Стратегия для обоснования роли каллозы опосредованной Plasmodesmal воротного в Tropic Response

Краткое содержание

В данной статье описаны способы скрининга генов, контролирующих plasmodesmal проницаемость и, следовательно, градиент ауксина во время реакции тропика. Это включает в себя измерение степени троповых ответа в гипокотиля из Резуховидка Таля и проверки plasmodesmal проницаемости по 8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulfonic кислоты (HPTs) загрузки и оценки , наконец , каллозы уровня.

Аннотация

Ауксина растений гормон играет важную роль во многих роста и развития процессов, в том числе трофических реакции на свет и силу тяжести. Создание градиента ауксина является ключевым событием приводит к фототропизма и геотропизм. Ранее было показано, полярный транспорт ауксина (PAT), чтобы создать градиент ауксина в различных клеточных доменах растений. Тем не менее, Хан и др. Недавно продемонстрировали , что для правильного формирования ауксина градиента, plasmodesmal мозолистый-опосредованной symplasmic связность между соседними ячейками также является критическим фактором. В этой рукописи, стратегия для выяснения роли конкретных генов, которые могут повлиять на фототропизм и геотропизм путем изменения symplasmic соединений посредством модулирования plasmodesmal синтеза каллозы, обсуждается. Первым шагом является скрининг аберрантных ответов Тропик от 3-дневных этиолированных проростков мутантов или сверхэкспрессии линий гена наряду с диким типом. Этот предварительный скринингможет привести к идентификации целого ряда генов, функционирующих в PAT или контролирующих symplasmic подключения. Второй скрининг включает в себя сортировку кандидатов, которые показывают измененные Тропик реакции, воздействуя symplasmic подключения. Для решения таких кандидатов, движение в symplasmic трассирующими и осаждение plasmodesmal каллозы были исследованы. Эта стратегия будет полезна для изучения новых генов-кандидатов, которые могут регулировать symplasmic соединения прямо или косвенно в процессе трофических реакций и других процессов развития.

Введение

Растения, как и сидячих живых организмов, разработали очень сложную сеть от клетки к клетке сигнализации для решения различных экологических стимулов. Tropic ответы являются одним из явлений, с помощью которых растения реагируют на стимулы окружающей среды. Растения показывают два основных тропическое отклики, фототропизм и геотропизм. Фотосинтетические растения согнуться в сторону источника света путем фототропизма собрать максимальное количество энергии. Точно так же, геотропизм делает растения растут в сторону центра тяжести. Фундаментальный механизм , приводящий к таким трофических реакций предполагает асимметричное образование градиентной фитогормонов ауксина ^1. Акт формирования локального градиента ауксина хорошо характеризуется; гены, которые участвуют в этом механизме представляют собой дорожную карту для действия гормонов ^2-8. Конкретное положение ауксина эффлюксных носителей, таких как PIN - сформированным (PIN) и Р-гликопротеины, выполняет движение ауксина из цитоплазмы в клеточной стенке клетки донора ^9,10. Furthermore, активным Н ⁺ / IAA symport активности ауксина притока носителей, таких как AUX1 / LAX белков семейства, ауксина, наконец , доставлены в соседние ячейки ^2,11,12 приемника. Это направленное движение ауксина известен как полярный ауксина транспорта (PAT). РАТ приводит к распределению дифференциальной ауксина на различных стадиях развития , и в ответ на различные стимулы , окружающую ^13,14. Кроме того, нарушение в локализации или экспрессии любого из этих ауксина притока или оттока носителей приводит к сильному изменению в PAT, что приводит к нарушению градиента ауксина, что приводит к дефектам развития. В последнее время , Хан и др. сообщили , что регулирование plasmodesmal также необходимо для поддержания ауксина градиента ^15. На сегодняшний день, более 30 plasmodesmal белки были идентифицированы ^16. Среди этих белков, AtGSL8 было сообщено в качестве ключевого фермента синтеза каллозы в плазмодесмами (PD) и, следовательно, играет жизненно важную роль в MAINTAining предел PD размер исключения (SEL). Репрессированные выражение AtGSL8 привело к искажению рисунка ауксина градиента , приводящей к троповых без ответа , в отличие от дикого типа рассады ^15.

