Одновременная Двухфотонное<em&gt; В Vivo</em&gt; Визуализации синаптических входов и Постсинаптических цели в коре головного мозга мыши ретроспленальной

Краткое содержание

Это видео показывает процедуру трепанации черепа, которая позволяет хронически визуализировать нейроны в ретроспленальной коре мыши с использованием двухфотонной микроскопии in vivo в трансгенной линии Thy1-GFP. Этот подход сочетается с введением аденоассоциированного вируса, экспрессирующего mCherry, в дорсальный гиппокамп. Эти методы позволяют проводить долгосрочный мониторинг структурной пластичности в РСК в зависимости от опыта.

Аннотация

Это видео показывает процедуру трепанации черепа, которая позволяет хронически визуализировать нейроны в ретроспленальной коре (RSC) мыши с использованием двухфотонной микроскопии in vivo в трансгенной линии мышей Thy1-GFP. Такой подход позволяет исследовать корреляцию поведенческих манипуляций с изменениями морфологии нейронов in vivo.

Считалось, что процедура имплантации черепных окон ограничена только легкодоступными областями коры головного мозга, такими как поле бочки. Наш подход позволяет визуализировать нейроны в высоковаскуляризированных РСК. RSC является важным элементом мозговой цепи, отвечающим за пространственную память, ранее считавшийся проблематичным для двухфотонной визуализации in vivo.

Имплантация краниального окна через RSC сочетается с инъекцией рекомбинантного аденоассоциированного вируса mCherry (rAAV^mCherry) в дорсальный гиппокамп. Экспрессированный mCherry распространяется на аксональные проекции от гиппокампа к RSC, что позволяет визуализировать изменения как в пресинаптических аксональных бутонах, так и в постсинаптических дендритных шипах в коре головного мозга.

Этот метод позволяет осуществлять долгосрочный мониторинг структурной пластичности в RSC, зависящей от опыта.

Введение

Двухфотонное микроскопии революцию в наблюдении активности мозга в живых и ведет себя животных. С момента своего появления в 1990 году она быстро завоевала популярность и в настоящее время осуществляется в качестве одного из наиболее интересных и инновационных подходов к рассмотрению многочисленных аспектов деятельности мозга в естественных условиях ^1,2. Эти приложения включают в себя измерения кровотока, нейронную активацию (например, с использованием индикаторов уровня кальция или непосредственных ранних генов экспрессии) и морфологии нервных клеток. Все большее число лабораторий используют два фотонных микроскопов, реализующие технику на протяжении всего научного мира в качестве нового стандарта для естественных изображений мозга в.

Стандартный подход включает в себя имплантацию черепной окна (круглое отверстие в черепе , покрытом покровным стеклом) над стволом или зрительной коре головного мозга мыши ^3. Далее, в зависимости от протокола эксперимента, в МОДSE претерпевает ряд визуализации и поведенческих тренировок, что позволяет отслеживать изменения в активности мозга и нервных клеток с течением времени морфологии ^4,5. В обоих случаях краниотомия влияет только на теменной кости, не пересекая швы. Он в значительной степени полагают, что основным недостатком этого метода является ограниченное применение в легко доступных кор, таких как ствол или зрительной коры. Имплантация черепной окна по сравнению с другими регионами создает много трудностей, из-за чрезмерного кровотечения и / или пространственное препятствие.

В данной работе мы предлагаем имплантацию черепной окна над ретроспленальной коры (RSC) в качестве еще ​​одной возможной области , представляющей интерес для двухфотонного в естественных условиях микроскопии ^6. RSC является важным элементом схемы головного мозга, ответственных за формирование пространственной памяти. Анатомически, RSC является частью нейронной сети , соединяющей корковых, гиппокаппальных и таламуса регионов ^7. этоактивно участвует в различных поведений, таких как пространственное обучение и исчезновения, а также пространственной навигации ^6.

Для того , чтобы визуализировать морфологические изменения нейронов мы используем трансгенной линии мышей , выражающую зеленый флуоресцентный белок (GFP) под промотором Thy1. У этих мышей GFP выражается в примерно 10% нейронов в головном мозге , позволяющих четкой визуализации корковых аксонов и дендритов с использованием двух-фотонной микроскопии ^8. Еще одно новшество , что мы предлагаем является введение рекомбинантного адено-ассоциированный вирус серотипа 2/1 (rAAV2 / 1) , кодирующего красный флуоресцентный белок (mCherry) под нейрон конкретных CaMKII промотора ⁹ в более глубокие структуры головного мозга , выступающими в RSC , такие, как гиппокамп. Выражение rAAV2 / 1 ^mCherry в гиппокампе Thy1-GFP мыши позволяет одновременно визуализации пре- и постсинаптических элементов hippocampo-corticaл синапсы ^10. Раав инициативе выражение mCherry требует от двух до трех недель для белок, чтобы достичь достаточного уровня в аксонов терминалов. Этот период соответствует обычному времени, необходимого для восстановления после краниотомии.

