Иммунофенотипирование цельной крови необходимо для мониторинга иммунной системы человека. Однако количество необходимых реагентов и нестабильность специфических флуорохромов в предварительно смешанных коктейлях обуславливают необходимость ежедневной подготовки реагентов. В данной работе показано, что полуавтоматическое приготовление окрашивающего коктейля антител помогает установить надежное иммунофенотипирование за счет минимизации вариабельности дозирования реагентов.
Методическая статья
Полуавтоматический подход к подготовке антител коктейли Иммунофенотипирование периферической крови человека
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Иммунофенотипирование периферической крови методом проточной цитометрии определяет изменения в частоте и активации статуса лейкоцитов периферической во заболевания и лечения. У него есть потенциал, чтобы предсказать терапевтическую эффективность и определить новые терапевтические мишени. Всего окрашивание крови использует unmanipulated кровь, которая минимизирует артефакты, которые могут возникнуть во время подготовки образца. Тем не менее, вся окрашивание крови также должно быть сделано на свеже собранной крови, чтобы обеспечить целостность образца. Кроме того, лучше всего готовить коктейли антител в тот же день, чтобы избежать потенциальной нестабильности тандемных-красителей и предотвратить взаимодействие реагентов между блестящих фиолетовых красителей. Поэтому вся окрашивание крови требует тщательного стандартизации для контроля внутри и между экспериментальной изменчивости.
Мы сообщаем развертывание автоматизированной жидкой обработчика снабженную двумерной (2D) сканер штрих-кодов в стандартном процессе изготовления antibodу коктейли для проточной цитометрии. Антитела были перенесены в 2D со штрих труб, расположенных в формате 96-луночного и их содержание заносятся в базу данных. Жидкости обработчик может затем найдите флаконы источником антител, ссылаясь имена антител в базе данных. Наш метод устранены утомительной координации для позиционирования трубок источником антител. Это при условии, универсальность позволяет пользователю легко изменить любое количество деталей в процессе разлива антитела, такие как специфического антитела для использования, объема и назначения путем модификации базы данных без переписывания был установлен в способе обеспечения для каждого анализа.
Доказательство концепции эксперимента достигли выдающихся меж- и внутри- сходимость, продемонстрировал методом повторной подготовки 11-цветовой, 17-антитела проточной цитометрии. Эти методики увеличить общую пропускную способность для проточной цитометрии анализах и облегчается ежедневная Получение комплекса антитело коктейлей, необходимых для детального феноTypic характеристика свеже собранного антикоагулированной периферической крови.
Введение
Иммунофенотипирование периферической крови человека определяет количественные и качественные изменения в иммунной клеточных подмножеств 1. Это дает представление о механизмах действия и сопротивления, открытий СПИД прогностических биомаркеров, и способствует развитию комбинированных иммунотерапии. Таким образом, проверка и стандартизация иммунофенотипирования является областью значительный интерес к академических исследователей, клинических лабораторий и промышленности.
Хотя иммунофенотипирования периферической крови методами проточной цитометрии, в настоящее время используется для клинического управления гемобластозами 2,3 и вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) 4,5, надежного иммунофенотипирования периферической крови для требований иммунотерапии конкретных соображений в валидации и стандартизации, потому что это требует более широкое освещение над подмножеств иммунных клеток и активации / ингибирующих рецепторов 1,6-8. Successful иммунофенотипирования требует тщательного стандартизации, чтобы минимизировать изменчивость эксперимент-к-эксперимента, связанной с инструментальной и окрашивания клеток процедуры 9,10. В то время как стандартизация настроек прибора для проточной цитометрии хорошо известна по решению бывшего озабоченность 9,11,12, остается неясным, как свести к минимуму изменчивость, связанную с окрашиванием клеток, не ограничивая охват иммунных клеток подмножеств и их статус активации.
Поскольку число антигенов, которые будут обнаружены увеличивается, то же самое делает возможность ошибки и изменчивость вследствие неоптимального дозирования реагентов и перекрестного загрязнения. Методы phenoptypic анализа антикоагулированных цельной крови были созданы в конце 1980-х для использования в клинических лабораторных анализах. Эти же методы удовлетворения потребностей в научно-исследовательской лаборатории для пробоподготовки. Важно отметить, что коктейли антител, используемые в клинической лаборатории, как правило, менее сложной и AVAilable предварительно титруют и предварительно смешивают в производителя. Только один перенос коктейля предварительно смешанной антител требуется. В условиях исследования, антитела коктейли 10-16 антител являются типичными. Каждый коктейль должен быть подтверждено на стабильность путем лабораторных или приготовить свежую перед каждым анализом. Подготовка нескольких коктейли антител в образце может повлечь за собой пипетирования 50-80 отдельных антител, задачу, которая является одновременно утомительно и чревато ошибками.
Автоматизация приготовления коктейлей имеет ряд преимуществ перед ручной приготовления коктейлей, таких как меньшим количеством ошибок, повышение точности пипетки, и, возможно, даже снизилось реагента потерь. Мы сообщаем успешное внедрение автоматизированной жидкой обработчика снабженную двумерной (2D) сканер штрих-кодов в процессе клеточного окрашивание иммунофенотипирования минимизировать вариабельность, связанную с подготовке образцов.
Протокол
Сбор и использование периферической крови в этом протоколе была утверждена Провиденс здравоохранения и услуги Совета по рассмотрению институциональной. Все человеческие субъекты условии их письменное информированное согласие.
Примечание: Следуйте универсальных мер предосторожности. Все человеческая кровь должна рассматриваться как если инфекционные и обрабатываются в соответствии с уровнем безопасности 2 практики.
Примечание: Иммунофенотипирование с периферической цельной крови осуществляется путем инкубации с антикоагулянтом цельную кровь с флуоресцентными метками моноклональных антител для обнаружения антигены на поверхности клеток, а затем гипотоническим лизисом для удаления красных кровяных клеток. Клетки промывают и образец анализировали с помощью цитометра потока. Описано здесь метод сосредотачивается на приготовления коктейлей антител с использованием автоматизированной жидкого обработчик оснащенный 2D штрих-код читателя. Во-первых, "Базовый Коктейль", который идентифицирует иммунных клеток подмножества и "Активация Коктейль", который контролирует Inducible антигены готовили отдельно (таблица 1). Затем оба коктейли смешивают, чтобы создать "Мастер антител коктейль". На рисунке 1 рабочего процесса.
1. Образец
- Сбор периферической крови с помощью венепункции в антикоагулянтом пробирки для сбора крови гепарина натрия, инвертировать мягко несколько раз, чтобы обеспечить надлежащее смешивание, а затем, удерживая при комнатной температуре. Отклонить образца, если со сгустками или гемолизированная 13.
2. Лабораторное оборудование Подготовка
- Этикетка 2D штрих-кодов трубки с человеческого понимания этикеток (антитела имя, продавец, каталожный номер и номер партии).
- Передача все содержимое флаконов антител из торгового автомата (перечислены в таблице 1) в соответствующие 2D трубки штрих-кода.
Примечание: Проявляйте особую осторожность, чтобы не вводить пузырьков в виде пузырьков ложно вызывают жидкости датчиком уровня (LLS), что приводит к нерациональному передачи реагента.
Примечание: Убедитесь, что каждый В.И. антителааль обладает достаточной антитело для бега. - Прочитайте 2D штрих-код для каждой трубки читателем 2D штрих-кодов.
- Сделать таблицу, содержащую имена антител (AB) и штрих-кодов считывает (BC), используя программное обеспечение электронной таблицы и сохранить его в значений, разделенных запятыми (CSV) файл как "AB_BC.csv" (таблица 2).
Примечание: Убедитесь, что для форматирования ячеек как "Текст" не "Номер", чтобы сохранить первое "0" для чисел штрих-кодов, если любой (например, 0163562544). Добавить «X 0000000000" в конце, чтобы указать конец данных. - Винт РЛС металлические пластины к раме палубе в автоматизированном жидкой левши включить РЛС.
