Методическая статья

Неонатальной спинного мозга мыши Сжатие Травма Модель

DOI:

10.3791/53498

⸱

27 марта 2016 г.

 ,  , 
1Department of Neurosurgery, Oslo University Hospital, 2Norwegian Center for Stem Cell Research, Oslo University Hospital, 3Laboratory of Neural Development and Optical Recording (NDEVOR), Department of Physiology, Institute of Basic Medical Sciences, University of Oslo

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой статье описывается метод создания воспроизводимой компрессионной травмы спинного мозга (ТСМ) у неонатальной мыши. Модель предоставляет благоприятную платформу для изучения механизмов адаптивной пластичности, лежащих в основе спонтанного функционального восстановления.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Травма спинного мозга (SCI), как правило, вызывает разрушительные неврологические дефициты, в частности, путем повреждения волокон, наследующих от головного мозга к спинному мозгу. Важным направлением тока исследований сосредоточено на механизмах адаптивной пластичности, лежащих в основе спонтанного или индуцированного функционального восстановления после SCI. Спонтанное функциональное восстановление, как сообщается, в жизни больше рано, поднимая интересные вопросы о том, как адаптивные изменения пластичности по мере развития спинного мозга. Для того, чтобы облегчить изучение этой динамики, мы разработали модель SCI в неонатальном мыши. Модель имеет отношение к детской ТСМ, который слишком мало изучен. Поскольку нейронная пластичность у взрослого человека включает в себя некоторые из тех же механизмов , как пластичности нейронов в раннем периоде жизни 1, эта модель может потенциально иметь некоторое отношение также и для взрослых ТСМ. Здесь мы опишем всю процедуру генерирования воспроизводимой компрессии спинного мозга (SCC) травмы в неонатальном мышиуже в послеродовом (Р) день 1. SCC достигается путем выполнения ламинэктомии на заданном уровне спинного (здесь описано на грудном уровнях 9-11), а затем с помощью модифицированного Yasargil аневризмы мини-клип, чтобы быстро сжимать и разжимать спинной мозг , Как было описано выше, раненых неонатального мышей могут быть проверены на поведенческих дефицитов или приносится в жертву экс естественных условиях физиологического анализа синаптической связи с использованием электрофизиологических и высокой пропускной способности методов оптической записи 1. Более ранние и продолжающиеся исследования с использованием поведенческие и физиологические оценки показали резкое, острое нарушение моторики задних конечностей с последующим полным функционального восстановления в течение 2 -х недель, и первое доказательство изменений функциональной схемы на уровне идентифицированных нисходящей синаптические связи 1.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В течение последнего десятилетия все больше доказательств, полученных из различных моделей травм спинного мозга (ТСМ), показали, что спинномозговые сети могут спонтанно реорганизовываться, способствуя функциональному восстановлению1-9. Как следствие, адаптивная пластичность стала важной темой в исследованиях ТСМ. Показано, что пластичность включает в себя отрастание сохраненных аксонов, прорастание новых коллатералей аксонов и формирование новых синаптических связей. Большая часть этих знаний была получена в результате поведенческих или анатомических исследований на взрослых животных. Важным ограничением исследований спинного мозга у взрослых является сложность проведения высокопроизводительной физиологической оценки, что легче при подготовке новорожденных1. Одно из основных отличий заключается в том, что цельные препараты ex vivo ствола головного мозга и спинного мозга взрослого человека имеют низкую жизнеспособность. Другая причина заключается в том, что спинномозговая ткань взрослого человека более непрозрачна для света, потому что она толще и миелинизирована. Несмотря на то, что последние достижения в области визуализации in vivo (см., например, 10-12) могут частично преодолеть эти проблемы, возможность выполнения высокопроизводительной визуализации на любой желаемой дорсовентральной глубине в нескольких участках вдоль данного препарата ствола головного мозга и спинного мозга в настоящее время возможна только у новорожденных. Незрелое состояние миелинизации аксонов в неонатальном спинном мозге способствует высокопроизводительной оптической записи ex vivo, что позволяет проводить динамическую оценку функциональных синаптических связей13-17. В сочетании с генетически кодируемыми кальциевыми репортерами и инструментами оптогенетической стимуляции и фармакологии, оптические подходы могут способствовать более глубокому пониманию механизмов, лежащих в основе адаптивной пластичности.

Подсчитано, что от 1 до 10% всех травм спинного мозга поражают младенцев и детей18-22 лет. В отличие от ТСМ у взрослых, патогенез и потенциал спонтанного выздоровления при детской ТСМ изучены меньше. Таким образом, использование неонатальной модели ТСМ может дать более полное представление о педиатрической ТСМ и способствовать лучшему пониманию патогенетических и восстановительных механизмов. Более того, считается, что пластичность после ТСМ, поддерживающая функциональное восстановление взрослого спинного мозга, включает, по крайней мере частично, те же механизмы, которые управляют развитием центральной нервной системы, такие как рост аксонов, ветвление и образование новых синапсов23-26. Таким образом, использование неонатальной модели ТСМ может дать важную информацию о механизмах, которые также действуют в спинном мозге взрослого человека или которые потенциально могут быть восстановлены во взрослом спинном мозге (например, путем имплантации фетальных клеток или ткани или ткани, созданной de novo из плюрипотентных стволовых клеток) для облегчения восстановления.

Таким образом, неонатальная мышь обеспечивает платформу для интегративного, мультиметодологического подхода к исследованию адаптивной пластичности после травмы спинного мозга, в котором может быть легко использована комбинация поведенческих, физиологических, анатомических, молекулярных и генетических методов. Создание стандартизированных моделей неонатальных травм является важным шагом в реализации таких исследований.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот экспериментальный протокол был одобрен Национальным исследовательским органом животных в Норвегии (Forsøksdyrutvalget, местное экспериментальное одобрение номер 12,4591) в соответствии с правилами Европейского союза по уходу за животными (Европейская лаборатория Федерация животных научная ассоциация). Были предприняты усилия, чтобы минимизировать количество используемых животных и их страдания. В этой статье процедура, используемая в послеродовом (Р) 1-й день дикого типа ICR (импринтинг область управления) мышей (Jackson, США) описан, но тот же самый подход может быть также использован на более поздних этапах.

