансплантация стала действенным терапевтическим вариантом для пациентов, страдающих значительными функциональными дефектами тканей, которые не поддаются традиционной реконструктивной и восстановительной хирургии и лечению.

Хотя идея замены "подобное на подобное" вызвала клинический энтузиазм, первоначальный скептицизм все еще преобладает в отношении побочных эффектов обычной иммуносупрессии в высоких дозах, необходимых для поддержания аллотрансплантатов и их функции 10,11. Однако, как показано в плодотворной работе Lee et al., эти композитные трансплантаты менее склонны к отторжению, чем его отдельные компоненты, и, кроме того, некоторые компоненты ткани, такие как васкуляризированный костный компартмент, внушают оптимизм, поскольку они могут оказывать уникальное иммунологическое воздействие на баланс иммунного принятия и отторжения.

Наша группа впервые разработала несколько микрохирургических моделей животных для трансплантации солидных органов, а также васкуляризированную композитную аллотрансплантацию 13-19. В данной статье мы опишем новую хирургическую процедуру с использованием бесшовной манжеты для выполнения супермикрососудистого анастомоза в модели трансплантации задних конечностей ортотопической мыши. Эта модель трансплантации представляет собой полезный инструмент для исследования механизмов иммунного принятия и отторжения, а также роли отдельных компонентов ткани, таких как васкуляризированный отдел костного мозга, в индукции толерантности в иммунологически универсальных условиях у видов мышей. Кроме того, ортотопическое размещение конечности открывает возможности для регенерации нервов и исследований функциональных исходов, которые критически важны для условий СВК.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все эксперименты проводились в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных Национального института здоровья (NIH) и были одобрены Университета Уход за животными и использованию комитета Джона Хопкинса (JHUACUC) по. Конкретные процедуры были выполнены в соответствии с утвержденным MO13M108 протокола ACUC.

1. Донор Операция

  1. Администрирование обезболивание в соответствующий момент времени для каждого фармакологического препарата до операции. В соответствии с использованием протокола утверждена по уходу за животными и использование 0,1 мг / кг массы тела бупренорфина подкожно 1 ч до кожного разреза.
  2. Седативный донор с ИФ подается через камеру, прикрепленную к ИФ испаритель на 4%; поддерживать седации и анестезии в 2% через носовой обтекатель. Выполните ног снятие пинч отражение контролировать глубину анестезии до начала процедуры.
  3. Носите маски, одноразовые халаты изоляции и перчатки.
  4. Бритье хирургического ареа, в частности задней конечности и пах, и преп с 10% повидон - йода.
  5. Используйте стерильной зоне драпировку, автоклавного инструментов и большом увеличении микроскопа (40X).
  6. Сделать паха разрез кожи с помощью ножниц проксимальнее области середины бедра и по окружности соединить разрез разграничить задних конечностей от остальной части корпуса мыши.
  7. Определить и анализировать бедренную артерию, вену и нервы. Отделить все три структуры с помощью щипцов и микро-ножницы.
  8. После того, как сосудистая ножка рассекают разделить сосуды на уровне паховой связки с использованием микро ножницы.
  9. Далее, по-прежнему, чтобы разделить отдельные брюшные (грацильного и медиальной мышцы бедра) и группы спинные мышцы 20 в проксимальном направлении на уровне середины бедра, чтобы отделить трансплантат от животного-донора с помощью ножниц.
  10. Трансекте бедренную кость и разрезать на середине бедренной кости с помощью ножниц.
  11. Эвтаназии животное изофлурановым передозировки ВОЛСмычали смещением шейных позвонков. Подтверждение прекращения сердцебиения и дыхания.
  12. Флеш конечность с 2 мл гепарином (30 IE) холодной (4 ° С) засоленных помощью 33 г промывки иглу, установленную на шприце (см Материалы таблицу).
  13. Поместите один полиимидной манжету на бедренную вену и артерию, соответственно.
  14. Оберните трансплантата в мокрой хлопковой марли, место в чашке Петри и хранить при температуре 4 ° С до вставке.

