Method Article

Одновременная Двухфотонное В Vivo Визуализации синаптических входов и Постсинаптических цели в коре головного мозга мыши ретроспленальной

DOI:

10.3791/53528

⸱

March 13th, 2016

 ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Cellular Neuroscience, Nencki Institute of Experimental Biology, 2Department of Biochemistry, Nencki Institute of Experimental Biology, 3Neurobiology Centre, Nencki Institute of Experimental Biology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это видео показывает процедуру трепанации черепа, которая позволяет хронически визуализировать нейроны в ретроспленальной коре мыши с использованием двухфотонной микроскопии in vivo в трансгенной линии Thy1-GFP. Этот подход сочетается с введением аденоассоциированного вируса, экспрессирующего mCherry, в дорсальный гиппокамп. Эти методы позволяют проводить долгосрочный мониторинг структурной пластичности в РСК в зависимости от опыта.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это видео показывает процедуру трепанации черепа, которая позволяет хронически визуализировать нейроны в ретроспленальной коре (RSC) мыши с использованием двухфотонной микроскопии in vivo в трансгенной линии мышей Thy1-GFP. Такой подход позволяет исследовать корреляцию поведенческих манипуляций с изменениями морфологии нейронов in vivo.

Считалось, что процедура имплантации черепных окон ограничена только легкодоступными областями коры головного мозга, такими как поле бочки. Наш подход позволяет визуализировать нейроны в высоковаскуляризированных РСК. RSC является важным элементом мозговой цепи, отвечающим за пространственную память, ранее считавшийся проблематичным для двухфотонной визуализации in vivo.

Имплантация краниального окна через RSC сочетается с инъекцией рекомбинантного аденоассоциированного вируса mCherry (rAAVmCherry) в дорсальный гиппокамп. Экспрессированный mCherry распространяется на аксональные проекции от гиппокампа к RSC, что позволяет визуализировать изменения как в пресинаптических аксональных бутонах, так и в постсинаптических дендритных шипах в коре головного мозга.

Этот метод позволяет осуществлять долгосрочный мониторинг структурной пластичности в RSC, зависящей от опыта.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Двухфотонное микроскопии революцию в наблюдении активности мозга в живых и ведет себя животных. С момента своего появления в 1990 году она быстро завоевала популярность и в настоящее время осуществляется в качестве одного из наиболее интересных и инновационных подходов к рассмотрению многочисленных аспектов деятельности мозга в естественных условиях 1,2. Эти приложения включают в себя измерения кровотока, нейронную активацию (например, с использованием индикаторов уровня кальция или непосредственных ранних генов экспрессии) и морфологии нервных клеток. Все большее число лабораторий используют два фотонных микроскопов, реализующие технику ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все экспериментальные процедуры, описанные ниже, были одобрены локальными этическими комитета на Nencki Института экспериментальной биологии Польской академии наук по.

Примечание: Некоторые сцены в связанном видео ускоряются. Коэффициент скорости указывается в этих сценах.

1. Хирургия Подготовка

  1. Стерилизовать все инструменты, стеклянные контейнеры для жидкостей и ватные тампоны в автоклаве. Используйте перчатки выдаваемые. Очистите операционный стол, стереотаксической рамы и все окружающее пространство с 70% этанола. Используйте стерильную хирургическую площадку для создания стерильного пространства....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Экспрессия GFP в субпопуляции нейронов в репортерной мыши Thy1-GFP позволяет в естественных изображений корковых дендритов и аксонов местных выступов в ОПЗ. На рисунке 1А показывает максимальный выступ стек изображений с несколькими GFP-положительных дендритов видимых. Тело клетки затемняется артерии. Фигура 1В показывает одну плоскость увеличенное изображение (цифровой зум 3x) дендритной ветви , указанной в 1А. Подробная информация о дендритной.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В настоящей работе мы приводим протокол для одновременного двухфотонного в естественных изображений синаптических входов и постсинаптических мишеней в RSC через черепной окно. Процедура имплантации состоит из нескольких основных этапов. Во-первых, животное глубоко под наркозом и фиксируется в стереотаксической рамы, то череп над RSC разбавлена ​​с дрелью вдоль отмеченных круговых линий и круговая кость удалена. После того, как кровотечение остановлено, rAAV2 / 1 mCherry впрыскивается в гиппокампе, и .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы (KL, MR, KR), имеют право на подана заявка на патент (PL410001) для держателя кадра, используемого в этой статье.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы хотели бы поблагодарить М. Steczkowski для записи голоса, М. Borczyk для рисунков, А. Trąbczyńska для производства вируса, M. Ziókowska для генотипирования и А. Mirgos за помощью съемок. КР признает своеобразным подарком рекомбинантного адено-ассоциированный вирус (Раав), выражающая флуоресцентный белок mCherry под контролем промотора CaMK от К. Дейссерот. Этот проект был осуществлен на основных объектах лаборатории животных моделей и лаборатории тканевой структуры и функции, Центр нейробиологии, Nencki Института экспериментальной биологии, с использованием инфраструктуры СЕРТ, финансируемой Европейским Союзом - Европейский фонд регионального развития в рамках....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
<сильно>препарат
изофлуранБакстера8DG96235-2% перед операцией
ИзофлуранБакстера8DG96231,5-2% во время операции
ДексаметазонСкан ВетДексазон 2мг/мл0,2 мг/кг внутримышечно
БайтрилБайер2,50%5 мг/кг подкожно
ТолфединВетохинол4%4 мг/кг подкожно
БутомидорРихтер Фарма10 мг/мл2 мг/кг подкожно
КарпрофенKRKA-PolskaRycarfa 50мг/мл10 мг/кг подкожно
ЛидокаинJelfaLignocainumместно
ЛидокаинJelfa20 мг/гместно местно
Surgery
GelfoamEthiconSpongostan dental; REF MS0005
Глазная мазьDedraLubrithalместно
CA клейPelikan Daniel20G Huste
Dental акрилSpofaDentalDuracryl Plus
Stereotaxic frameStoelting51500D
Tool
CoverglassHarvard АппаратHSE-64-0720диаметр 3 мм
Бормашинастоматологическая SigmedKeystone KVet
Фиксирующая планкаИзготовленные на заказН/ДМ2 или М3 Винтовые гайки могут быть использованы
ЩипцыRenexPN-7B-SA
МикроножницыFalconBM.183.180
Микроскоп для рассеченияKOZOXTL6445T
Imaging
HolderИзготовленная на заказН/Д
Двухфотонный микроскопZeissUpright Axio Examiner Z1Лазерный блок: Когерентный хамелеон 690-1040 нм с оптическим параметрическим генератором 1050-1300 нм. Задачи: EC-PLAN-NEUFLUAR 10x/0.1 и LD Plan-APOCHROMAT 20x/1.0. Обнаружение: полосовые фильтры Zeiss BP 500-550 (GFP) и BP 570-610 (mCherry), разделенные светоделителем на длине волны 560 нм и соединенные с двумя фотодетекторами GaAsP.
<сильный>реагент
вирусрекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV) K. Deisseroth, экспрессирующего флуоресцентный белок mCherry под контролем промотора CaMK
в подарок от

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Grutzendler, J., Gan, W. B. Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain. NeuroRx. 3, 489-496 (2006).
  2. Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Two photon ImagingRetrosplenial CortexCranial Window ImplantationAAV InjectionThy1 GFP MicemCherry ExpressionHippocampal ProjectionsDendritic Spine ImagingSynaptic Plasticity MonitoringIn Vivo Microscopy

Related Articles