1. Построение системы Анестезия газа для неонатальных мышей (Рисунок 1)

  1. Построить нос маску от кончика шприца. Подключите к 3-ходовой кран с пластиковыми трубами (Рисунок 1 - красная и насосно - компрессорных труб Рисунок 2A1).
  2. Просверлить маленькое отверстие в стороне маски носа и подключить к пластиковой трубке, чтобы удалить перетекание газа измаска. Конец трубки либо на вакуумном насосе , установленного для небольшого отрицательного давления, или в вытяжном шкафу (Рисунок 1 - ярко - зеленые трубки).
  3. Сделать анестезии камеры от 150 мм х 25 мм пластиковые чашки Петри (рис 2A2).
    1. С одной стороны, сделать отверстие достаточно большой, чтобы вместить голову мыши и маску носа.
    2. На противоположной стороне, сделайте два небольших отверстия , через которые пластиковые трубы и из маски носа могут быть вставлены (Рисунок 1 - красный и ярко - зеленые трубы, соответственно).
    3. Делают третье отверстие на верхней части крышки и прикрепить к этому третью пластиковую трубку , которая заканчивается на вакуумном насосе (рисунок 1 - темно - зеленые трубки). Цель этой третьей трубы, чтобы гарантировать, что любой избыток газа, который не был захвачен выходе из маски носа удаляется.
  4. Построить камеру сна, сделав отверстие в нижней части любого рода лаборатории блюдо, которое является достаточно большим, чтобы Сontain мыши и имеет гладкую и ровную кромку (открытие блюдо должно лежать на одном уровне с таблицей, чтобы предотвратить утечку газа). Подключите отверстие в камере до 3- х ходовой кран с пластиковыми трубами (Рисунок 1 - коричневый трубки). Поместите камеру сна под вытяжкой.
  5. Соединить 3-ходовой кран в выпускной трубе из испарителя (Рисунок 1 - желтый и насосно - компрессорных труб Рисунок 2A3).
  6. Подключите входной патрубок испарителя для подачи кислорода (рис 1 - синий трубки).

2. Модификация Yasargil Временное Аневризма Мини-клип для создания сжатия Tool (Рисунок 2 и таблица 1)

  1. Наложить зажим прочно к стойке с помощью зажима. Использование бинокулярной лупы для визуального контроля, спиливать внешнюю поверхность наконечника каждого клипа лопатки до окончательной толщины около 150 мкм с использованием точило , установленный на бур (рис 2B и C).
  2. Сделать пробку для клипа путем разрезания короткий отрезок полиэтилена капиллярной трубки (таблица 1) при помощи стереомикроскопа с использованием микро-нож (таблица 1), и поместите это на одной из лопастей (рис 2A4 и на рисунках 2В и С). Это предотвращает полное закрытие клипа и создает стандартные размеры сжатия. Когда клип закрыт расстояние interblade составляет около 230 мкм. Сделать новую пробку для каждого эксперимента в качестве материала полиэтилена может сжиматься во время использования, которое может привести к изменению interblade пространства.
    Примечание: натяжение пружины зажима уменьшается с течением времени таким образом, что после того, как около 80 сжатий клипа больше не полностью закрывает к пробке и должен быть заменен.

3. Подготовка перед хирургическим вмешательством

  1. Поместите мышь в камере сна (рисунок 1) и инициировать анестезии с 4% изофлуран (рис 2А5 ) Испаряют в чистом кислороде, используя испаритель (рис 2A3 и таблица 1).
  2. Испытание на снятие рефлекс мыши, осторожно щипать паутину кожи между пальцами с тонкими пластиковыми щипцами. Делайте это осторожно, как новорожденные мыши, легко травмируются. Защемление слишком жесткие результаты в непосредственной кровоподтеки. При выполнении этого теста в начале седативного запускает рефлекс и обеспечивает хорошую индикацию количества силы, необходимой.
  3. После того , как рефлекс отменяется, удалить мышь из камеры сна и поместить его в положении лежа на операционном столе с мордой , вставленной в маску носа , которая обеспечивает непрерывную подачу 4% изофлуран в смешанной среде чистого кислорода (рисунок 1). Убедитесь в том, что потепление накладка включается и устанавливается на 37-38 ° С, как переохлаждение во время операции может быть смертельным.
  4. Для того, чтобы достичь полной аналгезии, вводят подкожно 50 мкл местного анестетика Bupivacain (2,5 мг / мл, Рисунок 2A6) в месте операции (в экспериментах здесь, это на грудном уровне (Т) 9-T11). Используйте инсулиновый шприц (300 мкл, 30 г, рис 2A7 и таблица 1) , для выполнения инъекции.
  5. Снижение концентрации изофлуран доставляется к маске носа до 1-2%.