В этой рукописи, методы, чтобы исследовать новые гены-кандидаты, которые участвуют в регуляции ПД предусмотрены. AtGSL8 был использован в качестве модели белка, чтобы проверить эти методы, поскольку это является ключевым ферментом способствует PD каллозы биосинтез. Благодаря питомничество летальности gsl8 нокаутных мутантов ^17, дексаметазон (Dex) -inducible линии RNAi использовались в соответствии с ранее опубликованного доклада ^15. Стратегия, представленная здесь, может быть адаптирована для скрининга генов, ответственных в ответ гипокотиля троповых контролируемой PD SEL.

Протокол

1. Скрининг Мутанты с измененными фототропным и ГРАВИТРОПИЧЕСКУЮ Ответы

1. Приготовьте 1х Мурашига и Скуга (MS) среды, рН 5,7, 0,8% агаром за один день до эксперимента.
   1. Добавить 800 мл дважды дистиллированной воды в 2-литровую коническую колбу и перемешивают магнитной мешалкой.
   2. Добавить 4,4 г MS соли в коническую колбу.
   3. Добавить 0,5 г 2- (N-морфолино) этан сульфоновой кислоты (MES) и перемешивают, пока все соли полностью не растворится.
   4. Доводят рН среды до 5,7 с помощью 1 М КОН.
   5. Перенести среду к массовому цилиндру и довести конечный объем до 1 л с DDH ₂ O.
   6. Вылейте обратно в среду в 2 л коническую колбу и добавляют 8 г растительного агар.
   7. Оберните рот коническую колбу плотно с алюминиевой фольгой.
   8. Автоклава среде МС и DDH ₂ O в течение 15 мин при температуре 121 ° С, 15 фунтов на квадратный дюйм, и после того, как автоклавирование, держать среды в 60 ° С инкубатор и DDH ₂ O при комнатной температуре,
   9. После охлаждения до 60 ° С, влить среду в 125 х 125 х 20 мм ³ квадратных пластин на скамейке ламинарного потока (50 мл в каждой пластине).
   10. Дайте агар затвердевать при комнатной температуре в течение приблизительно 1 ч, поддерживая пластины частично открытыми. Если пластины не используют сразу, запечатать их с помощью полиэтиленовой пленкой и хранят при температуре 4 ° С в холодильнике.
2. Поверхностно-простерилизовать семена с 1,1% раствором гипохлорита натрия и точка семена на чашках 1x МС, которые были получены в разделе 1.1.
   Примечание: Здесь Резуховидка Таля {Col-0 семена, dsGSL8 (Col-0)} ¹⁵ используются для ответа тропика, каллозы окрашивания и HPTs загрузки Резуховидка Таля {Col-0 и dsGSL8 (Col-0) EMS мутанта} семян (. неопубликованные) используются для ответа троповых на рисунке 2.
   1. Автоклав 300 мл DDH ₂ O в бутылке.
   2. Добавьте около ста семян для каждого фона, т.е.Мутант / сверхэкспрессии линии и (Col-0) Семена, дикого типа в 1,5 мл трубки микроцентрифужных.
   3. Вынуть 1x MS агар Тарелки из C холодильника 4 ° и высушить их на скамейке ламинарного потока в частично открытом положении.
   4. Поверхностно-простерилизовать семена путем добавления 1 мл раствора 0.2x отбеливателя (1,1% гипохлорита натрия) и держать микроцентрифужных трубки на качалке при 250 оборотах в минуту в течение 5 мин.
   5. Пусть семена оседают на дно под действием силы тяжести, а затем удалить раствор отбеливателя по микропипетки.
   6. Добавьте 1 мл свежего DDH ₂ O (автоклавируют) на семена и хорошо перемешать, переворачивая микроцентрифужных трубки несколько раз. Пусть семена оседать, а затем снова удалить воду.