3. Программирование для автоматизированного Liquid Handler
Примечание: Существует два способа будут запрограммированы в программном обеспечении для автоматизированного жидкого обработчика: а) способ изготовления "Base коктейль" и "Активация коктейль" в 3.1), и б) способ изготовления «мастер Antiboду Коктейль "путем объединения" Base коктейль "и" Активация коктейль "в 3.2) (рисунок 1).
- Создание метода для изготовления "Base коктейль" и "Активация коктейль" (рисунок 2).
- Использование программного обеспечения электронной таблицы, сделать таблицу, которая имеет информацию для имен антител (AB_NAME), расположение назначения трубки (ну-BASE или хорошо ACT) и объема (VOL) в мкл для "Base коктейль" с Р50 наконечниками (BASE_CT_P50: Таблица 3) или P200 советы (BASE_CT_P200: Таблица 4) и "Активация коктейль" с Р50 наконечниками (ACT_CT_P50: таблица 5) или P200 наконечниками (ACT_CT_P200: таблица 6). Сохранить их в качестве CSV файлов. Для «хорошо база" и "НУ-ACT" месте, обратитесь к номерам на рисунке 3.
Примечание: VOL = титр х (# окрашивающего + 2) мкл. Титры в таблице 1, много конкретных. Оператор должен определить синицаэр для каждого антитела, как описано другими 14. - Нажмите на иконку, чтобы запустить программу для автоматизированного обработчика жидкого на компьютере, чтобы создать способ изготовления "Base коктейль" и "Активация коктейль".
Примечание: Следующие шаги 3.1.3-3.1.7 будут определять лабораторное оборудование: поместив трубку стойку с 2D штрих-кодов труб (рисунок 4). Измерения приведены в качестве ссылки. Следователи должны определить и скорректировать для каждого инструмента. - На панели инструментов в разделе "Проект", выберите "Лабораторное оборудование Type Editor". Щелкните правой кнопкой мыши на объекте в течение 96-луночного плоской пластины, выберите "Копировать" и введите "Matrix_OneML_TubeRack" в всплывающем окне.
- Дважды щелкните на объекте "Matrix_OneML_TubeRack", чтобы открыть диалоговое окно. Выделите "Основная информация", установить 12.775 см (х) и 8.546 см (Y) для "Span" и 4,625 см для "Высота". (4А).
- Затем выделите "движЛОР информация ". Установите захватов смещением 0 (х) 0 (Y), и 0,3 (Z), Захват сжать -0.1cm, захватов Unsqueeze 2,6 см, Speed Limit 75%, а затем проверить" Использовать датчик захватов "(рис 4B).
- Затем выделить "Well_1". Установите следующим образом: "Ну Offset"; 1,5 см (Х) и 1,13 см (Y), "Ну Count"; 12 (Х) и 8 (Y), "Ну интервалы"; 0,9 (Х) и 0,9 (Y), "Максимальный объем"; 1500 мкл, формат "; Регулярный" Колум 2 Смещение "; 0, и" По умолчанию Volume "; 0 (рис 4C).
- Наконец, нажать на "... редактировать" кнопку справа от "Конфигурация Well" (рис 4С). В всплывающем окне, устанавливается следующим образом: "Форма"; Круглый, "Верхняя Радиус"; 0.37 см, "Нижняя Радиус"; 0.37 см, а "Высота"; 3,9 см. Проверьте "нижней секции" и установить "Форма"; Конус, "Радиус"; 0.37 см, а "Высота"; 0,4 см (рис 4D).
Примечание: Следующие шаги 3.1.8-3.1.11 определит лабораторное оборудование: поместив трубку стойку с микроцентрифужных труб. Измерения приведены в качестве ссылки. Следователи должны определить и скорректировать для каждого инструмента. - На панели инструментов в разделе "Проект", выберите "Лабораторное оборудование Type Editor". Щелкните правой кнопкой мыши на объекте для 24-позиционной стойке, выберите "Копировать" и типа "SmallTuberack_microfugetubes".
- Двойной щелчок на объекте «SmallTuberack_microfugetubes", чтобы открыть диалоговое окно. Выделите "Основная информация", установить 12,75 см (х) и 8,5 см (Y) для "Span" и 3,95 см для "Высота".
- Затем выделить "Well_1". Установите следующим образом: "Ну Offset"; 1.621 см (X) и 1.181 см (Y), "Ну Count"; 6 (Х) и 4 (Y), "Ну интервалы"; 1,9 (Х) и 1,9 (Y), "Максимальный объем"; 1000 мкл, формат "; Регулярный" Колум 2 Смещение "; 0, и" По умолчанию Volume "; 0.
- Наконец, нажмитеАН «... редактировать" кнопку справа от "Конфигурация Well". В всплывающем окне, устанавливается следующим образом: "Форма"; Круглый, "Верхняя Радиус"; 0.3345 см, "Нижняя Радиус"; 0,274 см, и "Высота"; 3.6728 см. Проверьте "нижней секции" и установить "Форма"; Полушарие, и "Радиус"; 0.1575 см.
Примечание: Следующие шаги 3.1.12-3.1.35 будет объяснить, как программировать "Новый метод" для изготовления "Base коктейль" и "Активация коктейль" (рисунок 2). - Нажмите на значок "Новый метод" и открытым.
- Перетащите "если" значок между и значок "Пуск" "Finish" в новом методе (рис 2). Нажмите и выделить «если» значок. Введите следующую за Условие:. CreateObject ( "World.EngineObject") моделирования
Примечание: Это позволит предотвратить программное обеспечение от выполнения проверки ошибок и позволит этот метод работать. Без этого шага software предупредит недостающую информацию для блока данных, как штрих-код считывает доступны только после стадии "VisionMate: Читать штрих-кодов" описано в 3.1.20). Так этот шаг отключает этап проверки в программном обеспечении, оператор должен подтвердить есть достаточно советы и реагент на палубе для выполнения этого метода. - Вставьте значок «Установка приборов" между "тогда" значок и значок первого "конец" под "если" значок (рисунок 2).
Примечание: Для всех следующих шагов, перетаскивайте значки между значком "Else" и значок второго "End" под "если" значок, так что шаги заключены в "Else". - Перетащите значок "Настройка прибора" под значком "Else" в методе (рис 2).
- Нажмите на значок "Настройка прибора" в методе, чтобы открыть окно. Настройка labwares путем перетаскивания иконки для Р50 РЛС отфильтрованные советы, P200 LLS отфильтрованные советы, P1000 советов ", Matrix_OneML_TubeRack", два "SmallTuberack_microfugetubes", и резервуар для соответствующей деке месте в списке значков.
- Откройте диалоговое окно для "Matrix_OneML_TubeRack" и именем "AB_BOX". Откройте диалоговое окно для «SmallTuberack_microfugetubes" и назвать одну как «BASE_CT" для базовых коктейли, а в другом как "ACT_CT" для активации Коктейль (рисунок 5).
- Перетащите значок "передача" методу (рисунок 2), чтобы добавить шаг для передачи буфер из резервуара в микроцентрифужных труб для "Base Коктейль» и «активации коктейль". Объем Передача = 25 мкл х (# окрашивания +2) для "Base коктейль" и = 25 мкл х (# окрашивания +2) для "активации" Коктейль.
- Добавить шаги для перемещения "Matrix_OneML_TubeRack" на читателя 2D штрих-кодов. Перетащите значок "VisionMate Move" методу (Fiфигура 2) и указать переход от начального положения палубы в положение считывания штрих-кода на палубе.
- Перетащите "VisionMate: Читать штрих-кодов" значок методу (рисунок 2). Откройте диалоговое окно, и выберите "VisionMate" в качестве устройства и назвать данные, выбранные в качестве "BC_Read".
- Перетащите "User Пауза" (рисунок 2), выберите "Пауза всю систему и отображать это сообщение" и введите комментарий в поле, чтобы напомнить пользователям подтверждения того, что все штрих-коды считываются, прежде чем приступить к следующему шагу.