4. Спинной Ламинэктомия

  1. Выполните операцию под микроскопическим контролем.
  2. После очистки области хирургии с хлоргексидина глюконата (таблица 1 # 19) в течение по крайней мере 30 секунд, сделайте 1-2 мм поперечный разрез кожи на Т9-Т11 с использованием microknife (рис 2A8).
    Примечание: В ICR новорожденных мышей ростральной части желудка, видно , когда он содержит молоко, сталкивается позвоночные уровни T12-T13 (рисунок 3). Другой достопримечательностью города является ростральной часть грудной клетки подкожной жировой ткани агрегата, который заканчивается примерно T8-9. Этот ориентир виден только после разреза кожи.
  3. Используйте пинцет (Рисунок 2A9 и A10) , чтобы расширить отверстие кожи в поперечном направлении на 8-9 мм, потянув кожу осторожно ростральным и каудально (кожа легко рвется, создавая гладкий и прямой рану). Это обеспечивает достаточную боковую доступ к позвоночному столбу.
  4. Отвод края разреза кожи из основных структур, вставив стерильные кусочки гемостатической желатиновой губки (рис 2A11 и таблица 1) подкожно ростральной , а также каудально разреза. Это увеличивает отверстие и предотвращает кожу от втягивания и закрывающие зону во время операции. Гемостатическая губка желатин не нужно замачивать в солевом растворе перед применением.
  5. Разоблачить позвоночник, рассекать паравертебральных мышц с помощью тонких ножниц (рис 2A12, и таблица 1). Нарезать вложения мышц позвоночного столба и выставить пластинку (рис 4A). Нее также, что на данном этапе спинного процесс развит слабо.
  6. Определить среднюю линию и разрезают в поперечном направлении между двумя пластинками (который на данном этапе является хрящевой) с тонкими ножницами (рис 4б). Осторожно поместите одно лезвие из тонкого пинцета между пластинкой и твердой мозговой оболочки (рис 4C), возьмите пластинку с пинцетом и осторожно поднимите его вверх , пока кусок не отрывается, оставляя нетронутыми твердую мозговую оболочку (рис 4D). Повторите это 2-3 раза, чтобы получить 1-2 сегмента длинные ламинэктомии.
  7. Использование тонких щипцов в качестве кусачек, удалять части фасеточных суставов на двусторонней основе, чтобы получить достаточно места, чтобы разместить клип в пределах позвоночного канала. Очистите зону хирургического и контролировать кровотечение с небольшими кусочками гемостатической желатиновой губки.

5. Сжатие спинного мозга Травма

  1. Откройте модифицированный аневризмы мини-клип в держатель зажима (Рисунок 2A13 и рис 2B) и место йе лопасти по обе стороны от спинного мозга в промежутках между фаска вливается и шнур. Убедитесь, что ножи вставлены достаточно глубоко, чтобы повлиять на вентральной части спинного мозга. Если это невозможно, следует удалить более фасеточных суставов.
  2. Выпуск мини-клип быстро, удерживая его на месте с держателем зажима, чтобы предотвратить его от скольжения. Поддерживать сжатие в течение 15 сек.
  3. Откройте мини-клип быстро и удалить его. Для достижения симметричного сжатия, реверс ориентации мини-клипа, и используя легко видеть знак, сделанное отеком геморрагической от первого сжатия в качестве руководства, изменить положение клипа в обратной ориентации для второго сжатия 15 сек (до эксперимент показал , что это порождает симметричные гистологические и физиологические дефициты, в то время как одиночные сжатий Не 1). Твердая не должен быть поврежден при сжатии.
  4. Очистите поверхность и поддерживать гемостаз с кусочками гемостатической желатиновой губки.
  5. Удалите кусочки гемостатической желатиновой губки , которые были помещены под краев разреза кожи в начале операции и закройте разрез кожи стерильным 6,0 швом и иглодержатель (рис 2А14 и 15).
  6. Вводят подкожно 0,75 мг / кг массы тела бупренорфина (рис 2A16), разведенными в стерильном PBS, используя инсулиновый шприц (300 мкл, 30 г).

6. Послеоперационный

  1. Отключив мышь от маски носа и поместите его в контролируемой температурой набора камеры при 30 ° С до тех пор, пока анестезия смягчается и мышь становится предупреждение (1-3 ч, как правило, достаточно).
  2. Вводят Диазепам (рис 2B17) внутрибрюшинно в мать (8 г / кг массы тела). Это создает вялость, что уменьшает риск каннибализма во время первой ночи, когда этот риск является самым высоким.
  3. Возвращение обслуживаемое мышь к подстилке.
  4. Если помет лАРГЕ (> 12 щенков), удалить некоторые из неоперированных щенков, преимущественно крупных животных, если они различаются по размеру, чтобы уменьшить конкуренцию за молоко. Материнская забота оперированных щенкам лучше всего в линии ICR, если размер помета составляет около 9 щенков.
  5. Для лечения боли, введение бупренорфин (0,75 мг / кг массы тела) подкожно один раз в день в течение первых дней после операции, используя инсулиновый шприц (300 мкл, 30 г). Соответствующий объем для подкожной инъекции составляет 30-50 мкл. В новорожденных мышей вокализации и агитацией являются хорошими индикаторами боли.
  6. Провести ежедневный осмотр поврежденных мышей, используя оценочный лист для оценки питания, массы тела, обезвоживание, боль, заживление ран, задержка мочи и состояния инфекции. Согласно полученным счетом, обеспечивают особый уход, такие как инъекции стерильный педиатрической питательный раствор (таблица 1 # 18) в случае ненормального питания. Счет лист также0; определяет критерии гуманных конечных точек. Мать, которая не отвергает травмированных щенков является лучшим воспитателем.
  7. В необычном случае дисфункции мочевого пузыря, мочевого пузыря выполняют массаж два раза в день, пока функция не будет восстановлена. Это делается путем размещения мыши в положении лежа на спине в одной руке и массировать нижнюю часть живота аккуратно в ростро-каудальном направлении с помощью пальца.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Повреждение спинного мозга сжатия и потеря функции

Как было описано выше, за счет оптимизации процедур предоперационный, хирургические и послеоперационные, воспроизводимое сжатие ТСМ модель в неонатальном мыши можно получить 1. Полиэтиленовая пробка помещается на одной лопасти клипа (Фигура 2В и C) предотвращает полное закрытие зажима и удерживает расстояние между лезвиями последовательно при температуре около 230 мкм. Реверсивный ориентацию клипа между двумя сжатий приводит к симметричному травмы, судя по гистологическим осложнениям (рис 5А и 1). Сразу после удаления мини-клип, сжатая ткани спинного мозга становится темнее из-за геморрагического ушиба и отека. Наблюдение последовательных секций поврежденный спинной мозг окрашиваются по эозином и гематоксилином уже в один прекрасный деньтравмы осле показывает постепенное ухудшение ткани при приближении к эпицентру поражения (рис 5А). Присутствие интраспинальных полостей или крови в поражении не является необычным.