   7. Повторите шаг 1.2.6 5-6 раз.
   8. Добавить в два раза больше количества воды в объеме семян, оставшихся после окончательной промывки.
   9. Дот стерилизованные семена на Полусушенные 1x MS агаром, используя наконечник 1 мл микропипетки, содержащую 200 мкл семян (ввода числе).
      1. Хранить примерно на расстоянии 0,1 см между двумя семенами и минимум 1,8 см между двумя рядами семян. Dot семена в пять горизонтальных рядов на квадратный пластины (125 х 125 х 20 мм ^3). Дайте воде немного высохнуть, прежде чем поместить крышку на тарелку.
   10. Уплотнение пластин с хирургической лентой, укладывают все из пластин вертикально, и обертывают алюминиевой фольгой.
   11. Передача обернутые пластины в темный ящик (без доступа к свету). Затем держать темную коробку в 4 ° C комнатной / холодильнике в течение 3-х дней.
   12. Начиная с этого этапа, держать направление пластин в неизмененном виде. После 3-х дней лечения простуды, держать темную коробку в комнатной культуре растений при 22 ° С в течение следующих 3-х дней. После 3-х дней, проверьте состояние всхожести семян под зеленым светом в темной комнате.
       Примечание: Обычно 3 дневных Col-0 этиолированные проростки может вырасти до 1,6 см в длину.
3. Анализировать измененную фототропным Aй ГРАВИТРОПИЧЕСКУЮ ответ на мутантов или сверхэкспрессии линий конкретного гена. Выберите только одинакового размера, так и вертикально выращены прямые рассаду под зеленым светом в темной комнате. Передача выбранных рассаду на свежий агар пластины 1x MS, используя наконечник стерилизованную зубочисткой.
   1. Осторожно выбрать рассаду из самой нижней части их гипокотиля, не касаясь каких-либо других частей. Убедитесь, что все сеянцы имеют одинаковую ориентацию семядолей / крючок, и после передачи, что ориентация рассады крючки остаются прежними. Используйте как минимум 20 саженцев каждого фона в каждой строке и как минимум двух пластин для каждой временной точки для дальнейшего анализа.
      Примечание: Четыре различных фона можно сравнить в каждой пластине (4 строки).
      Дополнительно: При использовании дексаметазона (DEX) -inducible RNAi / сверхэкспрессии линии, передавать вышеуказанные рассаду на 1x MS пластины вместе с + DEX пластины MS (плита, содержащая 1x MS, 0,8% среднего агар с добавлением 20 мкМ DEX) FOг 3 ч и держать пластины в вертикальном положении в темном поле.
   2. Для проверки фототропным ответа, передать вышеуказанные пластины вертикально к черному ящику только с одной стороны открыт. Перенести черный ящик, содержащий пластины в камеру для выращивания растений с односторонним белым светом. Для того, чтобы обеспечить одностороннее освещение, поместите край пластины по направлению к источнику света (не на передней стороне). Обратитесь к установке на рисунке 1.
   3. Точно так же, чтобы проверить ГРАВИТРОПИЧЕСКУЮ ответ, держать пластины с вертикальными перенесенных сеянцев, и накрыть алюминиевой фольгой. Затем измените ориентацию пластины по вертикали до 90 ° и держать его внутри черного ящика покрыта со всех сторон. Обратитесь к установке на рисунке 1.
