К экспериментальной проверке активности энхансера лучше всего подходит анализ потери функции. Здесь представлен эффективный протокол, который использует CRISPR/Cas9-опосредованную делецию для изучения аллель-специфической регуляции транскрипции генов в клетках F1 ES, которые содержат гибридный геном (Mus musculus129 x Mus castaneus).
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Создание CRISPR / cas9 опосредованного моноаллельной Пропуски для изучения Enhancer Функция в эмбриональных стволовых клетках мышей
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Энхансеры контролируют идентичность клеток, регулируя экспрессию тканеспецифичных генов независимо от положения и ориентации. Эти энхансеры часто расположены дистальнее регулируемого гена в межгенных областях или даже в теле другого гена. Позиционно-независимый характер активности энхансеров затрудняет сопоставление энхансеров с генами, которые они регулируют. Делеция энхансерной области дает прямое доказательство активности энхансера и является золотым стандартом для выявления роли энхансера в эндогенной транскрипции генов. Традиционные методы делеции, основанные на гомологичной рекомбинации, были превзойдены последними достижениями в технологии редактирования генома, которые позволяют быстро и точно локализовать изменения в геномах многочисленных модельных организмов. Опосредованное редактирование генома CRISPR/Cas9 может быть использовано для быстрого и экономичного манипулирования геномом многих типов клеток и организмов благодаря легкости, с которой Cas9 может быть нацелен на геном с помощью направляющей РНК из специальной экспрессирующей плазмиды. Гомозиготная делеция основных регуляторных элементов генов может привести к летальности или изменению клеточного фенотипа, в то время как моноаллельная делеция транскрипционных энхансеров позволяет изучать цис-регуляцию экспрессии генов без этой смешанной проблемы. Здесь представлен протокол CRISPR/Cas9-опосредованной делеции в эмбриональных стволовых клетках (ES) мыши F1 (Mus musculus129 x Mus castaneus). Моноаллельная делеция, скрининг и анализ экспрессии облегчаются однонуклеотидными полиморфизмами (SNP) между двумя аллелями, которые встречаются в этих клетках в среднем каждые 125.о.
Введение
Транскрипциональные регуляторные элементы имеют решающее значение для пространственно-временной тонкой настройки экспрессии генов в процессе развития 1 и модификации этих элементов может привести к болезни из - за аберрантной экспрессии генов 2. Многие болезни ассоциированные регионы , выявленные генома широких исследований ассоциации в некодирующих регионах и имеют особенности транскрипционных энхансеров 3-4. Идентификация и улучшающие сопоставления их с генами , которые они регулируют затруднено , поскольку они часто расположены несколько т.п.н. от генов , которые они регулируют и могут быть активированы в порядке 5-6 тка....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Проектирование и Построение gRNA
- Для удаления транскрипционных энхансеров регионы используют два gRNAs, один 5 'и 3' один из интересующей области. Используйте дорожку генома мыши браузера УСК , порожденную лаборатории Чжан , чтобы идентифицировать уникальные последовательности gRNA (http://www.genome-engineering.org 15). Затем проверить эти gRNAs и прилегающие к ним РАМ для ОНП и вставкам с помощью онлайн - инструментов , предоставляемых Sanger Institute (www.sanger.ac.uk/sanger/Mouse_SnpViewer/rel-1211~~HEAD=pobj) 27-28. Чтобы настроить таргетинг на оба аллеля с одинаковой эффективностью, избегать / ПАМ последовательностей....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Протокол , описанный здесь использует клетки F1 ES для изучения цис -regulation экспрессии генов в моноаллельной усиливающих удалены клеток , полученных с помощью CRISPR / редактирования генома cas9 (Рисунок 1). GRNA и дизайн праймера аллель-специфической для генотипирования и экспрессии генов являются ключевыми факторами в этом подходе. Каждый набор праймеров аллельспецифической должно быть подтверждено кПЦР для подтверждения аллель специфичности. Аллель-специф.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
CRISPR / cas9 технологии редактирования опосредованный геном обеспечивает простой, быстрый и недорогой способ для модификации генома. Подробно здесь, чтобы генерировать и анализировать моноаллельную энхансер для удаления функционального энхансер характеризации метод использует ОНП в клетках F1 мыши. Преимущества такого подхода являются: 1) моноаллельную энхансер делеции не производят искажающие эффекты , которые возникают , когда критическое энхансер удаляется из обоих аллелей, то есть большое сокращение уровне.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы читали политику Jove о конфликте интересов и не имеют никаких конфликтов раскрывать.