Протокол

Все экспериментальные процедуры, описанные ниже, были одобрены локальными этическими комитета на Nencki Института экспериментальной биологии Польской академии наук по.

Примечание: Некоторые сцены в связанном видео ускоряются. Коэффициент скорости указывается в этих сценах.

1. Хирургия Подготовка

1. Стерилизовать все инструменты, стеклянные контейнеры для жидкостей и ватные тампоны в автоклаве. Используйте перчатки выдаваемые. Очистите операционный стол, стереотаксической рамы и все окружающее пространство с 70% этанола. Используйте стерильную хирургическую площадку для создания стерильного пространства для всех стерилизованного оборудования. Вырезать Gelfoam на мелкие кусочки и замочить их в стерильном физиологическом растворе.
   Примечание: В соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных, этанол не является ни стерилизующего, ни дезинфицирующее высокого уровня. Его следует использовать только в качестве очистки / обезжиривания агента по предварительно стерилизованных поверхностей.
2. Поместите животное в гое индукции камеры и установить уровень изофлуран до 5% и поток кислорода до 2 л / мин. Эта процедура должна занять около 3 мин.
3. Возьмите животное из индукции камеры. Используйте хвост или палец ноги щепотки для того, чтобы гарантировать, что животное полностью успокоительное.
4. Используя точный триммер бреют волосы от задней части головы (между ушами) до глаз.
5. Поместите животное в стереотаксической рамы и стабилизировать голову с ушными решеткой.
6. Установить анестезии уровни 1,5-2% изофлуран и 0,3 л / мин кислорода.
7. Нанесите мазь для глаз.
8. Вводят животным подкожно Tolfedine (4 мг / кг), Butomidor (2 мг / кг) и Baytril (5 мг / кг), чтобы предотвратить воспаление, боль и инфекции, соответственно.
9. Вводят животным внутримышечно дексаметазон (0,2 мг / кг), чтобы предотвратить набухание головного мозга.
   Примечание: Можно вводить дексаметазон подкожно или внутрибрюшинно , чтобы предотвратить повреждение мышц.
10. Очистите кожу с помощью Sterile ватные тампоны с последующим Бетадин 70% этанола.
11. Измените перчатки и распылите их с 70% -ным этанолом.
    Примечание: При использовании одноразовых перчаток не прикасайтесь к стерильное поле. Нажмите на животное только с кончиков стерильных хирургических инструментов и стерильных тампонов.

2. Черепно Окно хирургии

1. Подтяжка кожи пинцетом и с помощью микро ножницы надрезать кожу в горизонтальном направлении вдоль основания головы, а затем наклонно к передней точке между глазами. Снимите крышку кожи.
2. Нанесите мазь лидокаина со стерильным тампоном на надкостницу, чтобы предотвратить чрезмерное кровотечение и боль.
3. Используйте стерильные ватные тампоны или скальпель, чтобы удалить надкостницы. Сушат череп с стерильных тампонов.
4. Использование стерильной иглой применять плотную цианакрилатный клей по краям кожи, чтобы обездвижить их и предотвратить от контакта с зубным цементом. Подождите, пока клей высохнуть.
5. Положите стерильную 3 мм покровного стекла над тон кпереди череп ламбдовидного швом. Сосредоточьте покровное в RSC координаты: AP, брегма -2,8; ML, брегмы 0. Взять покровное края, царапая поверхность черепа стерильной иглой. Поместите покровного стекла обратно в стерильный контейнер с 70% -ным этанолом.
6. Используйте высокоскоростной бормашины с малым заусенцев диаметром очертить круг диаметром 3 мм. Очистите место бурения от костной пыли стерильным физиологическим раствором, опускают мазков. Используйте Gelfoam и тампоны, чтобы остановить кровотечение иногда и очистить кости.
7. В перерывах между бурением проверить толщину кости с тонким пинцетом, осторожно касаясь круг костей и проверяя его подвижность. Имейте в виду, что кости толще на площади шовного материала в. Прекратить бурение, когда кость круг подвижен и только равномерным тонким слоем кости оставляют на окружности. Очистите поле оперативной всей оставшейся костной пыли с засоленных погружают мазков.
8. Отбросьте стерильного физиологического раствора на участке бурения, покрывая пробурена CIRНКУ. Осторожно отогните костный круг с тонким пинцетом, а затем осторожно, но твердо удалить кости, подняв его вверх. Будьте осторожны, чтобы не искажать круг кости при подъеме его, чтобы предотвратить возможные повреждения твердой мозговой оболочки.
9. Осторожно применять Gelfoam смоченную в стерильный физиологический раствор на твердую мозговую оболочку, чтобы помочь остановить кровотечение. Подождите, пока все кровотечение полностью не прекратилось. Осторожно удалите Gelfoam, чтобы не нарушить процесс свертывания крови.
   Примечание: Область Шов насыщена сосудами, поэтому кровотечение в этот момент может оказаться глубоким. Крайне важно, чтобы дождаться времени, достаточного для кровотечение полностью остановить. Полезно держать солевым пропитанной Gelfoam остудить, поместив его на льду.