Примечание: Следующие шаги 3.1.22-3.1.26 свяжет между расположения скважин и имена антител с использованием информации штрих-кода. Это позволит автоматизированную обработчик жидкий найти местоположение конкретного антитела на основе имени антител "AB". - Перетащите значок "Отчетность по началу работы" методу (рисунок 2).
- Сделать текстовый файл с помощью текстового программу и сохранить егокак "BC_Readout" в папке документа на компьютере.
- Откройте диалоговое окно для "Отчетность Шаг", выберите "Текстовый файл" для стиль отчета, и выберите файл "BC_Readout" через браузер.
Примечание: Полученный файл "BC_Readout" будет содержать информацию обо всех labwares на палубе, кроме советов, как настроить в 3.1.16, включая информацию для штрих-кода считывает штрих-кодов для труб 2D и расположения скважин в "Matrix_OneML_TubeRack". - Добавить "Создать набор данных" шаг, чтобы связать штрих-код и так информации. Перетащите значок "Создать набор данных» методу (рисунок 2), нажмите его, чтобы открыть диалоговое окно, выберите "Считать из файла" и выберите "AB_BC.csv" (Таблица 2 создан в 2.4), проверить "запятыми разделителями "и" файл содержит строку заголовка ".
Примечание: В файле окне предварительного просмотра, имена антител (AB) и штрих-кодов считывает (BC) должно быть видно. - В SAme диалоговое окно для "Создать набор данных» в 3.1.25, выберите "VM1" расположения лабораторное и "0" для глубины стека, выберите "Матч Образец ID", и использовать поле "BC", чтобы соответствовать с данными Установите "BC_Read". Выберите "AB" и "BC" за "наборы данных должны быть созданы" (рисунок 6).
- Перетащите значок "VisionMate Move" методу (рисунок 2) и указать переход от позиции считывания штрих-кодов "VM1" обратно в исходное положение палубы на палубу.
Примечание: Следующие шаги 3.1.28-3.1.33 будут определять шаг передачи для "Base коктейль". - Перетащите значок "Worklist" (рисунок 2) и выбрать необходимый рабочего списка файл "Base_CT_P50" (таблица 3), созданный в 3.1.1. Проверьте "Loop весь рабочий список".
- Перетащите значок "передача" непосредственно под значком "Worklist" (Рисунок 2).
- Нажмите на значок "передача", чтобы открыть поле спецификации. Выберите только один из зондов, P50 LLS отфильтрованные советы, выбрать "разгружать их", когда передача осуществляется, и проверить "Изменить советы между передачами". Добавить источник, нажав кнопку "Нажмите здесь, чтобы добавить источник", выберите "Matrix_OneML_TubeRack" как лабораторного оборудования, и выбор места на палубе по названию "AB_BOX".
- В поле, характеризующее "Transfer", "Увеличить" на диаграмме 96 лунок щелкнув правой кнопкой мыши и выберите "AB" сразу после "использования набора данных" и выберите, где ее значения "равны" и "= AB_NAME" , Выберите метод передачи выбора.
Примечание: Использование РЛС настоятельно рекомендуется, чтобы избежать попадания осажденного мусора вблизи дна. - В поле, характеризующее "Transfer", выберите пункт назначения, нажав кнопку "Нажмите здесь, чтобы добавить пункт назначения", щелкните правой кнопкой мыши для увеличения и выберите "SmallTuberack_microfugetubes "как лабораторного оборудования, объем как" = VOL ", и места на палубе по названию" BASE_CT ". После уменьшения масштаба, правой кнопкой мыши снова, проверьте" Указать Выбор как текст ", и установите флажок" Указать цели с выражением ниже: "и тип" = WELL_BASE "в качестве переменной для позиции назначения палубы.
- Повторите 3.1.29-3.1.32 аналогично для "Base коктейль" с советами P200, выбрав CSV файл "Base_CT_P200" (Таблица 4) выберите P200 LLS отфильтрованные советы, а также соответствующую технику пипетки для P200 РЛС отфильтрованных советы.
Примечание: Следующие шаги 3.1.34 и 3.1.35 будут определять шаг передачи для "активации" Коктейль. - Повторите 3.1.29-3.1.32 аналогично для "активации" Коктейль с Р50 советы, выбрав файл CSV "ACT_CT_P50" (таблица 5) и выбрав "ACT_CT" в качестве пункта назначения. Щелкните правой кнопкой мыши на пункт назначения и проверить "Указать Выбор как текст";. Проверьте "Указать цели с ниже выражения:" и тип "= WELL_ACT" в качестве переменной для позиции назначения.
- Повторите 3.1.34 аналогично для "активации" Коктейль с советами P200, выбрав файл CSV "ACT_CT_P200" (таблица 6) и P200 LLS отфильтрованные советы.
Примечание: Способ получения "Base коктейль" и "Активация коктейль" может быть закрыт после сохранения.
- Использование программного обеспечения электронной таблицы, сделать таблицу, которая имеет информацию для имен антител (AB_NAME), расположение назначения трубки (ну-BASE или хорошо ACT) и объема (VOL) в мкл для "Base коктейль" с Р50 наконечниками (BASE_CT_P50: Таблица 3) или P200 советы (BASE_CT_P200: Таблица 4) и "Активация коктейль" с Р50 наконечниками (ACT_CT_P50: таблица 5) или P200 наконечниками (ACT_CT_P200: таблица 6). Сохранить их в качестве CSV файлов. Для «хорошо база" и "НУ-ACT" месте, обратитесь к номерам на рисунке 3.
- Создать новый метод для изготовления "Мастер антител коктейль" путем объединения "Base коктейль" и "Активация коктейль" в 5 мл круглым дном полистирола трубы (рис 7).
Примечание: Следующие шаги 3.2.1-3.2.6 определит лабораторное оборудование: поместив трубку стойку с 5 мл круглым дном полистирола трубками. Числа представлены для ознакомления. Следователи должны определить и скорректировать для инструмента.- На панели инструментов в разделе "Проект", выберите "Лабораторное оборудование Type Editor". Правой клИк на объекте для стойки 24-позиционным, выберите "Копировать" и введите "BiocisionCoolRack_XT" в всплывающем окне.
- Дважды щелкните на объекте "BiocisionCoolRack_XT", чтобы открыть диалоговое окно.
- Выделите "Основная информация", установить 12,78 см (х) и 8,57 см (Y) для "Span" и 7,93 см для "Высота".
- Выделите "Well_1". Установите следующим образом: "Ну Offset"; 1,55 см (X) и 1,33 см (Y), "Ну Count"; 6 (Х) и 4 (Y), "Ну интервалы"; 1.95 (X) и 1,97 (Y), "Максимальный объем"; 2000 мкл, формат "; Регулярный" Колум 2 Смещение "; 0, и" По умолчанию Volume "; 0.
- Открыть "Конфигурация хорошо» для редактирования. Установите следующим образом: "Shape"; Круглый, "Верхняя Радиус"; 0.5375 см, "Нижняя Радиус"; 0,48 см, а "Высота"; 7.07 см. Проверьте "нижней секции" и установить "Форма"; Полушарие, и "Радиус"; 0,45 см.
Примечание: Следующие шаги3.2.6-3.2.7 будут определять шаги передачи и быть использован на стадии 3.2.14. - Создание CSV файл "AB_MACT" (таблица 7) для изготовления коктейль антител со следующими заголовками: а) "SRC_BASE"; имя лабораторное для "Base коктейль", б) "WELL_BASE"; а места в лабораторного оборудования для "Base коктейль", в) "VOL_BASE"; Объем передачи данных для "Base коктейль" в мкл, D) "SRC_ACT"; имя лабораторное для "активации" Коктейль, е) "WELL_ACT"; а места в лабораторного оборудования для "активации" Коктейль, F) "VOL_ACT"; Объем передачи данных для "активации" Коктейль в мкл, г) "DEST_MACT"; Информация о положении палуба для «Мастер антител коктейль", и ч) "WELL_MACT"; хорошо позиционировать информацию в стойку трубы для "Мастер антител коктейль".