   4. После заданных моментов времени (как правило, 1,5 ч, 3 ч, 6 ч и 12 ч) сканировать пластины с помощью сканера, а также сохранять изображения в формате JPEG.
   5. Измерьте угол изгиба рассады с использованием ImageJ программного обеспечения (http://imagej.nih.gov/ij/index.html~~HEAD=dobj) (рисЮр 2).
      1. Запустите программу ImageJ двойным щелчком (рис 2А).
         Примечание: Основные инструменты , которые были использованы при измерении угла показаны на рисунке 2B.
      2. Нажмите кнопку "файл" , а затем Подвариант "открытой" на панели инструментов ImageJ и открытых снимков , сохраненных в формате файла JPEG для измерения Тропик угол изгиба (рис 2C).
      3. Выберите инструмент увеличительного для увеличения или уменьшения масштаба на картинке, нажав левую или правую кнопку мыши, соответственно , как показано на рисунке 2B.
      4. Выберите инструмент прокрутки , чтобы перетащить и поместить изображение (рисунок 2D) .next выберите инструмент угла для измерения угла изгиба (рис 2E).
         1. Сделайте двойной левый клик на оригинальный гипокотиля точки роста направления 'а', перетащить мышью изгиба точки инициации 'B' (рис 2F), и нажмите левую прикладна нарисовать первую линию (рис 2G).
         2. Перетащите мышь от точки Ь до изгибающий конечной точке 'C', и нажмите левую кнопку мыши , чтобы нарисовать вторую линию (рис 2H) и образуют фиксированный A. Примечание: истинный угол изгиба В, которая равна 180 ° - А. (рис 2F).
         3. Измерение и запись Побочным нажав 'M' на клавиатуре. Файл результат будет открыть отдельно , как показано на рисунке 2I. Измерьте и запишите все сеянцы один за другим. Например, сначала измерить угол изгиба для всех гипокотилях от Col-0 , а затем в течение мутантных линий.
   6. Передача набора данных из ImageJ в файл электронной таблицы, чтобы сделать аудиовидеоприемникеняя гибки углов каждого фона.
   7. Для количественного анализа, сделать диаграмму гистограммы со статистическими результатами испытаний, в том числе стандартные панели ошибок и значений вероятности (смотри рисунок 2).
      1. Вычислить истинную сгибание Б, а также разработать формулу , используя таблицу, то есть, В = 180 ° - Заметка: А представляет собой значение, которое было получено из анализа ImageJ.
      2. Измерьте средний угол изгиба B для каждого фона с помощью электронных таблиц инструментов (Рисунок 2j).
      3. Анализировать стандартное отклонение между повторами для каждого измерения с использованием электронных таблиц "формул" инструмент (рис 2J).
      4. Проверьте сиговыхnificance результатов путем применения Т-тест для среднего угла изгиба и стандартного отклонения, вычисленных, как указано выше.
      5. Нарисуйте диаграмму бар , используя вышеуказанные значения для графического представления количественной разницы в угол изгиба между двумя различными уровнями подготовки с использованием электронных таблиц "вставки" инструмент (рисунок 2K).
         Примечание: Мутант / сверхэкспрессии линии сильных генов-кандидатов покажет четкие различия в отношении дикого типа, например, не изгибая, быстрый или медленный изгиб изгиб.

