Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Верхушечный резекция мыши моделью для изучения раннего млекопитающих сердце Регенерация

11.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/53488

⸱

23 января 2016 г.

 , 
1Center for Molecular Medicine, National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health, 2State Key Laboratory for Agrobiotechnology, College of Biological Science, China Agricultural University

В этой статье

Краткое содержание

В этом исследовании демонстрируется пошаговый видеопротокол апикальной резекции. Апикальная резекция является недавно выделенным хирургическим подходом в исследованиях регенерации сердца млекопитающих. Это исследование может способствовать применению апикальной резекции в качестве стандартной методологии в исследовании механизма, лежащего в основе регенерации сердца.

Аннотация

Сердечно-сосудистые заболевания язвы весь мир из-за интенсивных изменений образа жизни. Регенерации сердца имеет большие перспективы для ремонта и восстановления кардиомиоцитов, утраченных в результате травм и болезней. В отличие от прочной сердечной регенерации некоторых низших позвоночных, млекопитающих взрослые сердца обычно показывают минимальное способность к регенерации и ремонта сердца. Тем не менее, недавние исследования вызвали значительный научный интерес с выводом, что, между послеродовой день с 1 по 7 (P1 Р7), неонатальный сердце мыши сохраняет значительную регенеративный потенциал после апикальной резекции (т.е. хирургического ампутации и воздействия левого желудочка вершине). Одним из основных противоречия по этому нахождения может быть связано с разнообразными процедурами хирургии, связанных используемых в усилиях по распространению или расширения на этом важном открытии. Эти инструкции динамически представить материалы и методологии для апикальной резекции в модели мыши. Характерные шаги этого грызуна SURVIVAл хирургии включают гипотермию анестезии, торакотомия, хирургическое ампутации сердце желудочка вершине, и шов и восстановление мышей. Описанный подход может расширить применение апикальной резекции мышиной модели сердечно-сосудистой исследований.

Введение

Увеличение продолжительности жизни человека приводит к различным заболеваниям, связанным со старением и образом жизни, включая сердечную недостаточность, которая является основной причиной смертности. Однако без замены утраченных или дисфункциональных клеток сердечной мышцы современные методы лечения могут лишь временно улучшить сердечную функцию1, 2. Таким образом, необходимо открывать и разрабатывать инновационные стратегии регенерации и восстановления сердца. Сердце взрослого млекопитающего имеет ограниченный регенеративный потенциал. Исследования низших позвоночных, таких как амфибии уродели и костистые рыбы, позволили получить беспрецедентное представление о молекулярных и клеточных механизмах, лежащих в основе регенерации сердца3, 4. Недавно была разработана неонатальная мышиная модель регенерации сердца, которая может позволить идентифицировать и охарактеризовать более эволюционно консервативные патофизиологические события, необходимые для регенерации сердца человека.

Апикальная резекция относится к хирургическому удалению верхушки левого желудочка. Эта процедура ограничена мышами в возрасте от 1 до 7 дней (от P1 до P7) из-за ее высокой летальности у старых мышей6. Ожидается, что процесс регенерации сердца у неонатальных мышей после апикальной резекции будет следующим: (I) быстрое и эффективное образование гематомы для герметизации верхушки и предотвращения обескровливания; (II) регенерация кардиомиоцитов и восстановление систолической функции5, 7. Недавняя работа вызвала дискуссию о значении и эффективности этой модели8-11. Таким образом, важно четко и подробно представить апикальную резекцию. С этой целью в данном протоколе ярко и конкретно описано видео о том, как я делал апикальную резекцию на основе предыдущего протокола6.

Понимание молекулярных механизмов, лежащих в основе регенерации сердца, имеет важное значение для лечения сердечных заболеваний, характеризующихся потерей и/или повреждением кардиомиоцитов, таких как сердечная недостаточность1, 2. Учитывая текущий и многообещающий прогресс апикальной резекции в исследованиях регенерации сердца, это исследование может способствовать использованию этого метода и его использованию в исследованиях регенерации сердца.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все эксперименты мыши были утверждены уходу и использованию животных в программе Национального института здравоохранения (NIH) с номером протокола H0083R3. NHLBI IACUC утвердил протокол без анальгетиков.