Поведенческой оценки, например , путем отслеживания задней конечности траектории при нерастягивающих веса условиям подшипником через несколько часов после операции, показывает значительное ухудшение задней конечности моторики в SCC мышей с повреждением по сравнению с мнимым у контрольных мышей , в которых осуществляется только ламинэктомии (Фиг.5В и 1) , Этот тест может быть повторен до тех пор , пока мышь способна выполнять другие поведенческие тесты , которые требуют несущих свой ​​собственный вес 1.

Смертность и восстановление после операции

Интраоперационная смертность в основном из-за апноэ и остановки сердца, вызванной высокой концентрацией изофлуран, необходимой для достижения достаточной anesthesiа. Вводя местный анестетик бупивакаина в хирургическом протоколе позволяет снижение концентрации изофлуран и тем самым значительно снижается уровень смертности. В одном из недавних экспериментальных серий в том числе более 20 животных, Интраоперационное смертность была равна нулю. В противоположность этому, послеоперационная выживаемость в основном зависит от принятия прооперированных мышей их матерью. Значительное улучшение произошло , когда тревога и агрессивность была снижена за счет предоставления однократной инъекции диазепама (IP 8 г / кг массы тела) к матери перед возвращением оперируемые мышей в помете 1. Прием и послеоперационное восстановление прооперированных мышей можно контролировать в присутствии молока в желудке. Желудок P1-P7 мыши , которая имеет пьяное молоко явно белый и виден через кожу живота (рисунок 3). Сравнение кормления в управляемом, мнимого контроля и неоперированных мышей полезно для оценки состояния питания ранитьг мышей. Оценка роста по сравнению с управлением неоперированных мышей показывает , что , несмотря на небольшой потери веса в течение первого послеоперационного дня, кривая роста эксплуатируемых мышей нормализует затем быстро (Рисунок 6). Смертность из-за дисфункции мочевого пузыря или инфекции никогда не наблюдалось даже у мышей, исследованных до тех пор, как 7 недель.

Номер на рис. 2 имя Производитель / Поставщик Справка # Ссылка Комментарий
1 Пластмассовый шприц (30 или 50 мл)
2 Пластиковые чашки Петри (150 х 25 мм)
3 Fortec изофлуран испарителем СайпраНебраска http://www.mssmedical.co.uk/products/new-vaporisers/ Мы используем и старое устройство из производства, проверьте ссылку на новое приспособление
4а Yasargil временный аневризма мини-клип AESCULAP FE681K http://www.aesculapusa.com/assets/base/doc/DOC697_Rev_C-Yasargil_Aneurysm_Clip.pdf
4б Чистовая отверстие полиэтилена капиллярная трубка ID 0,58 мм, OD 0,96 мм Smiths Medical 800/100/200 http://www.smiths-medical.com/industrialproducts/8/39/
5 Isoflurane (Forene) Abbott GmbH & Co. KG http://www.life-sciences-europe.com/product/forene-abbott-gmbh-wiesbaden-group-narcotic-germany-west-2001-1858.html
6 Marcain (Bupivacain) AstraZeneca http://www.astrazeneca.co.uk/medicines01/neuroscience/Product/marcaine
7 Шприц 0,3 инсулин мл 30 G х 8 мм VWR 80086-442 https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?product_id=4646138
8 УЛЬТРАВЫСОКОЕ Micro нож 5 мм передний край Fine Science Tools 10315-12 http://www.finescience.de/katalog_ansicht.asp?Suchtyp=
Kat & suchkatalog = 0019900000 & reloadmenu = 1
9 Дополнительные Щипцы Fine Грефе - 0,5 мм Наконечник Fine Science Tools 1153-10 http://www.finescience.de/katalog_ansicht.asp?Suchtyp=
Kat & suchkatalog = 0055700000 & reloadmenu = 1 		Не действительно необходимо, часто зубы слишком велики
10 Щипцы Supergrip Straight Fine Science Tools 00632-11 http://www.finescience.de/katalog_ansicht.asp?Suchtyp=
Kat & suchkatalog = 0053500000 & reloadmenu = 1 		Два щипцов необходимы
11 Spongostan Special 70 х 50 х 1 мм Ферросан
12 Vannas Весна Ножницы - 2 мм лезвия прямой Fine Science Tools 15000-03 http://www.finescience.de/katalog_ansicht.asp?Suchtyp=
Kat & suchkatalog = 0012800000 & reloadmenu = 1
13 Vario клип Применение Щипцы Aesculap FE502T http://www.aesculapusa.com/assets/base/doc/DOC697_Rev_C-Yasargil_Aneurysm_Clip.pdf
14 Викрил 6-; 0 (Ethicon) Джонсон и Джонсон J105G
15 Diethrich микро иглодержатель 11-510-20 http://trimed-ltd.com/Products/Suture-Instruments/Micro-Needle-Holders-With-Tungsten-Carbide-Inserts/Ref-11-29.html
16 Temgesic (бупренорфин) Schering-Plough
17 Stesolid (диазепам) Actavis Также известный как валиум
18 Pedamix Фрезениус Каби http://www.helsebiblioteket.no/retningslinjer/pediatri/mage-tarm-lever-ern%C3%A6ring/parenteral-ern%C3%A6ring
19 Klorhexidinsprit (хлоргексидин глюконат) FresenИУС Каби D08A C02 http://www.felleskatalogen.no/medisin/klorhexidinsprit-fresenius-kabi-klorhexidinsprit-farget-fresenius-kabi-fresenius-kabi-560639