2. Завод Экран Линии с неисправными Tropic Ответы в связи с изменением PD SEL с видоизмененной PD каллозы Level

1. Выполните гипокотиля Загрузка Пробирной на 8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulfonic кислоты (HPTs) Dye Загрузка на вершине сеянцев с HPTs агарозном блоков и сравнить движение красителя между Mutant / Over-мимические и Col-0.
   1. Приготовьте HPTs AgaroSE блоки для анализа гипокотиля загрузки.
      1. Взять 10 мл DDH ₂ O в 50 мл коническую колбу и добавляют 0,1 г агарозы , чтобы приготовить гель 1% -ном агарозном. Кипение агарозы в микроволновой печи в течение 1-2 мин с прерывистой встряхивании, и дайте ему остыть в течение 5 мин.
      2. Добавить 50 мг HPTs до 10 мл 1% раствора агарозы, и хорошо перемешать, пока раствор не станет зеленым.
      3. Налейте вышеуказанную смесь до 10 мм чашки Петри, и позволяют ему затвердеть в течение 15 мин.
      4. Обрежьте затвердевшей HPTs агарозы с острым рассечение лезвием , чтобы сделать небольшие агарозном блоки (0,5 х 2 см ^2).
   2. Подготовить образцы растений для красителя загрузки анализа HPTs.
      1. Установите платформу для анализа HPTs загрузки красителя; поместите микроскоп крышку слайд (24 х 50 мм ²⁾ на новой средней пластине MS , как показано на рисунке 3А.
      2. Акцизные 3 дневных этиолированных сеянцы из основания крючка при помощи острого хирургического ножничные.
      3. Немедленнопередача вышеуказанных рассады (минимум 5 саженцев от каждого фона) к поверхности микроскопический покровного стекла таким образом, что только 0,5 см гипокотиля из положения вырезании должно оставаться на скольз щей крышке, а остальная часть гипокотиля должна касаться среда , как показано на фигуре 3В.
      4. Поместите агарозный блок HPTs поверх гипокотиля (с вырезанным крюком) в течение 5 мин таким образом, что площадь Иссеченную прикасается агарозы блок HPTs.
      5. Через 5 мин нагрузки, снимите блок агарозы с поверхности гипокотиля, передавать гипокотили на 10 мм чашки Петри , содержащие DDH ₂ O и моют гипокотили в DDH ₂ O в течение 15 мин при непрерывном встряхивании.
   3. Подготовка образцов для конфокальной микроскопией.
      1. Выберите как минимум 5 саженцев от каждого фона для наблюдения под конфокальной лазерной сканирующей микроскопии.
      2. В лазерном канале, установите длину волны 488 нм для конкретного возбтации и от 500 до 550 нм для излучения полосовой.
      3. Передача рассады в 2 -х комплектов (один Col-0 + один мутант) к новому предметное стекло после мытья с DDH ₂ O. Добавить 100-150 мкл дважды дистиллированной воды к слайду, и накрыть крышкой слайд. Сдвиг слайд на сцене конфокальной микроскопии.
      4. Фокус область гипокотиля (с 20х или 40х объективом) с использованием светлого поля (белый свет) освещение. Затем сканировать слайды для флуоресценции.
      5. Возьмите изображения в течение как минимум 10 комплектов, и сравнить два фона, проверяя степень движения красителя с точки погрузки.
         Примечание: Мутант / сверхэкспрессии линии с измененной symplasmic движения будут показаны разные модели загрузки красителя по сравнению с диким типом Col-0.
2. Анализ уровня каллозы в Mutant / сверхэкспрессии линиями, показывающими Altered фототропным и ГРАВИТРОПИЧЕСКУЮ ответ и показывать Distinct HPTs Dye Движение COMPARред к Col-0.
   1. Подготовить анилина синий краситель мозолистый окрашивания.
      1. Сделать 1 М глицина, рН 9,5 и 0,1% (вес / объем) анилин синий в автоклавного DDH ₂ O.
      2. Сделайте буфер окрашивания путем смешивания 0,1% анилина синий и 1 М глицин в 2: 3 объемных соотношениях. Например, в течение 50 мл окрашивающего буфера, принимать 20 мл 0,1% анилина синего и 30 мл 1 М глицина. Примечание: Убедитесь, окрашивание буфера минимум 48 часов до использования и хранить его в темноте.
   2. Пятно согнута или не согнута рассаду с каллозы конкретным анилина синего красителя.
      1. Ингибировать De Novo мозолистый синтеза в процессе окрашивания, добавить конечный объем 1,5 мМ 2-дезокси-D-глюкозы (DDG) до 50 мл окрашивающего буфера.
      2. Возьмите 3-дневных этиолированных сеянцы для каллозы окрашивания (с или без ответа троповых).