1. Гипотермия Анестезия в неонатологии мышей

  1. Стерилизовать губки и хирургическое оборудование в автоклаве до операции. Подготовьте все хирургические материалы и включите горячий шарик в стерилизатора 15-20 мин заранее достигать 240 ° C до 270 ° C.
  2. Перенесите все C57BL / 6 щенков (возраст P1) от их кормящей матери к чистой клетке мыши свежим постельным бельем и гнездования материалов. После того, как щенки взяты в комнату хирургии, выполните операцию апикального оперативно сводить к минимуму их время, проведенное отделен от матери и снижения риска материнской раскулачивание.
  3. Положите губки на кровати льда, а затем поместить один щенок на губку для ~ 3 мин до достижения гипотермии анестезии. Подтвердите анестезии, наблюдая APнеа и акинезия и щипать заднюю ножку. Проверьте состояние новорожденных часто, потому что слишком мало времени, не сделает щенка акинетичных и апноэ, и чрезмерная продолжительность анестезии может снизить выживаемость 12.

2. Торакотомия

  1. Перевести щенка с кровати льда на хирургической области настольной и использовать ленту для фиксации его руки, ноги, хвост и в положении лежа на спине.
  2. Лечить грудь с помощью бетадин и осторожно очистите ее с помощью 70% спирта подготовительную площадку.
  3. Сделайте поперечный разрез кожи вдоль межреберных вперед области грудной полости с использованием Vännäs весна ножницами, а затем притупить рассекать вперед межреберных мышц, чтобы облегчить доступ к сердцу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выживаемость улучшится, когда кровопотеря сводится к минимуму во время хирургической процесса.

3. Хирургическое Ампутация сердца желудочка Apex

  1. По стороны, осторожно применять давление на живот, чтобы экстериоризоватьсяверхушке сердца. Поглощенный кровь вокруг хирургической области с стерильных хлопка наконечником аппликаторы-за четкой визуализации. Для ложнооперированных новорожденных управления, перейдите к шагу 4 (Шов и восстановление мышей).
  2. Под увеличительным лампы и с помощью ножниц иридектомия, мягко выполнить по частям резекция левого желудочка (ЛЖ), пока камера Л.В. подвергается. Будьте осторожны, чтобы свести к минимуму Резецированная части ЛЖ. Примерно 15% резекции необходимо для достижения оптимальной экспозиции камеры ЛЖ.
  3. Убедитесь, что сердце возвращается к грудной полости, как только камера Л.В. подвергается.

4. Шов и восстановление мышей

  1. Шовный ребра и мышцы вместе, чтобы запечатать грудной полости с использованием стерильных шовных материалов Proline 6-0, а затем тщательно закрыть разрез кожи сайт с помощью клея кожи.
  2. Теплый новорожденного под лампой тепло для ~ 3 мин для восстановления, а затем очистите кровь и следы клея, используя 70% спирта подготовительную площадку BefoRe повторного ее к своим помета. Попробуйте завершить всю хирургическую процедуру в течение 10 мин, потому что минимизировать время, затрачиваемое отделен от матери повышает выживаемость детенышей после апикальной резекции.
  3. После каждого хирургического вмешательства, место хирургические инструменты в контакте с капельками горячего шарика стерилизатор в течение приблизительно 20 сек для полной стерилизации. Разрешить хирургические инструменты, чтобы охладить до комнатной температуры перед каждым хирургии.
  4. После завершения операции для всех щенков в помете, смешать с постельными принадлежностями щенков и экскрементов матери перед их возвращением гнездо матери.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, ИРС / CD-1 мышей лучше приемные матери, чем C57BL / 6, но даже среди кормящих матерей той же генетический фон, поощряющих инстинкты меняться. Если изменения кормящей матери необходимо уменьшить смертность матерей раскулачивание, удалить P0 щенков для кормящей матери, а затем выполнить резекцию верхушечный в P1. Выполнять только либо имитации операции или верхушечного гesection в одном помете щенков, потому что смешивание обман и хирургические щенки могут уменьшить выживаемость в группе хирургического щенков 6.