3. Вирус Инъекции

1. Прикрепите инфузионный насос к стереотаксической башни и подключить контроллер.
2. Вставьте иглу 35G в шприц. Промывка шприца в 10 раз с этанолом, чтобы стерилизовать и в 10 раз стерильным физиологическим раствором, чтобы удалить следы еthanol. Удалить пузырьки воздуха из шприца. Вставьте шприц в насос.
   Примечание: Рассмотрите возможность использования других дезинфицирующих средств.
3. Оттепель разовая доза rAAV2 / 1 препарата ^mCherry (рекомендуется 10 ¹² КОЕ) и держать его на льду. Заполните шприц с раствором вируса.
4. Сосредоточьте иглу на темени, а затем аккуратно вставить в гиппокампе, используя следующие координаты: AP -2, ML +/- 1,0, DV -1. Эти координаты будут располагаться вблизи края трепанации. Подождите в течение 5 мин для стабилизации ткани.
5. Вводят 0,7 мкл раствора rAAV2 / 1 ^mCherry со скоростью 50 л / мин. Подождите 10 минут для вируса полностью адсорбировать. Аккуратно удалите иглу. Промокните Gelfoam, если происходит кровотечение. Повторите с контралатеральной сайта.

4. Черепно Окно Имплантация

1. Уложить стерильный, сушеной покровного стекла на верхней части твердой мозговой оболочки в просверленное круг кадр. Держите покровного стекла с ForcEPS аккуратно придавить твердую мозговую оболочку и принести покровного стекла 'края ближе к поверхности черепа.
   Примечание: Возможно , что покровного стекла разрушает тромб и кровотечение возобновляется. Если это так, поднимите покровного стекла, поместите его в спирте, сухой и вернуться к шагу 2.9.
2. Использование стерильной иглой применять плотный цианакрилатный клей на края покровного стекла, чтобы прикрепить их к черепу. Подождите, пока клей высохнуть.
3. Поместите фиксирующую планку (M2 гайку или выполненный на заказ дизайн) в передней части черепа. Нанесите цианакрилатный клей по краям панели. Подождите, пока клей высохнуть.
   1. Поместите планку фиксации в положении, которое позволит горизонтальное позиционирование черепной окна во время сеанса визуализации. Поместите его как можно дальше от окна. Если он расположен слишком близко к окну, бар и винт связывая его с заказного держателя может представлять как препятствие для объектива во время процесса формирования изображения.
Подготовьте зубной акрил и применять его на поверхности черепа вокруг стекла. Полезно, чтобы сформировать кратерообразные форму вокруг окна. Это создаст полость для воды применяется в дальнейшем для визуализации с целью воды.
4. Создать колпачок с зубной акрила, покрывающий остальную часть рабочей зоны, края кожи, фиксации панели, усиливая кратер вокруг черепа окна. Подождите, пока зубной цемент затвердеет.
5. Удалить животное от стереотаксической рамы и поместить его в камеру восстановления.
6. Подождите, пока животное, чтобы оправиться от операции, соблюдая физиологические функции.
7. Применение послеоперационную анальгезию (карпрофен, 10 мг / кг) и лечение антибиотиками (Baytril, 5 мг / кг) в течение 48 часов.