2. Получатель Операция

  1. Удаление задней конечности
    1. Администрирование обезболивание в соответствующий момент времени для каждого фармакологического препарата до операции. В соответствии с использованием протокола утверждена по уходу за животными и использование 0,1 мг / кг веса тела бупренорфина SC 1 ч до кожного разреза.
    2. Седативный донор с ИФ подается через камеру, прикрепленную к ИФ испаритель на 4%; поддерживать седации и анестезии в 2% через носовой обтекатель. Выполните ног снятие пинч отражение контролировать отделомч анестезии до начала процедуры.
    3. Используйте ветеринарную мазь на глазах мыши, чтобы предотвратить сухость под наркозом.
    4. Бритье хирургическую область, в частности задней конечности и пах и преп с 10% повидон - йод.
    5. Сделать паха разрез кожи с помощью ножниц проксимальнее области середины бедра и по окружности соединить разрез разграничить задних конечностей от остальной части корпуса мыши.
    6. Определить и анализировать бедренную артерию, вену и нервы и отделить все три структуры с помощью щипцов и микро-ножницы.
    7. После того, как сосудистая ножка расчленена, зажать бедренных сосудов на уровне паховой связки.
    8. Нарезать сосуды дистальный на уровне поверхностного эпигастральной артерии.
    9. Затем продолжают делиться отдельные брюшные (Gracilis и медиальной мышцы бедра) и спинной группы мышц 20 проксимально на уровне середины бедра, чтобы отделить родной заднюю Liмб у животных-реципиентов с помощью ножниц.
    10. Трансекте бедренную в середине бедренной кости с помощью ножниц.
    11. Cauterize ранее перерезают мышцы бедра, чтобы предотвратить кровотечение сайта рассечение и, таким образом получатель кровопотерю.
  2. имплантация
    1. Минимизация потери жидкости путем полива операционное поле с теплой физиологического раствора (37 ° С) и 0,3 мл инъекционного теплый физиологический раствор до и после операции.
    2. Поместите трансплантат таким образом, что отражает точную анатомическую позицию родной задней конечности путем совмещения бедренной кости реципиента и трансплантата и соединить их с помощью спинальную иглу 20 G в качестве интрамедуллярной стержня.
    3. Coapt брюшной и спинной группы мышц с использованием рассасывающийся шовный материал (6-0 Полисорб).
    4. Подключите бедренных сосудов, используя технику манжеты без шовный; в деталях, тянуть стороне получателя судна над манжеты ранее установленный на судне концы Grafт. Используйте 10-0 нейлона шов и выполнить круговую связь, чтобы зафиксировать судно получатель на манжете.
    5. Следующая освободить зажимы. На этом этапе визуально проверить вращение манжеты и оптимальное позиционирование, чтобы предотвратить неправильное вращение и перекручивание сосудов.
    6. Выполните гемостаз с помощью электро прижигания с особым акцентом на интерфейсе доноров получателя мышцы и концы костей.
    7. Закройте кожу с помощью нерассасывающегося нейлоновые швы (6-0 Ethilon).
    8. Создание нормотермических условия, позволяя животным восстановить в клетке под нагревательным лампы. Продолжить регулярный мониторинг по крайней мере 4 часа до возвращения его в жилищном объекте.
    9. Послеоперационного обезболивания с бупренорфином в дозе 0,1 мг / кг SC каждые 6-8 ч в течение 3 дней.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Выполнение васкуляризированных композитный Аллотрансплантация в мышиной модели с использованием метода без шва манжеты позволяет добиться отличного и долго выживание Термин трансплантата и животных, как показано на рисунке 1. Кроме того, он представляет собой надежный способ получения воспроизводимых результатов постепенного отторжения трансплантата в васкуляризированной композита аллотрансплантация как задокументировано изображений, показанных на рисунке 2.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Васкуляризированных Композитный Аллотрансплантация, таких как верхней конечности и трансплантации лица для реконструкции дефектов разрушительных тканей, развилась в качестве действительного варианта лечения для пациентов, не исправимо с обычными реконструктивных операций. Технический прогресс в области реконструктивной микрохирургии, а также обширный опыт с мощным иммуносупрессивных и иммунных модуляторными терапии в твердом трансплантации органов, в настоящее время позволяет долгосрочное выживание трансплантата в этом ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана армии, флота, NIH, ВВС, VA и вопросам здравоохранения, чтобы поддержать усилия AFIRM II, под решение № W81XWH-13-2-0053. Армии США медицинских исследований Приобретение активность, 820 Чандлер Street, Форт Detrick MD 21702-5014 является присуждение и администрирование офиса приобретение. Мнения, интерпретации, выводы и рекомендации принадлежат автору и не обязательно одобрены Министерством обороны.