5. Послеоперационный анализ

  1. Один день после операции, контролировать щенков, убедитесь, что нет никакой разницы между обманом и хирургических групп, и подсчитать количество щенков, чтобы измерить уровень выживания. Если операции выполняются должным образом, выживаемость должна быть похожа и больше, чем 60% в обоих обман и хирургических групп.
  2. Изоляция Сердце и фиксация.
    1. Усыпить щенков в дни 1 и 2 после операции через обезглавливание день 21 после операции по CO2 с уверенностью смерти путем смещения шейных позвонков, затем очистите сундук с использованием 70% спирта преп.
    2. Надрезать кожу и мышцы средней линии грудной клетки, а затем открыть сундук.
    3. Вырезания целые сердца из грудной полости и зафиксировать все сердце каждого образца в 5 мл 4% параформальдегида O / N при комнатной температуре.
  3. На следующий день, передача образцы 70% этанола. Образцы могут храниться до одного недели, прежде чем парафин.
  4. Разрез 5 мкм срезы толщиной парафиновые через весь желудочка и выполнить стандартную гематоксилином и эозином (H & E) и трехцветный окрашивания Массона, чтобы исследовать регенеративный ответ 5, 7. В частности, Н & Е пятно используется для проверки замену мышц и трехцветный краситель Массона используется изучить фиброзные ответов 5.
  5. Выберите область интересов и установить, по крайней мере три очаги на образец вручную с помощью слайд-сканера. Изображение и анализировать окрашивания слайдов на 40-кратном увеличении в соответствии с инструкциями изготовителя с параметрами по умолчанию.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Щенки мыши были подвергнуты эвтаназии 1, 2 и 21 дней после резекции верхушечного, и их сердца были собраны для H & E и трехцветный пятно Массона. Синий цвет в Trichrome пятно Массона указывает отложение эпикардиальной внеклеточного матрикса 5. С успешной апикальной резекции, сгусток крови эффективно формируется для герметизации LV один день после резекции верхушечного, как показано на рисунке 1А. Постепенное рассасывание тромба и в начале сердечного фиброза наблюдается и ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Регенерация сердца показывает потенциал для лечения и профилактики сердечной недостаточности1, 2. Животные модели незаменимы и играют решающую роль в понимании того, как происходит регенерация сердца3-6. Многие амфибии и рыбы регенерируют сердечную ткань в ответ на травму, что дает представление о нашем понимании сердечно-сосудистых заболеваний человека13, 14. С точки зрения эволюции, однако, патофизиология должна быть более консервативной между мышиной моделью и человеком. Регенерация се...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Публикация сборы для этой статьи были авторами в дар от изящных Инструменты науки доктору Цзянь Хоу.