- Заполните информацию под заголовками, созданными в 3.2.6) (таблица 7) следующим образом: а) использовать "BASE_CT"под SRC_BASE, б) информацию о местоположении список хорошо "WELL_BASE", как показано на фигуре 3А, в) список общий объем антител (25 мкл буфера + сумма всех базовых титров антител для одного окрашивания) под "VOL_BASE", д) использовать "ACT_CT" под SRC_ACT, адрес) информацию о местоположении список также для "WELL_BASE", как показано на фигуре 3В, F) список общего объема антител (25 мкл буфера + сумма всех титров антител активации для одного окрашивания) в разделе «VOL_ACT". Передача 25 мкл буфера для Т-клеток FM3. Обратитесь к Таблице 1 для испытаний 1-3, г) использование "SPL_TUBES_1" (см 3.2.10) для "DEST_MACT" и Н) информации о местоположении список хорошо для "WELL_MACT", как показано на рисунке 8.
Примечание: Следующие шаги 3.2.8-3.2.15 будет запрограммировать способ изготовления "Мастер антител коктейль" - Открыть новый метод (рисунок 7).
- Перетащите "ИнстрЗначок мент установки "к новому методу (рисунок 7).
- В спецификации области "Настройка прибора", перетащите значки P1000 советы, двух "SmallTuberack_microfugetubes" и "BiocisionCoolRack_XT" на диаграмме палубы. Откройте диалоговое окно для двух "SmallTuberack_microfugetubes" и называть "BASE_CT" и "ACT_CT" соответственно, как указано в 3.1.17. Откройте диалоговое окно для "BiocisionCoolRack_XT" и называть "SPL_TUBES_1", как указано в 3.2.7 (рисунок 9).
- Добавить новый "Группа" путем перетаскивания значка "Группа" методу (рисунок 7).
- Перетащите значок "Передача из файла" непосредственно под значком "Группа" передать "Base коктейль" для изготовления "Мастер антител коктейль" (рисунок 7).
- В поле, характеризующее "Transfer из файла", выберите советы P1000 используется, SИзбранный "разгружать их", когда передача осуществляется, и проверить "Изменить советы между передачами".
- В поле, характеризующее "Transfer из файла", выберите файл "AB_MACT" (таблица 7) при просмотре, проверьте "Файл содержит строку заголовка". Выберите "SRC_BASE" для позиции источником лабораторного оборудования и "WELL_BASE" для скважинной информации в исходном лабораторного оборудования, выберите "DEST_MACT" для лабораторного оборудования назначения и "WELL_MACT" для скважинной информации в лабораторного оборудования назначения, и выберите "VOL_BASE" за дополнительной информацией громкости (рис 10). Выбрали подходящий метод передачи для P1000 советы.
Примечание: РЛС не может быть необходимо для этого процесса. - Добавить еще один "Transfer From File", перетащив его непосредственно под "Группа" передать "Activation коктейль", который должен быть смешан с "Base Коктейль" для изготовления "Мастер антител коктейль" (Рисунок 7 </ STRONG>). Аналогично настроить шаг передачи как в 3.2.13 и 3.2.14. Исключением являются следующие: а) Выберите "SRC_ACT" для позиции источником Лабораторное оборудование, б) "WELL_ACT" для скважинной информации в исходном лабораторного оборудования, и в) "VOL_ACT" для получения информации тома.
4. Порядок работы
- Во-первых, дважды щелкните значок программного обеспечения для запуска 2D считыватель штрих-кодов на компьютере.
- Затем дважды щелкните значок программного обеспечения для запуска автоматизированной обработчик жидкость на компьютер.
- Под "Instrument", выберите "Дом всем осям», чтобы простые шприцев автоматизированного жидкого обработчика. Убедитесь, что все шприцы не содержат никаких видимых пузырьков воздуха.
Примечание: "Главная Все Оси" также даст инструменту точку отсчета, из которой, чтобы сделать последующие шаги. - Откройте Способ получения "Base коктейль" и "Активация Коктейль" (рисунок 2) в программном обеспечении для аutomated жидкости обработчик.
- Поместите микроцентрифуге трубки в "SmallTuberack_microfugetubes" за "BASE_CT" и "ACT_CT» по количеству «Base Коктейль» и «активации коктейль", которое будет сделано (рисунок 3). Затем поместите их на палубе в соответствии с "Настройка прибора" (рисунок 5).
- Поместите емкость с буфером на палубе в соответствии с "Настройка прибора".
- Де-крышка 2D трубки штрих, содержащие антитела с использованием 8-канального завинчивающейся крышкой decapper. Держать крышки в точном порядке на колпачок держит лоток, чтобы избежать перекрестного загрязнения. Поместите "Matrix_OneML_TubeRack" на палубе в соответствии с "Настройка прибора" (рисунок 5).
- Место P50 LLS отфильтрованные советы, P200 LLS отфильтрованные советы и P1000 советы на палубе в соответствии с "Настройки прибора" (рисунок 5).
- Начало метод, с помощью нажатия зеленой три-Г-образное начало Значок. По наставлению всплывающем окне, чтобы убедиться, что все элементы на палубе соответствовать "Настройка прибора", как это определено в методе. Не размещать любые объекты, которые не перечислены в разделе "Установка прибора" на палубе, так как это может раздавить капсулу и / или захват. Нажмите кнопку "ОК", чтобы продолжить.
- После того, как "Matrix_OneML_TubeRack" перемещается на 2D штрих-код читателя и штрих-коды считываются, другой всплывающее окно попросит ли считываются все штрих-коды. Продолжить нажатием "ОК" раз подтверждали.
- После завершения передачи по автоматизированной обработчика жидкой, резюмируем Barcoded трубки 2D с использованием 8-канального завинчивающейся крышкой decapper, и положил их обратно до 4 ° С.
- Vortex все микроцентрифуге трубки энергично в течение 20 сек, и вернуть их в стойках трубки.
Примечание: Недостаточная вортексе может привести к неоптимальной окрашивания клеток. - Закройте способ изготовления "Base коктейль" и "Активация коктейль", Затем откройте способ изготовления "Мастер антител коктейль".
- Настройка предварительно помечены 5 мл круглым дном полистирола трубы на "BiocisionCoolRack_XT" (рисунок 8) и поместите его на палубе. Этикетки должны указать, какие "База коктейль" и "Активация Коктейль" смешиваются, а также соответствующего пациента ID.
- Поместите трубки стеллажи для "Base коктейль", "включение коктейль", и P1000 советы на палубе (рис 9). Начало метод (рисунок 7). По наставлению всплывающем окне, чтобы убедиться, что элементы на матч палуба инструментальной установки в способе (рис 9). Нажмите кнопку "ОК", чтобы продолжить.
- Когда вышеописанный процесс выполняется вручную добавьте 50 мкл образцов крови в каждых 5 мл с круглым дном полистирола трубки, которая содержит смесь антител.
- Vortex пробирки с образцами внутри бокса биологической безопасности II класса и инкубировать 15 минут при комнатной температуре в темноте. Takе уход, чтобы избежать полос кровь на сторонах трубок, так как это приведет к несогласованности окрашивания. Тщательно удалить любые полосы крови ватные тампоны смоченные стирки поток буфера.
- Добавьте 1 мл буфера для лизиса эритроцитов вручную и инкубировать 15 минут при комнатной температуре в темноте.
- Добавить 2 мл промывочного потока буфера (0,1% азида натрия, 1% BSA, 10 ед / мл гепарина в 1x HBSS) и центрифугой в течение 5 мин при 400 х г в. Удалите супернатант внутри бокса биологической безопасности II класса. Повторите этот процесс стирки. Повторное приостановить окрашенных клеток в 0,5 мл промывочного потока буфера.