5. обработки изображений

1. Начало Ti: Sapphire лазер, мощностью до микроскопа. Система, используемая в этом эксперименте оснащен двухфотонного лазера, система ОРО и двойной GaAsP ФЭУ.
2. Поместите животное в inducции камеры и вызывают анестезию.
3. Удалить животное от индукции камеры и места в противогазе анестезии под микроскопом. Уменьшение расхода кислорода до 0,3 л / мин и изофлуран концентрации 1,5-2%.
4. Зафиксируйте животное в пользовательский корпуса микроскопа с помощью винта M2 (или другой пользовательской системы). Уровень черепной окно.
   Примечание: Можно использовать систему фиксации головки производителя микроскопа, хотя конкретный пользовательский кадр дает лучшие результаты (улучшенную стабильность головки, постоянное позиционирование в нескольких сеансов во время хронического эксперимента).
5. Использование Widefield настройки микроскопа и низкий коэффициент увеличения объективный центр взгляд на одной из сторон ретроспленальной коры и сфокусировать его на поверхности покровного.
6. Нанесите каплю воды в кратер типа акрилового скважины. Переключение на большие расстояния цели погружения в воду. Передвигайте цель к черепной окна, пока вода мениска Connects образца и цель.
7. Переход к настройкам двухфотонными и начать сканирование верхней образца вниз, используя наименьшее увеличение. Пересечение твердой мозговой оболочки будет виден как блики высокой неспецифической сигнала.
8. Настройка параметров приобретения микроскопа в обоих каналах (GFP и mCherry) в соответствии с уровнем сигнала от флуоресцентных клеток для того, чтобы охватить весь динамический диапазон.
9. После нахождения подходящего нейрон (с дендритной дерева, отделенной от других клеток) выполнить первоначальное сканирование с использованием только GFP filterset с наименьшим увеличением и г-на расстоянии 5 мкм.
10. Получить максимальную проекцию отсканированного стека и распечатать его для аннотаций (с использованием перевернутых цветов).
11. Установите масштаб на значение, которое позволит изображению желаемые морфологические детали. Изображение весь дендритные дерево в каналах и GFP mCherry с использованием максимальной проекции в качестве руководства.

Результаты

Экспрессия GFP в субпопуляции нейронов в репортерной мыши Thy1-GFP позволяет в естественных изображений корковых дендритов и аксонов местных выступов в ОПЗ. На рисунке 1А показывает максимальный выступ стек изображений с несколькими GFP-положительных дендритов видимых. Тело клетки затемняется артерии. Фигура 1В показывает одну плоскость увеличенное изображение (цифровой зум 3x) дендритной ветви , указанной в 1А. Подробная информация о дендритной...

Обсуждение

В настоящей работе мы приводим протокол для одновременного двухфотонного в естественных изображений синаптических входов и постсинаптических мишеней в RSC через черепной окно. Процедура имплантации состоит из нескольких основных этапов. Во-первых, животное глубоко под наркозом и фиксируется в стереотаксической рамы, то череп над RSC разбавлена ​​с дрелью вдоль отмеченных круговых линий и круговая кость удалена. После того, как кровотечение остановлено, rAAV2 / 1 ^mCherry впрыскивается в гиппокампе, и ...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
<сильно>препарат
изофлуран	Бакстера	8DG9623	5-2% перед операцией
Изофлуран	Бакстера	8DG9623	1,5-2% во время операции
Дексаметазон	Скан Вет	Дексазон 2мг/мл	0,2 мг/кг внутримышечно
Байтрил	Байер	2,50%	5 мг/кг подкожно
Толфедин	Ветохинол	4%	4 мг/кг подкожно
Бутомидор	Рихтер Фарма	10 мг/мл	2 мг/кг подкожно
Карпрофен	KRKA-Polska	Rycarfa 50мг/мл	10 мг/кг подкожно
Лидокаин	Jelfa	Lignocainum	местно
Лидокаин	Jelfa	20 мг/г	местно местно
Surgery
Gelfoam	Ethicon	Spongostan dental; REF MS0005
Глазная мазь	Dedra	Lubrithal	местно
CA клей	Pelikan Daniel	20G Huste
Dental акрил	SpofaDental	Duracryl Plus
Stereotaxic frame	Stoelting	51500D
Tool
Coverglass	Harvard Аппарат	HSE-64-0720	диаметр 3 мм
Бормашина	стоматологическая Sigmed	Keystone KVet
Фиксирующая планка	Изготовленные на заказ	Н/Д	М2 или М3 Винтовые гайки могут быть использованы
Щипцы	Renex	PN-7B-SA
Микроножницы	Falcon	BM.183.180
Микроскоп для рассечения	KOZO	XTL6445T
Imaging
Holder	Изготовленная на заказ	Н/Д
Двухфотонный микроскоп	Zeiss	Upright Axio Examiner Z1	Лазерный блок: Когерентный хамелеон 690-1040 нм с оптическим параметрическим генератором 1050-1300 нм. Задачи: EC-PLAN-NEUFLUAR 10x/0.1 и LD Plan-APOCHROMAT 20x/1.0. Обнаружение: полосовые фильтры Zeiss BP 500-550 (GFP) и BP 570-610 (mCherry), разделенные светоделителем на длине волны 560 нм и соединенные с двумя фотодетекторами GaAsP.
<сильный>реагент
вирус	рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV) K. Deisseroth, экспрессирующего флуоресцентный белок mCherry под контролем промотора CaMK

в подарок от