Благодарности

Авторы выражают благодарность д-ра. Джеймс Хокинс, Зу-Си Юй и Хуан Цюй из Национального сердца, легких и крови институт (NHLBI) за помощь в операции мыши и подготовки и окрашивания парафиновых срезов. Авторы благодарны NIH Fellows редколлегии за помощь в редактировании.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Иглодержатели Olsen-Hegar с ножницами, 1,5 ммИнструменты для тонкой науки12002-12
Весенние ножницы Vannas - 2 мм Режущая кромкаИнструменты для науки15000-03Ножницы для иридэктомии
Стерилизатор горячих шариковИнструменты для тонкой науки18000-45
Щипцы для радужной оболочки, прямые, зубчатыеинструменты для тонкой науки11064-07
Щипцы для ириса, изогнутые, зубчатыеинструменты для тонкой науки11065-07
ножницы ши - изогнутые / тупо-тупые / 12 сминструменты для тонкой науки14105-12
щипцы для завязывания швов с круглой ручкой, прямыеинструменты для тонкой науки18025-12
пружинные ножницы vannasa с круглой ручкойдля тонкой науки15400-12
тонкое гемостатинструменты для тонкой науки13007-12
Лампа лупыLuxolamp CorpIM120 
Нагревательная лампаBrandt Equipment LLC51152/3
6-0 Проленовые нитиEthicon8889H
Клей для кожи-Vetbond Tissue Adhesive 3М 1469
Стерильные аппликаторы с хлопковыми наконечникамиDynarex4305
WEBCOL Спиртовая салфеткаCovidien6818Medium 2 PLY, 200 / BOX, пропитанная 70% изопропиловым спиртом
Curity Универсальные губкиCovidien9024Нетканый материал 4 СЛОЯ, 4 "x4" (10,2 см & раз; 10,2 см)
Защитный лист для столешницыKIMTECH SCIENCE754618" x 19,5" (45,72 см x 49,53 см) x 50
0,9% хлорида натрия, 250 млHospira Inc.NDC 0409-6138-22
Тампон с раствором бетадинаPurdue Products L.P.NDC 67618-153-03
АвтоклавTOMY Digital BiologySX-700ПАРОВОЙ СТЕРИЛИЗАТОР ВЫСОКОГО ДАВЛЕНИЯ
Слайдовый сканерHAMAMATSUNanoZoomer 2.0-RS
инструменты

Ссылки

  1. Lin, Z., Pu, W. T. Strategies for cardiac regeneration and repair. Sci Transl Med. 6, 231-239 (2014).
  2. Xin, M., Olson, E. N., Bassel-Duby, R. Mending broken hearts: cardiac development as a basis for adult heart regeneration and repair. Nat Rev Mol Cell Biol. 14, 529-541 (2013).
  3. Mahmoud, A. I., Porrello, E. R. Turning back the cardiac regenerative clock: lessons from the neonate. Trends Cardiovasc Med. 22, 128-133 (2012).
  4. Porrello, E. R., Olson, E. N. A neonatal blueprint for cardiac regeneration. Stem Cell Res. 13, 556-570 (2014).
  5. Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331, 1078-1080 (2011).
  6. Mahmoud, A. I., Porrello, E. R., Kimura, W., Olson, E. N., Sadek, H. A. Surgical models for cardiac regeneration in neonatal mice. Nat Protoc. 9, 305-311 (2014).
  7. Allen, T. C. Armed Forces Institute of Pathology. Hematoxylin and eosin. Laboratory methods in Histotechnology. Prophet, E. B., Mills, B., Arrington, J. B., Sobin, L. H. , American Registry of Pathology. Washington DC. 53-58 (1992).
  8. Andersen, D. C., Ganesalingam, S., Jensen, C. H., Sheikh, S. P. Do neonatal mouse hearts regenerate following heart apex resection? Stem cell reports. 2, 406-413 (2014).
  9. Kotlikoff, M. I., Hesse, M., Fleischmann, B. K. Comment on 'Do neonatal mouse hearts regenerate following heart apex resection?'. Stem cell reports. 3, 2(2014).
  10. Sadek, H. A., et al. Multi-investigator letter on reproducibility of neonatal heart regeneration following apical resection. Stem cell reports. 3, 1(2014).
  11. Andersen, D. C., Jensen, C. H., Sheikh, S. P., et al. Response to Sadek et al. and Kotlikoff et al. Stem cell reports. 3, 3-4 (2014).
  12. Phifer, C. B., Terry, L. M. Use of hypothermia for general anesthesia in preweanling rodents. Physiol Behav. 38, 887-890 (1986).
  13. Laflamme, M. A., Murry, C. E. Regenerating the heart. Nat Biotechnol. 23, 845-856 (2005).
  14. Laflamme, M. A., Murry, C. E. Heart regeneration. Nature. , 326-335 (2011).
  15. Jesty, S. A., et al. c-kit+ precursors support postinfarction myogenesis in the neonatal, but not adult, heart. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 13380-13385 (2012).
  16. Gonzalez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish. Development. 138, 1663-1674 (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Верхушечный резекция мыши моделью для изучения раннего млекопитающих сердце Регенерация
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.