      3. Нарезать рассаду из их крючками области с помощью тонких хирургических ножниц.
      4. Перенесите саженцы в небольшую чашку Петри, содержатИНГ 2 мл буфера для окрашивания, используя кончик зубочистки.
      5. Инкубируйте рассаду с красильной буфером в темноте в течение 2 ч при непрерывном встр хивании при 30 оборотах в минуту.
      6. После окрашивания, промойте рассаду с DDH ₂ O в течение 2 мин для удаления избытка буфера окрашивания.
      7. Выберите как минимум 5 саженцев для каждого фона растений для наблюдения под конфокальной лазерной сканирующей микроскопии.
   3. Подготовка образцов для конфокальной микроскопии:
      1. Перенесите саженцы в комплекте (один Col-0 + один мутант) для очистки микроскопа скользит после мытья с DDH ₂ O.
      2. Добавить 100-150 мкл DDH ₂ O и накрыть крышкой слайд. Сдвиг слайд на сцене конфокальной микроскопии.
      3. В лазерном канале, установите длину волны 405 нм для конкретного возбуждения и от 500 до 550 нм излучения для визуализации анилина синей флуоресценции.
      4. Принесите регион гипокотиля в центр внимания, сначала с 10х и поздног с 20х или 40х объективов с использованием светлого поля (белый свет) освещения.
      5. Затем включите фильтрованный свет, сканирование слайдов для флуоресценции, а также сохранять изображения.
      6. Измерьте интенсивность сигнала каллозы с программным обеспечением ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/index.html~~HEAD=pobj) (рисунок 4).
         1. Изменение формата конфокальной микроскопии изображений от Olympus Image двоичном формате (* .oib) в формат JPEG. Примечание: только формат JPEG поддерживается программным обеспечением ImageJ.
         2. Запустите программу ImageJ двойным щелчком (рис 4а). Примечание: Стрелки указывают инструмент прямоугольника для использования при измерении интенсивности мозолистый (фиг.4В).
         3. Нажмите кнопку "файл" , за которой следует Подвариант "открытой" в панели инструментов ImageJ и открытых изображений микроскопии , которые были сохранены в формате файла JPEG для измерения интенсивности каллозы (рис 4в).
         4. Нажмите прямоугольный значок на ИмаПанель geJ (Рисунок 4D).
         5. Для анализа интенсивности сигнала, переместите курсор мыши на изображение и выберите область для сканирования (рисунок 4E)
         6. Измерьте и запишите численные значения интенсивности сигнала, нажав 'M' на клавиатуре (Рисунок 4E). Примечание: Файл результат будет открыть отдельно (рис 4F).
         7. Измерьте и запишите значения интенсивности по одному для всех сеянцев от каждого фона растений.
            Примечание: В ImageJ, файл результата "Среднее" указывает на интенсивность сигнала выбранной "Area".
      7. Скопируйте средние значения из файла результатов ImageJ и вставить в файл электронной таблицы для количественного анализа.
      8. Для количественного анализа, сделать столбчатого диаграмму с статистических тестов, включая стандартные погрешностями и значений вероятности (рисунок 4).
         1. Измеряется средняя интенсивность сигнала(среднее значение от ImageJ) для каждого фона , используя таблицу "формул" инструмент (рис 4G).
         2. Анализировать стандартное отклонение между повторами для каждого измерения с использованием электронных таблиц "формул" инструмент (рис 4G).
         3. Вычислить стандартную ошибку (SE) с помощью thespreadsheet "формул" инструмент.
            Примечание: SE = s / √ п, где (s) является стандартное отклонение населения, и (п) размер (число наблюдений) образца.
         4. Проверка значимости результатов путем применения критерия Стьюдента к средней интенсивности сигнала и стандартных значений ошибки, вычисленных, как указано выше.
         5. Нарисуйте диаграмму гистограммы , используя приведенные выше значения для графического представления количественное различие в уровне каллозы между двумя различными уровнями подготовки с использованием электронных таблиц "вставки" инструмент (рис 4H).
            Примечание: Мутант / сверхэкспрессии линии сильных кандидатов будет sкак различные уровни каллозы по сравнению с диким типом, например, не каллозы, мало каллозы или гипер накопления PD каллозы.