Таблица 1. Перечень инструментов и оборудования для создания клипа управляемой травмы компрессии спинного мозга в неонатальном мыши.

figure-results-1
Рисунок 1. Схема анестезии установки. Эта схема представляет установки анестезии , предназначенный для новорожденных мышей, с камерой сна для начальной анестезии и маски нос устройства для продолжения анестезии во время операции.

figure-results-2
Рисунок 2. Основные инструменты и клип сжатия. (А) Инструменты , используемые во время процедуры. Номера соответствуют аннотацию , используемой в таблице 1. (В и С) Yasargil временный аневризмы мини-клип с наконечником каждой лопасти вручную урезана до примерно 150 мкм толщиной. Стопор выполнен из кусочком полиэтиленовой трубы (таблица 1) помещается на одной из лопастей , чтобы предотвратить полное закрытие клипа. Шкала бар: 2 мм. App: клип аппликатор (# 12 в А); St:. Стоппер Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-3
Рисунок 3. Ориентир для предоперационной оценки уровня позвоночника в неонатальном ICR мыши. (A) Боковой вид мыши P1 ICR с белым молоком в с больше. Ростральный часть желудка соответствует Т12-Т13 уровне позвоночника. (B) P1 ICR мыши под анестезией в положении лежа. Хотя более трудно представить себе, чем в (А), желудок заполнен молоком узнаваем. Ростральный часть желудка указывает T12-T13 уровне позвоночника. Шкала баров: 0,5 см.

figure-results-4
Рисунок 4. Спинной ламинэктомии. (А) Вскрытие паравертебральных мышц. Обратите внимание, что в этом возрасте спинальная процесс развит слабо. (В) Поперечное секционирование пластинки с тонкими ножницами. (C) Введение одной лопасти из тонкого пинцета между пластинкой и твердой мозговой оболочки. Точка входа показано стрелкой. (D) Удаление листовой пластинки. Шкала бар: 2 мм.

Файлы / ftp_upload / 53498 / 53498fig5.jpg "/>
Рисунок 5. Гистологическое и поведенческие исходы после компрессионной травмы спинного мозга на P1. (A) эозином и гематоксилин окрашивание срезов спинного мозга с травмированной мыши (1 день после травмы) на различном расстоянии от травмы эпицентра. (B) Характерные следы передних конечностей и задних конечностей траекторий наблюдается через 6 часов после травмы или после контрольной фиктивным ламинэктомии. Следы на вершине траектории представляют собой видимую из бокового зрения животного. Следы в нижней части представляют собой траектории Рассматриваемый от вентральной животного. Смотрите также 1. Шкала бар: 250 мкм. DH: дорсального рога; L, слева; R: право; SCC: компрессия спинного мозга; ВХ:. Вентральный рог Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.


Рисунок 6. Сравнительные кривые роста. Гистограмма , показывающая увеличение веса неоперированных и SCC ранения мышей от послеродового 1 -й день до послеродового 9 -й день.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой статье процедуры клипа генерируемые травмы SCC в P1 мышей описаны. Те же самые процедуры, также могут быть выполнены на более поздних этапах. Компрессионные травмы были успешно выполнены в Р5, Р7, Р9 и Р12 (Züchner, и др., Рукописи в процессе подготовки). На всех этапах постнатального развития, общей анестезии получается с изофлуран испарившейся в чистом кислороде, но анестезирующий результат во многом зависит от возраста. В начальных попытках P1-P4, перед тем местная анестезия была введена в протокол, было трудно получить глубокий и продолжительный седативный эффект из-за узкого окна доза-эффект между недостаточной седации и передозировки. Кроме того, проблемы , связанные с нейротоксическом эффект изофлюрана у новорожденных животных были повышены 27-30. Сочетание изофлуран и результаты местного анестетика бупивакаина в более глубоком и более стабильной анестезии, обеспечивая при этом в изофлуран снижение дозы на 2-3 раза. Различные типы anestheSIA были описаны для новорожденных грызунов, в том числе cryoanesthesia 31,32, но один потенциальный неудобство cryoanesthesia является его нейропротекторное действие (обзор 33,34), что может осложнить генерацию эффективной и воспроизводимой травмы. Барбитурата на основе анестезии считается, имеют более низкую эффективность у новорожденных мышей из - за снижения уровня сывороточного альбумина и жира , чем у взрослых 35,36.

Хотя довольно агрессивен и травматическое, как только процедура установлена ​​смертность во время операции низка. Тем не менее, существуют критические шаги в ходе процедуры, которые требуют особого внимания для улучшения восстановления и выживаемости оперированных мышей. Одним из важных вопросов является выбор щенков, которые будут иметь наилучшие шансы пережить операцию. Когда помет велико состояние питания отдельных щенков меняется. В дополнение к неизбежным кровотечение, которое происходит во время операции, управляемые щенками проводят часS от матери, и они часто не пьют молоко до следующего утра. Таким образом, преимущество, чтобы выбрать щенкам, которые уже имеют определенное количество молока в желудке. Это хорошо видно через кожу живота от P0 до P7.

В первую ночь оперированное щенок на большой риск быть разобраны матерью. Во время первоначальной разработки этой модели более половины прооперированных мышей отсутствовали на следующее утро, с явными признаками крови в клетке. Necrophagy, людоедство и детоубийство у грызунов были изучены в течение многих десятилетий 37-40. В этом исследовании, каннибализм был только свидетелем один раз, но считался более вероятным объяснением, чем necrophagy потому что детенышей, которые были возвращены в клетке, как правило, были в такой хорошей форме, что смерть от естественных причин в течение ночи казалось невероятным. Это побудило идею использования обратимого фармакологического агента, такого как диазепам, чтобы уменьшить беспокойство и агрессивность яп мать (обзор 41). Внутрибрюшинный инъекции диазепама значительно улучшили ситуацию, понизив смертность в течение первой ночи с более чем 60% до менее чем на 20%.