Благодарности
Мы хотели бы поблагодарить всех участников лаборатории Митчелла за полезные обсуждения. Эта работа была поддержана Канадским институтом исследований в области здравоохранения, Канадским фондом инноваций и Министерством исследований и инноваций Онтарио (операционные и инфраструктурные гранты, предоставленные JAM).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Высокоточная ДНК-полимераза | NEB | M0530S | высокоточная ДНК-полимераза, используемая в сборке гРНК |
| Gibson Assembly Master Mix | NEB | E2611L | |
| gRNA_Cloning вектор | Addgene | 41824 | В этот вектор клонируется последовательность-мишень для создания плазмиды гРНК |
| pCas9_GFP | Addgene | 44719 | Кодон-оптимизированные SpCas9 и EGFP ко-экспрессия плазмида |
| AflII | NEB | R0520S | |
| EcoRI | NEB | R3101S | |
| Неоновая трансфекционная система 100 & микро; L Kit | Life Technologies | MPK10096 | технология трансфекции микропоратора |
| prepGEM | ZyGEM | PT10500 | реагент для экстракции геномной ДНК |
| Nucleo Spin Gel & PCR Clean-up | Macherey-Nagel | 740609.5 | |
| Высокоскоростной мини-набор для плазмид | Geneaid | PD300 | |
| Набор для макси-плазмид без эндотоксинов | Geneaid | PME25 | |
| SYBR селективная смесь для CFX | Life Technologies | 4472942 | реагент qPCR |
| iScript набор для синтеза кДНК | Bio-rad | 170-8891 | Реагент обратной транскрипции |
| 0,25% трипсин с ЭДТА | Life Technologies | 25200072 | |
| PBS без Ca/Mg2+ | Sigma | D8537 | |
| 0,5 M EDTA | Bioshop | EDT111.500 | |
| HBSS | Life Technologies | 14175095 | |
| 1 М HEPES | Life Technologies | 13630080 | |
| BSA фракция V (7,5%) | Life Technologies | 15260037 | |
| Max Efficiency DH5α компетентные клетки | Invitrogen | 18258012 | |
| FBS | ES клетки квалифицированы | FBS подвергается предварительному тестированию на мышиных ЭС клетках на плюрипотентность | |
| ДМСО | Сигма | D2650 | |
| Глутамакс | Инвитроген | 35050 | |
| DMEM | Life Technologies | 11960069 | |
| Карандашлин/стрептомицин | Инвитроген | 15140 | |
| Пируват натрия | Инвитроген | 11360 | |
| Заменимый аминокислота | Invitrogen | 11140 | |
| β-меркаптоэтанол | Sigma | M7522 | |
| 96-луночная пластина | Sarstedt | 83.3924 | |
| Уплотнительная лента | Sarstedt | 95.1994 | |
| CoolCell LX | Biocision | BCS-405 | контейнер для заморозки клеток без спирта |
| CHIR99021 | Biovision | 1748-5 | Ингибитор для клеточной культуры F1 ES |
| PD0325901 | Инвивоген | inh-pd32 | Ингибитор для клеточной культуры F1 ES |
| LIF | Chemicon | ESG1107 | Ингибитор для клеточной культуры F1 ES |
Ссылки
- Sagai, T., Hosoya, M., Mizushina, Y., Tamura, M., Shiroishi, T. Elimination of a long-range cis-regulatory module causes complete loss of limb-specific Shh expression and truncation of the mouse limb. Development. 132 (4), 797-803 (2005).
- Kleinjan, D. A., Lettice, L. A.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