Авторы хотели бы поблагодарить Джессика IZZI, DVM, Caroline Гаррета, вольтметр и Джули Уотсон, вольтметр за отличную ветеринарной поддержки в ходе этого исследования.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Шовный материал, 6-0 НейлонMWI31849
Шовный материал, 6-0 ПолисорбMWI72667
Шовный материал, 10-0 НейлонAero SurgicalTK-107038
Полиимидная трубка, размер 25Vention Medical141-0023
Полиимидная трубка, размер 27Vention Medical141-0015
Микрососудистые зажимы (одиночные)Synovis00396
Микрососудистые зажимы (двойные)Synovis00414
МикроножницыSynovisSAS-18
МикрощипцыSynovisFRS-15 RM-8
МикрорасширителиSynovisFRS-15 RM-8D.1
МикроиглометрSynovisC-14
Микрозажим АппликаторSynovisCAF-4
Микропромывочная иглаHamilton10MM, 30°, 33G
Lactated Ringers SolutionFisher ScientificNC9968051
бупренорфинDEA Требуется номер; Приобретается в гостеприимной аптеке.
Энрофлоксацин; BaytrilBayer Health Care186599
гепаринПолучен в больничной аптеке

Ссылки

  1. Khalifian, S., et al. Facial transplantation: the first 9 years. Lancet. , (2014).
  2. Petruzzo, P., Dubernard, J. M. The International Registry on Hand and Composite Tissue allotransplantation. Clin. Transpl. , 247-253 (2011).
  3. Shores, J. T., Brandacher, G., Lee, W. A. Hand and Upper Extremity Transplantation: An Update of Outcomes in the Worldwide Experience. Plast. Reconstr. Surg. , (2014).
  4. Levi, D. M., et al. Transplantation of the abdominal wall. Lancet. 361, 2173-2176 (2003).
  5. Strome, M., et al. Laryngeal transplantation and 40-month follow-up. N.Engl.J. Med. 344, 1676-1679 (2001).
  6. Rose, K. G., Sesterhenn, K., Wustrow, F. Tracheal allotransplantation in man. Lancet. 1, 433(1979).
  7. Hofmann, G. O., et al. Allogeneic vascularized transplantation of human femoral diaphyses and total knee joints--first clinical experiences. Transplant. Proc. 30, 2754-2761 (1998).
  8. Hu, W., et al. A preliminary report of penile transplantation. Eur. Urol. 50, 851-853 (2006).
  9. Brannstrom, M., et al. Livebirth after uterus transplantation. Lancet. , (2014).
  10. Sarhane, K. A., et al. Diagnosing skin rejection in vascularized composite allotransplantation: advances and challenges. Clin. Transplant. 28, 277-285 (2014).
  11. Schneeberger, S., Khalifian, S., Brandacher, G. Immunosuppression and monitoring of rejection in hand transplantation. Tech. Hand Up. Extrem. Surg. 17, 208-214 (2013).
  12. Lee, W. P., et al. Relative antigenicity of components of a vascularized limb allograft. Plast. Reconstr. Surg. 87, 401-411 (1991).
  13. Sucher, R., et al. Hemiface allotransplantation in the mouse. Plast. Reconstr. Surg. 129, 867-870 (2012).
  14. Ibrahim, Z., et al. A modified heterotopic swine hind limb transplant model for translational vascularized composite allotransplantation (VCA) research. J Vis Exp. , (2013).
  15. Oberhuber, R., et al. Murine cervical heart transplantation model using a modified cuff technique. J Vis Exp. , (2014).
  16. Sucher, R., et al. Mouse hind limb transplantation: a new composite tissue allotransplantation model using nonsuture supermicrosurgery. Transplantation. 90, 1374-1380 (2010).
  17. Maglione, M., et al. A novel technique for heterotopic vascularized pancreas transplantation in mice to assess ischemia reperfusion injury and graft pancreatitis. Surgery. 141, 682-689 (2007).
  18. Sucher, R., et al. Orthotopic hind-limb transplantation in rats. J Vis Exp. , (2010).
  19. Zou, Y., Brandacher, G., Margreiter, R., Steurer, W. Cervical heterotopic arterialized liver transplantation in the mouse. J. Surg. Res. 93, 97-100 (2000).
  20. Zhang, F., et al. Development of a mouse limb transplantation model. Microsurgery. 19, 209-213 (1999).
  21. Schneeberger, S., et al. Upper-extremity transplantation using a cell-based protocol to minimize immunosuppression. Ann. Surg. 257, 345-351 (2013).