Уменьшение размера помета путем выбраковки и мешая помет как можно меньше следующие послеоперационного возврата дополнительные элементы, которые могут принести пользу оперируемые животных. Тем не менее, оставив только эксплуатируемые щенков с матерью не выгодно. Лучший баланс эксплуатируемых / неоперированных щенками может варьироваться в зависимости от линии, но для ICR и SCID-ICR мышей, оставляя 4-5 эксплуатируемые щенков (травма или мнимые) вместе с 3-4 неоперированных щенкам дали лучшие результаты.

В общем смысле, основным недостатком этой модели новорожденных SCI является то, что неонатальный спинного мозга во многом отличается от взрослого спинного мозга, и, таким образом, не может обеспечить экспериментальные результаты, сравнимые с результатами, полученными от взрослых моделей с повреждением спинного мозга. Такие различия включают общий размер иобъем спинного мозга, число клеток, недопредставленность специфических типов клеток, таких как олигодендроциты, незрелые иммунные ответы и незрелых нервных цепей. Выводы, сделанные из экспериментов в этой модели, следовательно, должны быть тщательно продуманы. С другой стороны, модель имеет отношение к относительно менее исследованной сценария педиатрического SCI. К тому же, что видимая слабость в отношении взрослых моделей с повреждением спинного мозга также потенциальная сила, поскольку это может позволить выяснению пластическими механизмов, которые, хотя и минимально сохранившийся во взрослом спинном мозге, может представлять собой терапевтический субстрат, если восстановлен. Вполне возможно, что восстановление неонатальных или даже эмбриональных условиях могут быть реализованы путем имплантации менее развитых клеток или тканей или обработкой реагентами, которые порождают взрослую ткань с более ранними характеристиками развития. Использование ферментов для устранения перинейронное сетей является примером последнего подхода 42,43.

Одной из основных проблем при создании животной модели для ТСМ является получение стандартизированного травмы. Это очень важный аспект , который был рассмотрен в нескольких моделях с повреждением спинного мозга, например, рассечение, гемисекция, молотки, сжатия воздушного шара, пинцет давка, статическое сжатие веса и т.д. Что касается влияния на устройства, усилия в этом направлении привели к моделям с повреждением спинного мозга в взрослых грызунов , где можно манипулировать несколькими параметрами воздействия , такие как скорость, сила и продолжительность (обзор 44). Другой подход, включающий меньше оборудования, использует модификацию аневризмы клипа Керр-Lougheed 45,46. Эти 2 подхода дополняют друг друга, как ударник имитирует травму ушиб в то время как клип имитирует травмы сжатия с некоторой степенью сопутствующей ишемии. Из-за существенных ограничений по размеру и большей уязвимости новорожденных мышей, тем выше смертность, связанная с более длительными хирургических операций, а также расходы на развиработке меньшего масштаба оборудования, она была выбрана для разработки клипа сгенерированных сжатия, а не ушиба подхода ударника сгенерированные. Это было достигнуто за счет адаптации коммерчески доступного аневризмы мини-клип , чтобы приспособить размер позвоночного столба у новорожденных мышей 1. Добавление стопор обеспечивает стандартизированный ширину сжатия, и до тех пор пока напряжение клипа сжимается до предела стопора, сила сжатия во время статической фазы при минимальной ширине должна немного изменяться. То, что не нормируется является скорость сжатия во время его динамической фазы, так как это будет меняться по мере изменения клипа напряжения в течение всего срока службы. Поскольку статическая фаза сжатия длится гораздо дольше, чем динамическая фаза, и есть немного, чтобы предположить, что ткани спинного мозга оказывает большую часть противодействующей против мини-клип лезвий, вполне вероятно, что тяжесть травмы наибольшей степени зависит от статическая фаза. Это, однако, еще предстоит проверить. травмаТяжесть, вероятно, зависеть от множества факторов, в том числе статической силы сжатия и длительности, скорости компрессии и декомпрессии, положение мини-клипа, а также количество сжатий, выполненных в том же самом месте. Таким образом, комбинаторное изменение этих параметров может привести к генерации спектра травмы важностей от слабой до тяжелой. Несмотря на потенциал изменчивости, в нашем ранее опубликованном исследовании 1 мы получили устойчивые результаты при гистологических, физиологических и поведенческих уровнях, так что есть немного , чтобы предположить , что приемлемая стандартизация трудно достичь. Отметим , что в этом исследовании мы использовали несколько методов проверки на каждом уровне, включая поведенческие тесты , такие как воздушно-степпинг , как показано на рисунке 5.