- Настройка потока цитометр, оснащенный муки лазеров и соответствующими фильтрами и запустить образцов с использованием 5 мл круглым дном полистирола трубки. Используйте стандартные цитометра калибровки и компенсации флуоресценции методы сбора 12,15 данных. Соберите все параметры, перечисленные в "флуорофор" в таблице 1.
Примечание: Соответствующие контрольные материалы должны быть использованы в каждом опыте, чтобы обеспечить надлежащее задау производительности. - После запуска образцов, экспорт приобрела данные как FCS файлов.
- Анализ данных с помощью соответствующего программного обеспечения. Определить подмножества Т-клеток использует стратегию стробирования изложенный Человеческий иммунологии Проекта 1.
Результаты
Цель всей иммунофенотипирования крови является получение количественных (разграничение подмножеств иммунных клеток) и качественную (обнаружение состояния активации) информацию о иммунных клеток. Мы слегка модифицировали Т-клеток Иммунофенотипирование панель предложенный Человеческий иммунологии Проекта 1, чтобы улучшить общую производительность нашего метода (таблица 1). Наша группа Т-клеток направлена на выявление наивным, центральный памяти (см) эффекторной памяти (EM) и эффекторные Т-клетки. Вкратце, мы дискриминировать дублеты, основанные на FCS-А и FCS-H. Тогда мы ворота на лимфоцитах, основанных на боковой разброс и уровней CD45. Т-клетки затем идентифицируют путем экспрессии CD3. CD3 + Т-клетки дифференцировались в γδ Т-клеток и Т-клеток ар. αβ Т-клетки в свою очередь делятся CD4 + и CD8 + Т-клеток. CD4 + и CD8 + Т-клетки затем анализировали на их подмножеств на основе expressioп CD45RA и CCR7: CD45RA - CCR7 + CM, CD45RA + CCR7 + наивные, CD45RA + CCR7 - эффектора и CD45RA - CCR7 - EM Т-клетки 1. Кроме того, мы также следить за их экспрессию маркеров активации, таких как CD38, HLA-DR, ICOS, PD-1, GITR, 4-1ВВ, CD69, NKG2D и OX40 получить качественную информацию.
Чтобы продемонстрировать точность данного метода, мы окрашивали периферийных образцов цельной крови из 4 здоровых доноров 5 раз в течение одного дня. На рисунке 11 показана взаимосвязь между процентной клеток субпопуляции Т на закрытых лимфоцитов и коэффициента процентов дисперсионного (% CV). Детальная разбивка субпопуляций процентов Т-клеток на закрытых лимфоцитов и% CV для каждого подмножества показано в таблице 8. Данные тесты 2 и 3 не включены в рисунке 11 и в таблице 8 для простоты. Менее 25% CVМежду сериями (между анализами точностью) был предложен для критериев приемлемости для фенотипических биомаркеров анализов для исследований использования 10. Все измерения встретились эти критерии кроме ICOS + γδ Т-клеток (26.64-46.39%. Таблица 8) и ICOS + CD8 Т-клеток (14.64-58.39%. Таблица 8). Эти значения приведены для демонстрационных целей. Мы не использовать эти измерения, поскольку ICOS основном играет важную роль в активации лимфоцитов CD4 16. Тенденция высшего% CV в популяциях, которые содержат низкий процент для всего населения наблюдалось другими 7. В случае следователи заинтересованы в мониторинге редких событий, количество клеток исследовали должна быть увеличена для того, чтобы преодолеть большую неточность 17. Вместе наши данные показывают успешное развертывание автоматизации в подготовке пробы цельной крови иммунофенотипирования.
< IMG Alt = "Рисунок 1" SRC = "/ файлы / ftp_upload / 53485 / 53485fig1.jpg" />
Рисунок 1. Последовательность действий при иммунофенотипирования с периферической цельной крови. Шаг за шагом как последовательность действий по иммунофенотипическая анализе показано. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.
Рисунок 2. Обзор способу изготовления "Base коктейль" и "Активация коктейль". Шаги в способе изготовления "Base коктейль" и "Активация коктейль" в программном обеспечении для автоматизированного обработчика жидкого показаны. Пожалуйста, нажмите здесь для просмотра увеличенная версия этого рисунка.
е 3 "SRC =" / файлы / ftp_upload / 53485 / 53485fig3.jpg "/>
Рисунок 3. Схема к стойке трубки с BACE_CT и ACT_CT. (А) показывает макет для трубной стойке "BACE_CT". (B) показывает макет для трубной стойке "ACT_CT". Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.
Рисунок 4. Определение Лабораторное оборудование для стойки трубы со штрих-кодом труб 2D. Шаг за шагом процесс определения стойку трубки со штрих-кодом труб 2D. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.
485fig5.jpg "/>
Рисунок 5. Установка параметров прибора для способа изготовления "Base коктейль" и "Активация коктейль". Это показывает расположение палубы для способа изготовления "Base коктейль" и "Активация коктейль". Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этого фигура.
Рисунок 6. Установка для "Создать набор данных". Это показывает подробную установку для "Создать набор данных». Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.
FIGU Re 7. Обзор способу изготовления "Мастер антител коктейль". Шаги в способе изготовления "Мастер антител коктейль" в программном обеспечении для автоматизированного обработчика жидкого показано. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.
Рисунок 8. Схема для стойки трубы с 5 мл круглым дном полистирола трубками. Это показывает макет для трубной стойке "SPL_TUBES_1". FM3 означает флуоресценцию минус 3 (блестящий фиолетовый 421, Фикоэритрин и аллофикоцианин). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.
ftp_upload / 53485 / 53485fig9.jpg "/>
Рисунок 9. Установка параметров прибора для способа изготовления "Мастер антител коктейль". Это показывает расположение палубы для способа изготовления "Мастер антител коктейль". Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.
Рисунок 10. Настройка для "Transfer из файла". Это показывает подробную установку для "Transfer из файла". Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.
Рисунок 11. Низкий переменным Способность в полуавтоматическом всей иммунофенотипирования крови. единичные значения CV всех клеточных популяций, проанализированных с четырех здоровых доноров, показаны как синий открытом круге. Кривая регрессии показана на синей линии. Красный пунктирные линии указывают 95% уверены полосы и жадность пунктирные линии показывают 95% полосы прогнозирования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.
Рисунок 12. Пример неоптимальным окрашивания. Окрашивание проводили с адекватной или неадекватной встряхивая микроцентрифужных труб из "BACE_CT" и "ACT_CT". Есть два закрытых населения в B. Незначительные население со слабым CD45 окрашивания представляет клетки, которые не получают оптимальную окрашивание.g12large.jpg "целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.
| ГРУППА | МАРКЕР | флуорофор | клон | Титр (мкл / окрашивание) | |
| БАЗА КОКТЕЙЛЬ | TCELL | CD45 | FITC | 2D1 | 0,4 |
| CD3 | Alexa700 | UCHT1 | 1 | ||
| CD8 | APC-H7 | SK1 | 0,4 | ||
| CD4 | PerCP-Cy5.5 | SK3 | 2 | ||
| CCR7 | PE-CF594 | 150503 | 1 | ||
| CD45RA | PE-Cy7 | L48 | 1 | ||
| TCRab | BV786 | T10B9.1A-31 | 1 | ||
| TCRgd | BV650 | В1 | 5 | ||
| АКТИВАЦИЯ КОКТЕЙЛЬ-1 | TEST1 | HLA-DR | BV421 | G46-6 | 5 |
| CD278 (ИКОС) | ЧП | DX29 | 5 | ||
| CD38 | APC | HB7 | 1 | ||
| АКТИВАЦИЯ КОКТЕЙЛЬ-2 | TEST2 | CD279 (PD1) | BV421 | EH12.1 | 2.5 |
| CD357 (GITR) | ЧП | eBioAITR | 5 | ||
| CD137 (41BB) | APC | 4B4-1 | 10 | ||
| АКТИВАЦИЯ КОКТЕЙЛЬ-3 | TEST3 | CD69 | BV421 | FN50 | 1 |
| CD314 (NKG2D) | ЧП | 1D11 | 2 | ||
| CD134 (OX40) | APC | ACT35 | 5 |
Таблица 1. Список антитело для модифицированного панели Т-клеток.