  22. Azari, K., Brandacher, G. Vascularized composite allotransplantation. Curr Opin Organ Transplant. 18, 631-632 (2013).
  23. Pomahac, B., Gobble, R. M., Schneeberger, S. Facial and hand allotransplantation. Cold Spring Harb. Perspect. Med. 4, (2014).
  24. Chong, A. S., Alegre, M. L., Miller, M. L., Fairchild, R. L. Lessons and limits of mouse models. Cold Spring Harb. Perspect. Med. 3, a015495(2013).
  25. Lin, C. H., et al. The neck as a preferred recipient site for vascularized composite allotransplantation in the mouse. Plast. Reconstr. Surg. 133, 133e-141e (2014).
  26. Shapiro, R. I., Cerra, F. B. A model for reimplantation and transplantation of a complex organ: the rat hind limb. J. Surg. Res. 24, 501-506 (1978).
  27. Leto Barone, A. A., et al. The gracilis myocutaneous free flap in swine: an advantageous preclinical model for vascularized composite allograft transplantation research. Microsurgery. 33, 51-55 (2013).
  28. Mathes, D. W., et al. A preclinical canine model for composite tissue transplantation. J. Reconstr. Microsurg. 26, 201-207 (2010).
  29. Barth, R. N., et al. Prolonged survival of composite facial allografts in non-human primates associated with posttransplant lymphoproliferative disorder. Transplantation. 88, 1242-1250 (2009).
  30. Brandacher, G., Grahammer, J., Sucher, R., Lee, W. P. Animal models for basic and translational research in reconstructive transplantation. Birth Defects Res C Embryo Today. 96, 39-50 (2012).
  31. Foster, R. D., Liu, T. Orthotopic hindlimb transplantation in the mouse. J. Reconstr. Microsurg. 19, 49(2002).
  32. Tung, T. H., Mohanakumar, T., Mackinnon, S. E. Development of a Mouse Model for Heterotopic Limb and Composite-Tissue Transplantation. J. Reconstr. Microsurg. 17, 267-274 (2001).
  33. Zhang, F., Shi, D. Y., Kryger, Z., Moon, W. Development of a mouse limb transplantation model. Microsurgery. 19 (5), 209-213 (1999).
  34. Schneeberger, S., et al. Atypical acute rejection after hand transplantation. Am. J. Transplant. 8, 688-696 (2008).
  35. Mathes, D. W., et al. Stable mixed hematopoietic chimerism permits tolerance of vascularized composite allografts across a full major histocompatibility mismatch in swine. Transpl. Int. 27, 1086-1096 (2014).
  36. Yamada, Y., et al. Use of CTLA4Ig for induction of mixed chimerism and renal allograft tolerance in nonhuman primates. Am. J. Transplant. 14, 2704-2712 (2014).
  37. Sachs, D. H., Kawai, T., Sykes, M. Induction of tolerance through mixed chimerism. Cold Spring Harb. Perspect. Med. 4, a015529(2014).
  38. Kawai, T., et al. HLA-mismatched renal transplantation without maintenance immunosuppression. N. Engl. J. Med. 358, 353-361 (2008).
  39. Kawai, T., Sachs, D. H. Tolerance induction: hematopoietic chimerism. Curr Opin Organ Transplant. 18, 402-407 (2013).
  40. Kawai, T., Sachs, D. H., Sykes, M., Cosimi, A. .B. HLA-mismatched renal transplantation without maintenance immunosuppression. N. Engl. J. Med. 368, 1850-1852 (2013).
  41. Leventhal, J., et al. Chimerism and tolerance without GVHD or engraftment syndrome in HLA-mismatched combined kidney and hematopoietic stem cell transplantation. Sci. Transl. Med. 4, 124-128 (2012).
  42. Cendales, L. C., et al. The Banff 2007 working classification of skin-containing composite tissue allograft pathology. Am. J. Transplant. 8, 1396-1400 (2008).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Мышиная модельваскуляризированная композитная аллотрансплантацияметодика использования манжеты без наложения швовсупермикрососудистый анастомоздиссекция бедренной артерии и веныприменение полиимидной манжетывыравнивание бедренной костикоаптация мышечных группанализ отторжения аллотрансплантата
Ортотопическая задних конечностей трансплантации у мышей
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.