В этой модели новорожденных SCI травма щадит определенную часть аксонов и тем самым обеспечивает ситуацию благоприятной для выявляя адаптивной пластичности за счет повторного modelinг избавлены соединений и образование новых схем. Кроме того, поскольку неонатальной мыши хорошо подходит для исследования многими экспериментальными методами, можно использовать эту модель для изучения функционального восстановления и адаптивной пластичности с интегративного подхода, в том числе поведенческие тесты, ретроградной и антероградного аксонов копировальная, иммуногистохимии, электрофизиологии и высокая -throughput оптической записи 1. В качестве примера, мы воспользовались этим интегративного подхода , чтобы продемонстрировать сети ремоделирования на уровне удельных нисходящих с использованием высокой пропускной способностью визуализации кальция в естественных условиях бывших Wholemount препаратах ствола мозга и травму спинного мозга 1. Это может быть отодвинута еще дальше с помощью нейро-оптогенетика и оптогенетика фармакологические инструменты для оценки ремоделирования синаптических связей между специфическими субпопуляциями нейронов спинного мозга.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана грантами от Регионального управления здравоохранения Юго-Восточной Норвегии (JLB, 2014119; JCG, номера проектов 2015045 и 2012065), Норвежским исследовательским советом (JCG, проект No 23 00 00) и Университетом Осло.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Пластиковый шприц (30 или 50  ml)
Пластиковая чашка Петри (150 x 25  мм)
Фортек изофлуран вапорайзерЦипранМы используем и старое устройство снято с производства, проверьте ссылку на более новое устройство
Ясаргил временная аневризма мини-клип&Элиг; sculapFE681K
Трубка из мелкозернистого полиэтилена ID 0.58  мм, наружный диаметр 0,96  mmSmiths Medical800/100/200
Изофлуран (Форен)Abbott GmbH & Co. KG Маркаин
(Бупивакаин)АстраЗенека
Инсулин сейринг 0,3  мл 30  G x 8  ммVWR80086-442
Ультратонкий микронож 5  мм режущая кромкаFine Science Tools10315-12
Extra Fine Graefe Щипцы – 0.5  мм НаконечникFine Science Tools1153-10Не очень нужен, часто зубы слишком большие
Щипцы SuperGrip StraightFine Science Tools00632-11Два щипца необходимы
Spongostan Special 70 x 50 x 1  mmFerrosan
Vannas Весенние ножницы – 2  мм Лезвия прямыеFine Science Tools15000-03
Vario Clip Прикладные щипцыAesculapFE502T
Vicryl 6– 0 (Ethicon)Johnson and JohnsonJ105G
Микроиглодержатель11-510-20
Temgesic (бупренорфин)Schering-Plough
Stesolid (диазепам)ActavisТакже известный как Valium
PedamixFresenius Kabi
Klorhexidinsprit (хлоргексидина глюконат)Fresenius КабиD08A C02
Diethrich