Результаты

В текущей настройке, дексаметазона (DEX) -inducible RNAi линии AtGSL8 [далее dsGSL8 (+ Dex / -dex)] были использованы, так как гомозиготный gsl8 вставки Т-ДНК мутантов рассада летальный ^18. Три-дневных этиолированных сеянцы dsGSL8 и диких саженцев типа с ± DEX подвергались фототропным и ГРАВИТРОПИЧЕСКУЮ раздражители. Мы обнаружили , что dsGSL8 (+ Ловкость) саженцы были дефектными в фототропизма и геотропизм ^15. Ри...

Обсуждение

В этой рукописи, стратегия скрининга мутант / сверхэкспрессии линии, которые неполноценный в фототропным и ГРАВИТРОПИЧЕСКУЮ ответов в связи с изменившейся PD каллозы и, следовательно, PD SEL подробно описан. PD синтез мозолистый и деградация в основном осуществляется путем каллозы синтазы и бета-1,3-глюканазы, но регулирование этих ферментов контролируется многими факторами, вверх по течению. Для поиска таких факторов вверх по течению или кандидатов, которые непосредственно участвуют в регуляции ПД, мы создали этот мето...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
HPTS (8-гидроксипирен-1,3,6-трисульфоновая кислота тринатриевая соль)	Sigma	H1529-1G	Флуоресцентный краситель в качестве симплазматического индикатора
LE Agarose	Dongin-Genomic	GEL001-500G	Используется для агарозного блока HPTS
Микроволновая печь	LG-Goldstar		Машина для кипячения агарозного геля
100 мл стеклянная коническая колба	Dong Kwang	A0205	Используется для кипячения HPTS агарозы гелевая
чашка Петри (35 мм x 10 мм)	SPL медико-биологические науки	SPL10035	Используется для изготовления агарозных блоков HPTS и промывки образцов растений
Предметные стекла и предметные стекла для микроскопа (24 мм x 50 мм)	Marienfeld Лабораторная посуда	101222	используется для агарозных блоков HPTS и микроскопической пробоподготовки
MS средние пластины 125 мм x 125 мм x 20 мм	SPL медико-биологические	науки SPL11125	Пластины для изготовления MS агар средний
	Ножницы Германия Нержавеющая сталь	HSB 942-11	Используется для вырезания крючковой области образцов растений
Мурашиге и Скуг (МС) смесь базальной соли	Дючефа	П10453.01	МС среда с витаминами.
(N-морфолино) этансульфоновая кислота (MES) моногидрат	Bioshop	3G30212	Для изготовления MS сред.
Растительный агар	Duchefa	P1001.1000	Для затвердевания MS сред.
Автоклав	ALP	CL-40L
Шейкер	Wise Mix	SHO-1D	Для спокойного смывания анилинового синего буфера окрашивания и красителя HPTS.
1 мл синие наконечники	Sorenson	10040
1 мл пипетка	BioPette	L-1101-2
Хирургическая лента	MIcropore	1530-0	Для герметизации пластины MS
Анилиновый синий (метиловый синий)	Sigma	M5528-25G	Используется для приготовления анилинового синего окрашивающего буфера.
Глицин	Bioshop	GLN001	Используется для приготовления анилинового синего окрашивающего буфера.
DDG	Sigma	D8375-1G	Используется для ингибирования каллозных синтаз.
Конфокальный микроскоп	Olympus	FV1000MPE SIM	Для проверки анилинового окрашивания синим и результата загрузки красителя HPTS.
Мешалка	I lab	K400	Для смешивания сред раствор.
Алюминиевая фольга	SW для приготовления		пищи Для упаковки тарелок в темное состояние.
Гипохлорит натрия	Самджин Промышленность		Для поверхностной стерилизации семян