| AB | До нашей эры |
| CD45_FITC | 0163562388 |
| CD3_Alexa700 | 0163562110 |
| CD4_PerCP_CY5.5 | 0163562364 |
| CD8_APC-H7 | 0163562363 |
| CCR7_PE-CF594 | 0163562387 |
| CD45RA_PE-Cy7 | 0163562091 |
| TCRab_BV786 | 0163562069 |
| TCRgd_BV650 | 0163562108 |
| A_HLA-DR_BV421 | 0163562339 |
| A_CD278 (ИКОС) _PE | 0163562082 |
| A_CD38_APC | 0163562317 |
| A_CD279 (PD1) _BV421 | 0163562340 |
| A_CD357 (GITR) _PE | 0163562093 |
| A_CD137 (41BB) _APC | 0163562315 |
| A_CD69_BV421 | 0163562341 |
| A_CD314 (NKG2D) _PE | 0163562314 |
| A_CD134 (OX40) _APC | 0163562316 |
Таблица 2. Имена антител с номерами 2D штрих-кодов.
| ГРУППА | WELL_BASE | AB_NAME | VOL |
| TCELL | 1 | CD8_APC-H7 | 7.2 |
| TCELL | 1 | CD45_FITC | 7.2 |
| TCELL | 1 | CD3_Alexa700 | 18 |
| TCELL | 1 | CCR7_PE-CF594 | 18 |
| TCELL | 1 | CD45RA_PE-Cy7 | 18 |
| TCELL | 1 | TCRab_BV786 | 18 |
Таблица 3. Файл "BASE_CT_P50": имена антител и объем информации.
| ГРУППА | WELL_BASE | AB_NAME | VOL |
| TCELL | 1 | CD4_PerCP_CY5.5 | 36 |
| TCELL | 1 | TCRgd_BV650 | 90 |
Таблица 4. Файл "BASE_CT_P200": имена антител и объем информации.
| ГРУППА | WELL_ACT | AB_NAME | VOL |
| TEST1 | 7 | A_HLA-DR_BV421 | 30 |
| TEST1 | 7 | A_CD278 (ИКОС) _PE | 30 |
| TEST1 | 7 | A_CD38_APC | 6 |
| TEST2 | 13 | A_CD279 (PD1) _BV421 | 15 |
| TEST2 | 13 | A_CD357 (GITR) _PE | 30 |
| TEST3 | 19 | A_CD314 (NKG2D) _PE | 12 |
| TEST3 | 19 | A_CD69_BV421 | 6 |
| TEST3 | 19 | A_CD134 (OX40) _APC | 30 |
Таблица 5. Файл "ACT_ CT_P50": имена антител и объем информации.
| ГРУППА | WELL_ACT | AB_NAME | VOL |
| TEST2 | 13 | A_CD137 (41BB) _APC | 60 |
Таблица 6. Файл "ACT_CT _P200": имена антител и объем информации.
| ДОНОРСКАЯ # | SRC_ БАЗА | БАЗА КОКТЕЙЛЬ | ЧТО Ж_ БАЗА | VOL_ БАЗА | SRC_ACT | активи вации КОКТЕЙЛЬ | ЧТО Ж_ ACT | VOL_ACT | DEST_MACT | ЧТО Ж_ ТМДОВ | |
| HD001 | BASE_CT | TCELL | 1 | 36,8 | ACT_CT | FM3 | 1 | 25 | SPL_TUBES_1 | 1 | |
| HD001 | BASE_CT | TCELL | 1 | 36,8 | ACT_CT | TEST1 | 7 | 36 | SPL_TUBES_1 | 7 | |
| HD001 | BASE_CT | TCELL | 1 | 36,8 | ACT_CT | TEST2 | 13 | 42,5 | SPL_TUBES_1 | 13 | |
| HD001 | BASE_CT | TCELL | 1 | 36,8 | ACT_CT | TEST3 | 19 | 33 | SPL_TUBES_1 | 19 | |
| HD002 | BASE_CT | TCELL | 1 | 36,8 | ACT_CT | FM3 | 1 | 25 | SPL_TUBES_1 | 2 | |
| HD002 | BASE_CT | TCELL | 1 | 36,8 | ACT_CT | TEST1 | 7 | 36 | SPL_TUBES_1 | 8 | |
| HD002 | BASE_CT | TCELL | 1 | 36,8 | ACT_CT | TEST2 | 13 | 42,5 | SPL_TUBES_1 | 14 | |
| HD002 | BASE_CT | TCELL | 1 | 36,8 | ACT_CT | TEST3 | 19 | 33 | SPL_TUBES_1 | 20 | |
| HD003 | BASE_CT | TCELL | 1 | 36,8 | ACT_CT | FM3 | 1 | 25 | SPL_TUBES_1 | 3 | |
| HD003 | BASE_CT | TCELL | 1 | 36,8 | ACT_CT | TEST1 | 7 | 36 | SPL_TUBES_1 | 9 | |
| HD003 | BASE_CT | TCELL | 1 | 36,8 | ACT_CT | TEST2 | 13 | 42,5 | SPL_TUBES_1 | 15 | |
| HD003 | BASE_CT | TCELL | 1 | 36,8 | ACT_CT | TEST3 | 19 | 33 | SPL_TUBES_1 | 21 | |
| HD004 | BASE_CT | TCELL | 1 | 36,8 | ACT_CT | FM3 | 1 | 25 | SPL_TUBES_1 | 4 | |
| HD004 | BASE_CT | TCELL | 1 | 36,8 | ACT_CT | TEST1 | 7 | 36 | SPL_TUBES_1 | 10 | |
| HD004 | BASE_CT | TCELL | 1 | 36,8 | ACT_CT | TEST2 | 13 | 42,5 | SPL_TUBES_1 | 16 | |
| HD004 | BASE_CT | TCELL | 1 | 36,8 | ACT_CT | TEST3 | 19 | 33 | SPL_TUBES_1 | 22 | |
Таблица 7. Файл "AB_MACT": Источник и информацию об адресе назначения для "Мастер антител коктейль".
| Население # на рис. 1 | я | II | III | IV | v | |
| название Население | CD3 + | AB Т-клетки | GD Т-клетки | CD3 + CD4 + | CD3 + CD8 + | |
| % Лимфоцитов | Heathly донор # 1 | 79.80 | 75.20 | 2.70 | 49.60 | 22.30 |
| Heathly донор # 2 | 69.40 | 61.90 | 5,85 | 44.40 | 16.20 | |
| Heathly донор # 3 | 75.80 | 69.60 | 4,75 | 42.00 | 23.50 | |
| Heathly донор # 4 | 77.20 | 73.50 | 1.98 | 52.70 | 18.90 | |
| %РЕЗЮМЕ | Heathly донор # 1 | 1,42 | 1.58 | 3.70 | 2.50 | 1,56 |
| Heathly донор # 2 | 2.48 | 2.39 | 5,74 | 2,82 | 2.41 | |
| Heathly донор # 3 | 1.15 | 1.40 | 6.32 | 1,42 | 2,72 | |
| Heathly донор # 4 | 0.81 | 0,94 | 5,45 | 1.20 | 1,44 | |
| В среднем | 1,47 | 1.58 | 5.30 | 1.99 | 2.03 | |
| Стандартное отклонение | 0,72 | 0.61 | 1.13 | 0,79 | 0.63 |
Таблица 8. Данные Сырье для% лимфоцитов и% CV для каждого подмножества нанесенными на рисунке 4. Обратите внимание, что данные для испытаний 2 и 3 не показаны на рисунке 5 и в таблице 8, чтобы упростить представление данных.