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Boulland, J. -L., Lambert, F. M., Züchner, M., Strom, S., Glover, J. C. A Neonatal Mouse Spinal Cord Injury Model for Assessing Post-Injury Adaptive Plasticity and Human Stem Cell Integration. PLoS ONE. 8 (8), (2013).
  2. Raineteau, O., Schwab, M. E. Plasticity of motor systems after incomplete spinal cord injury. Nat. Rev. Neurosci. 2 (4), 263-273 (2001).
  3. Edgerton, V. R., Tillakaratne, N. J. K., Bigbee, A. J., de Leon, R. D., Roy, R. R. Plasticity of the spinal neural circuitry after injury. Annu. Rev. Neurosci. 27, 145-167 (2004).
  4. Bareyre, F. M., et al. The injured spinal cord spontaneously forms a new intraspinal circuit in adult rats. Nat. Neurosci. 7 (3), 269-277 (2004).
  5. Cai, L. L., et al. Plasticity of functional connectivity in the adult spinal cord. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B., Biol. Sci. 361 (1473), 1635-1646 (2006).
  6. Courtine, G., Song, B., et al. Recovery of supraspinal control of stepping via indirect propriospinal relay connections after spinal cord injury. Nat. Med. 14 (1), 69-74 (2008).
  7. Courtine, G., et al. Transformation of nonfunctional spinal circuits into functional states after the loss of brain input. Nat. Neurosci. 12 (10), 1333-1342 (2009).
  8. Fenrich, K. K., Rose, P. K. Axons with highly branched terminal regions successfully regenerate across spinal midline transections in the adult cat. J. Comp. Neurol. 519 (16), 3240-3258 (2011).
  9. Fenrich, K. K., Rose, P. K. Spinal interneuron axons spontaneously regenerate after spinal cord injury in the adult feline. J. Neurosci. 29 (39), 12145-12158 (2009).
  10. Farrar, M. J., et al. Chronic in vivo imaging in the mouse spinal cord using an implanted chamber. Nat. Methods. 9 (3), 297-302 (2012).
  11. Oshima, Y., et al. Intravital multiphoton fluorescence imaging and optical manipulation of spinal cord in mice, using a compact fiber laser system. Lasers Surg. Med. 46 (7), 563-572 (2014).
  12. Débarre, D., Olivier, N., Supatto, W., Beaurepaire, E. Mitigating phototoxicity during multiphoton microscopy of live Drosophila embryos in the 1.0-1.2 µm wavelength range. PloS One. 9 (8), e104250(2014).
  13. Kasumacic, N., Glover, J. C., Perreault, M. -C. Segmental patterns of vestibular-mediated synaptic inputs to axial and limb motoneurons in the neonatal mouse assessed by optical recording. J. Physiol. 588 (Pt 24), 4905-4925 (2010).
  14. Kasumacic, N., Glover, J. C., Perreault, M. -C. Vestibular-mediated synaptic inputs and pathways to sympathetic preganglionic neurons in the neonatal mouse. J. Physiol. 590 (Pt 22), 5809-5826 (2012).
  15. Szokol, K., Glover, J. C., Perreault, M. -C. Differential origin of reticulospinal drive to motoneurons innervating trunk and hindlimb muscles in the mouse revealed by optical recording. J. Physiol. 586 (Pt 21), 5259-5276 (2008).
  16. Szokol, K., Glover, J. C., Perreault, M. -C. Organization of functional synaptic connections between medullary reticulospinal neurons and lumbar descending commissural interneurons in the neonatal mouse. J. Neurosci. 31 (12), 4731-4742 (2011).
  17. Szokol, K., Perreault, M. -C. Imaging synaptically mediated responses produced by brainstem inputs onto identified spinal neurons in the neonatal mouse. J. Neurosci. Meth. 180 (1), 1-8 (2009).
  18. Pang, D. Spinal cord injury without radiographic abnormality in children, 2 decades later. Neurosurgery. 55 (6), 1325-1342 (2004).
  19. Lee, J. H., Sung, I. Y., Kang, J. Y., Park, S. R. Characteristics of pediatric-onset spinal cord injury. Pediatr. Int. 51 (2), 254-257 (2009).
  20. Parent, S., Mac-Thiong, J. -M., Roy-Beaudry, M., Sosa, J. F., Labelle, H. Spinal cord injury in the pediatric population: a systematic review of the literature. J. Neurotrauma. 28 (8), 1515-1524 (2011).
  21. Basu, S. Spinal injuries in children. Front Neurol. 3, 96(2012).
  22. Chien, L. -C., et al. Age, sex, and socio-economic status affect the incidence of pediatric spinal cord injury: an eleven-year national cohort study. PloS One. 7 (6), e39264(2012).
  23. Maier, I. C., Schwab, M. E. Sprouting, regeneration and circuit formation in the injured spinal cord: factors and activity. Philos. T. R. Soc. Lond. B. 361 (1473), 1611-1634 (2006).
  24. Schwab, M. E., Strittmatter, S. M. Nogo limits neural plasticity and recovery from injury. Curr. Opin. Neurobiol. 27, 53-60 (2014).
  25. Jakeman, L. B., Hoschouer, E. L., Basso, D. M. Injured mice at the gym: review, results and considerations for combining chondroitinase and locomotor exercise to enhance recovery after spinal cord injury. Brain Res. Bull. 84 (4-5), 317-326 (2011).
  26. Rhodes, K., Fawcett, J. Chondroitin sulphate proteoglycans: preventing plasticity or protecting the CNS? J. Anat. 204 (1), 33-48 (2004).
  27. Zhu, C., et al. Isoflurane anesthesia induced persistent, progressive memory impairment, caused a loss of neural stem cells, and reduced neurogenesis in young, but not adult, rodents. J. Cereb. Blood Flow Metab. 30 (5), 1017-1030 (2010).
  28. Loepke, A. W., et al. The effects of neonatal isoflurane exposure in mice on brain cell viability, adult behavior, learning, and memory. Anesth. Analg. 108 (1), 90-104 (2009).
  29. Rothstein, S., Simkins, T., Nunez, J. L. Response to neonatal anesthesia - effect of sex on anatomical and behavioral outcome. Neuroscience. 152 (4), 959-969 (2008).
  30. Rizzi, S., Carter, L. B., Ori, C., Jevtovic-Todorovic, V. Clinical anesthesia causes permanent damage to the fetal guinea pig brain. Brain Pathol. 18 (2), (2008).
  31. Janus, C., Golde, T. The effect of brief neonatal cryoanesthesia on physical development and adult cognitive function in mice. Behav. Brain Res. 259, 253-260 (2014).
  32. Nuñez, J. L., Koss, W. A., Juraska, J. M. Hippocampal anatomy and water maze performance are affected by neonatal cryoanesthesia in rats of both sexes. Horm. Behav. 37 (3), 169-178 (2000).
  33. Batchelor, P. E., et al. Systematic review and meta-analysis of therapeutic hypothermia in animal models of spinal cord injury. PloS one. 8 (8), e71317(2013).
  34. Kwon, B. K., et al. Hypothermia for spinal cord injury. The Spine Journal. 8 (6), 859-874 (2008).
  35. Benjamin, M. M. Outline of veterinary clinical pathology. , 3rd ed, (1978).
  36. Cunningham, M. G., McKay, R. D. G. A hypothermic miniaturized stereotaxic instrument for surgery in newborn rats. J. Neurosci. Methods. 47 (1-2), 105-114 (1993).
  37. Lane-Petter, W. Cannibalism in rats and mice. Proc. R. Soc. Med. 61 (12), 1295-1296 (1968).
  38. Gandelman, R., Simon, N. G. Spontaneous pup-killing by mice in response to large litters. Dev. Psychobiol. 11 (3), 235-241 (1978).
  39. Taylor, G. T. Urinary odors and size protect juvenile laboratory mice from adult male attack. Dev. Psychobiol. 15 (2), 171-186 (1982).
  40. Weber, E. M., Algers, B., Hultgren, J., Olsson, I. A. Pup mortality in laboratory mice -- infanticide or not? Acta Vet Scand. 55 (1), 83(2013).
  41. Crawley, J. N. Exploratory behavior models of anxiety in mice. Neurosci. Biobehav. Rev. 9 (1), 37-44 (1985).
  42. Kwok, J. C. F., Heller, J. P., Zhao, R. -R., Fawcett, J. W. Targeting inhibitory chondroitin sulphate proteoglycans to promote plasticity after injury. Methods Mol. Biol. 1162, 127-138 (2014).
  43. Kwok, J. C. F., Afshari, F., Garcìa-Alìas, G., Fawcett, J. W. Proteoglycans in the central nervous system: plasticity, regeneration and their stimulation with chondroitinase ABC. Restor. Neurol. Neurosci. 26 (2-3), 131-145 (2008).
  44. Young, W. Spinal cord contusion models. Prog. Brain Res. 137, 231-255 (2002).
  45. Rivlin, A. S., Tator, C. H. Regional spinal cord blood flow in rats after severe cord trauma. J. Neurosurg. 49 (6), 844-853 (1978).
  46. Rivlin, A. S., Tator, C. H. Effect of duration of acute spinal cord compression in a new acute cord injury model in the rat. Surg. Neurol. 10 (1), 38-43 (1978).
  47. Joshi, M., Fehlings, M. G. Development and characterization of a novel, graded model of clip compressive spinal cord injury in the mouse: Part 1. Clip design, behavioral outcomes, and histopathology. J. Neurotrauma. 19 (2), 175-190 (2002).
  48. Joshi, M., Fehlings, M. G. Development and characterization of a novel, graded model of clip compressive spinal cord injury in the mouse: Part 2. Quantitative neuroanatomical assessment and analysis of the relationships between axonal tracts, residual tissue, and locomotor recovery. J. Neurotrauma. 19 (2), 191-203 (2002).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи