Мы представляем метод, чтобы изолировать взрослых орган Корти, как три неповрежденных кохлеарных поворотов (вершины, середины и основания). Мы также продемонстрировать процедуру иммуноокрашивания с флуоресцентно меченых антител. Вместе эти методы позволяют изучать волосковых клеток, поддерживающих клеток, и другие типы клеток, найденный в улитку.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Всего горе Вскрытие и Иммунофлуоресценции взрослых мышей улитки
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Орган Корти, расположенный в улитке внутреннего уха, содержит механосенсорные волосковые клетки и окружающие поддерживающие клетки, которые организованы в спиралевидную форму и имеют тонотопический градиент для обнаружения звука. Улитка мыши имеет длину около 6 мм и часто делится на три витка (вершина, середина и основание) для анализа. Для исследования потери клеток, деления клеток или экспрессии мозаичных генов полезно использовать всю монтировку или подготовку поверхности улитки. Этот метод диссекции позволяет визуализировать все клетки в органе Corti в сочетании с иммуноокрашиванием и конфокальной микроскопией для визуализации клеток в разных плоскостях по оси z. Из этих изображений z-стека также можно получить несколько оптических сечений. Кроме того, метод диссекции всего монта может быть использован для сканирующей электронной микроскопии, хотя для этого необходим другой метод фиксации. Здесь мы представляем метод выделения кортиевого органа в виде трех неповрежденных поворотов улитки (вершина, середина и основание). Этот метод может быть использован для мышей в возрасте от одной недели до взрослого возраста и отличается от метода, используемого для неонатальных образцов, где кальцификация улитки не завершена. Немного измененный вариант может быть использован для вскрытия улитки крысы. Мы также демонстрируем процедуру иммуноокрашивания флуоресцентно меченными антителами.
Введение
Спираль-образный улитка внутреннего уха, содержащиеся в височной кости, находится орган Корти, слуховой сенсорной конечного органа у млекопитающих. Улитки tonotopically организованы и обычно делится на апикальной, средней и базальной поворачивает соответствующие различным частотных областей с обнаружением звукового высокочастотного в основании и низкой частоты обнаружения в вершине 1. Клетки волос, механосенсорные клетки органа Корти, запустите длину улитки, который давно примерно 6 мм у мышей 2,3. Эти клетки преобразуют механическую энергию звуковых волн, которые передаются через заполненный жидкостью перепончатого лабиринта, в нервные сигналы,....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
О себе этика: Процедуры с участием животных предметы были одобрены Институциональные уходу и использованию животных комитета в университете Южного Иллинойса школа медицины.
1. Добыча височных костей
- Определить временные кости в основании черепа мыши 13 и соскрести черепных нервов, используя стандартную схему щипцы.
- Поместите стандартная схема щипцы на кончике слухового капсулы и большим пальцем противоположной руки надавите на задней полукружных каналов, чтобы сместить инкапсулированный улитку.
- Освободите нижнюю половину височной кости из черепа вручную с большим и указательным пальцем или с помощ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Мы представляем метод, чтобы изолировать орган Корти, как три неповрежденных кохлеарных поворотов (вершины, середины и основания) с кохлеарной ткани, которая кальцинированная, с ключевых шагов рассечение, представленных на рисунке 1. Во время первой недели постнатального развития, кальцификации мыши улитка является неполным и более простой способ вскрытия может быть использован 13. Использование новорожденных весь метод монтирования рассечение с улитки из Р7 и.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Есть несколько важных шагов для успешного всей горе вскрытии и иммунной окраски. Однако прежде любой из этих методов выполняются, собственно фиксация улитки ткани необходим. Мы рекомендуем использовать метанол бесплатно, ультра-чистое, Е. М. класса PFA. PFA изготовлен из порошка может иметь следы метанола и нестабильной рН, что снижает качество иммунофлюоресценции. Другие группы также показали, что подобные вскрытия возможно при использовании фиксаторы, которые не содержат формальдегида 14-16. Длина фик.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Эта работа была частично поддержана грантом от Управления военно-морских исследований (N000141310569). Оборудование исследовательской визуализации Медицинской школы Университета Южного Иллинойса было поддержано Национальным центром исследовательских ресурсов здравоохранения (S10RR027716).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Стандартные щипцы | Fine Science Tools | 11000-12 | можно приобрести у других поставщиков |
| Ножницы для тонкой печати 10,5 см | Fine Science Tools | 14060-11 | можно приобрести у других поставщиков |
| Микроцентрифужные пробирки 2 мл | MidSci | AVSS2000 | можно приобрести у других поставщиков |
| 16% формальдегида, без метанола, ультрачистые, ЭМ | класс Polysciences | 18814 | ТОКСИЧНЫЙ -- надевайте перчатки и не выбрасывайте в раковину. Можно приобрести у других продавцов. |
| PBS pH 7,4 | Sigma | P3813-10PAK | можно приобрести у других производителей |
| EDTA | Fisher | BP118-500 | можно приобрести у других производителей |
| Торцевой вращатель труб | Fisher | 05-450-127 | можно приобрести у других производителей |
| Чашка Петри 60 мм | Fisher | 50-202-037 | можно приобрести у других производителей |
| Dow Corning Sylgard 184 комплект | силиконового герметизатораEllsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0,5 КГ | |
| активированный уголь | Fisher | AC134372500 | можно приобрести у других производителей |
| стерео диссекционный микроскоп | Zeiss | Stemi 2000 | можно приобрести у других продавцов |
| Dumont #4 ювелирные щипцы | Fine Science Tools | 11241-30 | |
| Dumont #5 ювелирные щипцы | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Пружинные ножницы Vannas 2,5 мм | Fine Science Tools | 15001-08 | изогнутые |
| 5 мм пружинные ножницы Vannas-Tubingen | Fine Science Tools | 15003-08 | прямые |
| 48-луночные пластины | Fisher | 08-772-52 | можно приобрести у других продавцов |
| 8-луночные камерные слайды | Fisher | 1256518 | можно приобрести у других продавцов |
| Triton X-100 | Sigma | X100-500 | можно приобрести у других продавцов |
| BSA, фракция V | Fisher | BP1605 | можно приобрести у других производителей |
| NGS | Vector labs | S-1000 | можно приобрести у других производителей |
| NHS | Vector labs | S-2000 | можно приобрести у других производителей |
| 3D ротатор | Midsci | R3D-710 | можно приобрести у других производителей |
| Western blot incubation box XL | Licor | 929-97401 | |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | можно приобрести у других поставщиков |
| Удлиненный золотой защитный материал от выцветания | Life Technologies | P36930 | можно приобрести у других поставщиков, но монтажные носители различаются по своей способности защищать от фотоотбеливания |
| Superfrost Plus Slides | Fisher | 12-550-15 | можно приобрести у других поставщиков |
| покровные стекла 22 x 22 x 1 | Fisher | 12-548-B | можно приобрести у других продавцов |
| прозрачный лак для ногтей | Местная аптека | можно приобрести у других продавцов | |
| картонная папка для слайдов | Fisher | 12-587-10 | можно приобрести у других продавцов |
| пластиковая коробка для слайдов | Fisher | 03-448-10 | можно приобрести у других продавцов |
Ссылки
- Robles, L., Ruggero, M. A. Mechanics of the mammalian cochlea. Physiol Rev. 81 (3), 1305-1352 (2001).
- Ehret, G., Frankenreiter, M. Quantitattive analysis of cochlear structures in the house mouse in relation to mechanisms of acoustical information process....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