Обсуждение
Иммунофенотипирование периферической крови является критически важным для получения понимание индивидуальных ответов на иммунотерапию. Задача заключается в стандартизации анализа для управления экспериментом к эксперименту изменчивости 1,14. Один главный источник изменчивости лежит в человеческом манипуляции образцов. Поэтому, можно предположить, что частичное или полное автоматизация обработки образцов будет способствовать резкое сокращение эксперимент-к-эксперимента изменчивости 1,14. В этом протоколе, мы сообщаем наше успешное усилия, чтобы минимизировать изменчивость анализа путем введения автоматизированной жидкого обработчик оснащенный 2D штрих-код читателя для образца окрашивания всей иммунофенотипирования крови.
В дизайне, наш метод является универсальным и может контролировать другие иммунные подмножества путем добавления дополнительных "база Коктейли", чтобы определить их. Такие подмножества включают Т-хелперы, Т регуляторные клетки, В-лимфоциты, NK-клетки, дендритные клетки, моноциты и (рукопись вПодготовка) 18. Мы адаптировали рекомендованные антител панелей консорциума путем введения дополнительных маркеров 1. клеточных популяций были определены с использованием "Base коктейль" конъюгированный с флюорохромами с минимальным излучением в блестящей фиолетовой 421 (BV421), фикоэритрин (PE), и аллофикоцианин (АРС) детекторы, как мы хотели, чтобы зарезервировать эти каналы для обнаружения индуцируемых антигенами. Эта функция не только обеспечивает высокую чувствительность для контроля состояния активации иммунных клеток, но также позволяет гибко размещение новых маркеров активации, как эти три флуорохромы наиболее часто сопряженную с антителами против индуцируемых маркеров. Поэтому наш метод подходит не только для приготовления коктейлей для всей иммунофенотипирования крови, но также полезно для окрашивания других образцов, включая одноядерных клеток периферической крови и клеток, выделенных из тканей с разбивкой (например, опухоль).
Успешное вступлениеводство нашего метода требует особого внимания к шагов в подготовке лабораторного оборудования и программирования и выполнение метода. Получение штрих-кодов трубок 2D включает маркировку с человеческими считываемые этикетки и передачи антител назначенным трубок. Чтобы предотвратить введение ошибок, мы рекомендуем делать это с двумя людьми. Всякий раз, когда меняется таблицы, следователи должны проверить работает ли метод правильно. Выбор соответствующих методов пипетки во программирования обеспечивает успешную передачу жидкости. LLS позволяет пипетирования без получения осажденного мусора со дна пробирки антител, для которых мы используем либо P50 или P200 проводящие советы. LLS не может быть хорошим выбором для P1000 советы, как LLS является более чувствительным с P1000 советы, а иногда ложно вызваны наличием пузырьков. Высоты в определении лабораторное должны быть скорректированы для каждого инструмента может произойти, как оптимальным перемещение жидкости, например, если нет достаточно места между краем советыа в нижней части труб. Как показано на рисунке 12, если "Базовый Коктейль" и / или "Активация Коктейль" не хорошо встряхивают, это может привести к нерациональному окрашивания.
Мы думали об использовании лиофилизированных реагенты для окрашивания клеток в качестве альтернативного подхода для снижения изменчивости, связанной с реагентом дозирования 19. Однако полимерные конъюгаты блестящих фиолетовых красителей известны взаимодействуют друг с другом, вызывающих неспецифические сигналов. Таким образом, при добавлении более двух полимерные конъюгаты (например, BV421 и BV650 и т.д.) в лиофилизированной реагентов могут привести к неспецифической сигнализации (например, увеличение BV650 фонового сигнала в BV421 + населения) 20. Кроме того, лиофилизированные реагенты не хватает гибкости для включения новых пятен. Они обычно более дорогие и требуют оптовый заказ. По этим причинам, мы решили использовать автоматизированную жидкого обработчик оснащенный штрих-кодов труб 2D. Хотя тAKES время настроить и влечет за собой первоначальные вложения для приобретения инструмента, в долгосрочной перспективе такие факторы будут компенсированы за счет увеличения производительности и воспроизводимости анализов. На самом деле, несколько групп ранее сообщалось успешной интеграции автоматизированной обработчика жидкого в их рабочий процесс иммунофенотипирования или аналогичных приложений 21,22. Автоматизированные решения для анализа потока цитометрии также доступны из коммерческих источников (FACS SPA III, Автоматизированная Коктейль Подготовка станции, а FlowStainer). Это дополнительно указывает есть большая потребность в автоматизированной приготовления коктейлей для иммунофенотипирования.
После освоения этой техники, мы предполагаем, что развитие полностью автоматизированной иммунофенотипирования цельной крови будет способствовать дальнейшему снижению эксперимент-к-эксперимента изменчивость и может сделать весь иммунофенотипирования крови осуществимо даже в заходящего 23 многоцентрового клинического исследования. Мы уже начали с помощью растворяющих былч помощник автоматизировать лизису и стиральные шаги. Мы также предусматривают, что автоматизированное определение объема антитела в 2D трубок штрихкода и отслеживание выдачи реагента позволит значительно улучшить инвентаризацию антител и контроль качества нашего метода, соответственно.
Раскрытие информации
Ю.К., ILG, TLM, WLM, DPH и KSB: Нет конкурирующие между собой финансовые интересы. АНТ является сотрудником Beckman Coulter, Inc. Публикация этой статьи видео спонсируется Beckman Coulter, Inc.
Благодарности
Мы благодарим Ханну Пузас за помощь в проектировании и настройке системы, а также Кевина Ховананта за технические советы. Финансирование этой работы было предоставлено Фондом Херста и Медицинским фондом Провиденса Портленда.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| BD LSRFortessa | BD Biosciences | Проточный цитометр | |
| NXp Span-8 Автоматизированная лабораторная станция | Рабочая станция лабораторной автоматизации Beckman Coulter | A31839 | |
| Вкладыш, Пробирка, 11 мм, Белый, для пробирок для микрофуги 1,5 мл (футляр из 25 штук) | Beckman Coulter | 373696 | Аксессуар для 24-позиционного штатива для пробирок для микрофуг. |
| Комплект LLS | Beckman Coulter | 719262 | Прикрепите нижнюю часть деки на рабочей станции автоматизации лаборатории для измерения уровня жидкости |
| 24-позиционный штатив для пробирок | Beckman Coulter | 373661 | Штатив для пробирок для микрофуг для коктейлей антител или крови |
| БИООПАСНЫЕ АВТОКЛАВНЫЕ ПАКЕТЫ 12 x 24 дюйма RED | LabMart | M111416 | Одноразовые автоклавные пакеты для рабочей станции |
| автоматизации лабораторииVisionMate Высокоскоростной 2D считыватель штрих-кодов | Thermo Scientific | AB-1850 | 2D считыватель штрих-кодов |
| 8-канальный портативный винтовой колпачк Укупорка/декаппер | Thermo Scientific | 4105MAT | Для снятия крышки и укупорки 2D трубки со штрих-кодом |
| Микроцентрифужные пробирки | Fisher Scientific | 02-681-335 | Для приготовления коктейля или подачи образца крови на автоматизированную лабораторную станцию |
| CoolRack XT CFT24 | биоцизия | BCS-534 | Для хранения образцов пробирок. |
| 1,0 мл Matrix ScrewTop Янтарные пробирки в штатиках с защелками | Thermo Scientific | 3741AMB | 2D пробирки со штрих-кодом для хранения флуоресцентных сопряженных антител |
| Biomek Span-8 P1000 Tips, проводящие, предварительно стерильные с барьером, 1,025 &; l | Beckman Coulter | 987925 | Советы по автоматизации лабораторных рабочих станций |
| Наконечники Biomek Span-8 P50, проводящие, предварительно стерильные с барьером, 50 & микро; l (Кейс из 10 штативов) | Beckman Coulter | B01091 | Советы по автоматизации лабораторных рабочих станций |
| Наконечники Biomek Span-8 P250, проводящие, предварительно стерильные с барьером (кейс из 10 штативов) | Beckman Coulter | 394627 | советы для автоматизированных рабочих станций лабораторий |
| BD FACS Лизирующий раствор 10x Концентрат | BD Biosciences | 349202 | лизиса эритроцитов |
| Falcon Круглодонные полистирольные пробирки | Fisher Scientific | 14-959-5 | Пробирки |
| для образцов Anti-CD45 FITC | BD Biosciences | 347463 | Эффекторная Т-клеточная панель (основание) |
| Anti-CD3 Alexa Fluor 700 | eBioscience | 56-0038-42 | Эффекторная Т-клеточная панель (основание) |
| Anti-CD4 PerCPCy5.5 | BD Biosciences | 341654 | Эффекторная Т-клеточная панель (основание) |
| Anti-TCRgd BV650 | BD Biosciences | 564156 | Эффекторная Т-клеточная панель (основание) |
| Anti-TCRab BV786 | BD Biosciences | 563825 | Эффекторная Т-клеточная панель (основание) |
| Anti-CD8 APC-H7 | BD Biosciences | 560179 | Эффекторная Т-клеточная панель (основание) |
| Anti-CCR7 PE-CF594 | BD Biosciences | 562381 | Эффекторная Т-клеточная панель (основание) |
| Anti-CD45RA PE-Cy7 | BD Biosciences | 337167 | Эффекторная Т-клеточная панель (основание) |
| Anti-HLA-DR BV421 | BD Biosciences | 562804 | Эффекторная Т-клеточная панель (активация) |
| Anti-CD278(ICOS) PE | BD Biosciences | 557802 | Эффекторная Т-клеточная панель (активация) |
| Anti-CD38 APC | BD Biosciences | 340439 | Эффекторная Т-клеточная панель (активация) |
| Anti-CD279(PD1) BV421 | BD Biosciences | 562516 | Эффекторная Т-клеточная панель (активация) |
| Anti-CD357(GITR) PE | eBioscience | 12-5875-42 | Эффекторная Т-клеточная панель (активация) |
| Anti-CD137(41BB) APC | BD Biosciences | 550890 | Эффекторная Т-клеточная панель (активация) |
| Anti-CD69 BV421 | BD Biosciences | 562884 | Эффекторная Т-клеточная панель (активация) |
| Anti-CD314(NKG2D) PE | BD Biosciences | 557940 | Эффекторная Т-клеточная панель (активация) |
| Анти-CD134(OX40) APC | BioLegend | 350008 | Эффекторная Т-клеточная панель (активация) |
| BD Пластиковые пробирки для сбора крови с гепарином натрия: обычная пробка | Fisher Scientific | 02-689-6 | Для сбора крови |
| Альбумин, бычья сыворотка, фракция V, RIA и ИФА Grade | EMD Millipore | 126593 | Для промывки в тренировочном слое Azide |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S8032 | Для промывочного буфера |
| Гепарин, натриевая соль | Affimetrix | 16920 | Для промывочного буфера |
| Hank' s Сбалансированный солевой раствор (HBSS), 1x, с кальцием, магнием, без фенола Red | GE Healthcare Life Sciences | SH30588.02 | Для буфера промывки потоком |
Ссылки
- Maecker, H. T., McCoy, J. P., Nussenblatt, R. Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project. Nat. Rev. Immunol. 12 (3), 191-200 (2012).
- Craig, F. E., Foon, K. A. Flow cytometric immunophenotyping for hematologic neoplasms. Blood. 111 (8), 3941-3967 (2008).
- Johansson, U., Bloxham, D., et al. Guidelines on the use of multicolour flow cytometry in the diagnosis of haematological neoplasms. Br. J. Haematol. 165 (4), 455-488 (2014).
- Schnizlein-Bick, C. T., Spritzler, J., et al. Evaluation of TruCount Absolute-Count Tubes for Determining CD4 and CD8 Cell Numbers in Human Immunodeficiency Virus-Positive Adults. Clin. Vaccine Immunol. 7 (3), 336-343 (2000).
- Cossarizza, A., De Biasi, S., et al. Cytometry, immunology, and HIV infection: Three decades of strong interactions. Cytometry A. 83 (8), 680-691 (2013).
- Hensley, T. R., Easter, A. B., et al. Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay. J. Vis. Exp. (67), e4302(2012).
- Streitz, M., Miloud, T., et al. Standardization of whole blood immune phenotype monitoring for clinical trials: panels and methods from the ONE study. Transplant. Res. 2 (1), 17(2013).
- Hensley-McBain, T., Heit, A., De Rosa, S. C., McElrath, M. J., Andersen-Nissen, E. Optimization of a whole blood phenotyping assay for enumeration of peripheral blood leukocyte populations in multicenter clinical trials. J. Immunol. Methods. 411, 23-36 (2014).
- Green, C. L., Brown, L., Stewart, J. J., Xu, Y., Litwin, V., Closkey, T. W. M. Recommendations for the validation of flow cytometric testing during drug development: I instrumentation. J. Immunol. Methods. 363 (2), 104-119 (2011).
- O'Hara, D. M., Xu, Y., Liang, Z., Reddy, M. P., Wu, D. Y., Litwin, V. Recommendations for the validation of flow cytometric testing during drug development: II assays. J. Immunol. Methods. 363 (2), 120-134 (2011).
- Owens, M. A., Vall, H. G., Hurley, A. A., Wormsley, S. B. Validation and quality control of immunophenotyping in clinical flow cytometry. J. Immunol. Methods. 243 (1-2), 33-50 (2000).
- Kalina, T., Flores-Montero, J., et al. EuroFlow standardization of flow cytometer instrument settings and immunophenotyping protocols. Leukemia. 26 (9), 1986-2010 (2012).
- Calvelli, T., Denny, T. N., Paxton, H., Gelman, R., Kagan, J. Guideline for flow cytometric immunophenotyping: a report from the National Institute of Allergy and Infectious Diseases, Division of AIDS. Cytometry A. 14 (7), 702-715 (1993).
- Biancotto, A., McCoy, J. P. Studying the human immunome: the complexity of comprehensive leukocyte immunophenotyping. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 377, 23-60 (2014).
- Perfetto, S. P., Ambrozak, D., Nguyen, R., Chattopadhyay, P., Roederer, M. Quality assurance for polychromatic flow cytometry. Nat. Protoc. 1 (3), 1522-1530 (2006).
- Yong, P. F. K., Salzer, U., Grimbacher, B. The role of costimulation in antibody deficiencies: ICOS and common variable immunodeficiency. Immunol. Rev. 229 (1), 101-113 (2009).
- Donnenberg, A. D., Donnenberg, V. S. Rare-Event Analysis in Flow Cytometry. Clin. Lab. Med. 27 (3), 627-652 (2007).
- Biancotto, A., Fuchs, J. C., Williams, A., Dagur, P. K., McCoy, J. P. High dimensional flow cytometry for comprehensive leukocyte immunophenotyping (CLIP) in translational research. J. Immunol. Methods. 363 (2), 245-261 (2011).
- Villanova, F., Di Meglio, P., et al. Integration of Lyoplate Based Flow Cytometry and Computational Analysis for Standardized Immunological Biomarker Discovery. PloS One. 8 (7), e65485(2013).
- BD biosciences. Optimizing Experiments Using BD Horizon Brilliant Polymer Conjugates. , (2014).
- Malergue, F., van Agthoven, A., Scifo, C., Egan, D., Strous, G. J. Automation of a Phospho-STAT5 Staining Procedure for Flow Cytometry for Application in Drug Discovery. J. Biomol. Screen. 20 (3), 416-421 (2015).
- Hasan, M., Beitz, B., et al. Semi-automated and standardized cytometric procedures for multi-panel and multi-parametric wholeblood immunophenotyping. Clin. Immunol. 157 (2), 261-276 (2015).
- Maecker, H. T., McCoy, J. P., et al. A model for harmonizing flow cytometry in clinical trials. Nat. immunol. 11 (11), 975-978 (2010).
Перепечатки и разрешения
