Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Быстрое Ферментативный Обработка белков для обнаружения MS с проточный микрореакторе

7.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/53564

⸱

6 апреля 2016 г.

 ,  , 
1Biological Sciences, Virginia Tech

В этой статье

Краткое содержание

Представлен быстрый протокол для протеолитического разложения с помощью встроенного проточного триптического микрореактора, соединенного с масс-спектрометром с электрораспылением ионизации (ESI). Описана конструкция микрореактора, экспериментальная установка и процесс сбора данных.

Аннотация

Подавляющее большинство масс-спектрометрии (МС) основе методов анализа белка включают стадию переваривания ферментативная до обнаружения, как правило, с помощью трипсина. Этот шаг необходим для генерации малых пептидов молекулярной массой, как правило, с MW <3000-4000 Da, которые находятся в пределах эффективного диапазона сканирования масс-спектрометрии приборов. Обычные протоколы включают O / N ферментативного расщепления при 37 ° С. Последние достижения привели к разработке различных стратегий, как правило , связанных с использованием микрореакторе с иммобилизованными ферментами или целого ряда дополнительных физических процессов , которые уменьшают время , необходимое для протеолитического расщепления в течение нескольких минут (например, микроволновая печь или высоко- давление). В этой работе мы опишем простой и экономически эффективный подход, который может быть реализован в любой лаборатории для достижения быстрого ферментативного расщепления белка. Белок (или протеиновую смесь) адсорбируют на С18-скрепленные с обращенной фазой высокой перфорацияormance жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) частицы диоксида кремния, предварительно загруженные в капиллярной колонкой, и трипсина в водном буфере вливают над частицами в течение короткого периода времени. Чтобы включить он-лайн обнаружения MS, Триптические пептиды элюируют системой растворителей, с повышенным содержанием органических веществ непосредственно в источнике ионов МС. Такой подход позволяет избежать использования частиц дорогостоящих иммобилизованного фермента и не требует какой-либо помощи для завершения процесса. Переваривания белков и полный анализ образца может быть достигнуто менее чем за ~ 3 мин и ~ 30 мин, соответственно.

Введение

Идентификация и характеристика очищенных белков часто достигается за счет использования методов масс-спектрометрии. Белок переваривается с ферментом и его пептиды дополнительно анализируются с помощью МС с помощью простого инфузионную экспериментальной установки. Протеолитическим расщеплением необходимо для генерации небольших пептидных фрагментов, которые попадают в полезном диапазоне масс большинства анализаторов MS, и которые могут быть легко фрагментированы с помощью низкой энергии соударения индуцированной диссоциации для генерирования информации о последовательности аминокислот. Для получения изолированных белков или простых смесей белков, нет необходимости в дальнейшем хроматографического разделения пептидов до обнаружения MS. Смесь 25-50 пептидов могут быть легко проанализированы путем инфузии образца с помощью шприца непосредственно в источнике ионов МС.

Масс-спектрометр может провести анализ и подтвердить последовательность белка в течение короткого периода времени. С помощью современных методов сбора данных, этот процесс может быть достигнуто шithin несколько минут или даже секунд. Сдерживающим фактором в завершении всего процесса на коротком временном масштабе является протеолитический стадия пищеварения. Как правило, это осуществляется в течение нескольких часов (или O / N) в растворе, при 37 ° С, с использованием субстрата: ферментные соотношения (50-100): 1. Для уменьшения ферментативной время пищеварения минут или секунд, иммобилизованных микрореакторы фермента, в виде микрофлюидальных реакторов или коммерчески доступные картриджи, которые были описаны. 1-6 Как правило, фермент иммобилизован ковалентным, нековалентная / физической адсорбции, комплекс формирование или инкапсуляция, 3,6 повышенная эффективность процесса ферментативного быть включен по большой поверхности к объему и соотношения фермент-к-подложке. Дополнительные преимущества иммобилизованных реакторов включают снижение автолиза и помех от фермента в анализе MS, улучшенную стабильность фермента и возможность многократного использования. Разнообразие подходов, с использованием стекла или полимерных микроизготовленном устройств были описаны,с использованием ферментов , иммобилизованных на магнитных шариков с помощью антиген-антитело взаимодействий, 7,8 захваченный в золотых наночастиц сетей, 9 воплощен в оксид титана-оксид алюминия золь-гелей 10 и nanozeolites, 11 или захвачены в плен через Ni-NTA или Его-Таг формирования комплекса. 6 В качестве альтернативы , открытой трубчатые капилляры с иммобилизованными ферментами были разработаны, а также. 12 Кроме того, повышенная протеолитическое расщепление было продемонстрировано с помощью контролируемого микроволнового излучения 13 или давления , при содействии или под давлением технологии непрерывной цикличности (РСТ) для уменьшения времени реакции до 30-120 мин. 14

Несмотря на многочисленные преимущества иммобилизованных реакторов фермента, стоимость коммерческих картриджей высока, наличие микрофлюидальных устройств для повседневного использования ограничено, а также использование результатов микроволновые или РСТ технологии нуждаются в дополнительной аппаратуры. Цель данной работы заключалась в разработке метода, который circumveNTS эти недостатки, и которые могут быть легко реализованы в любой лаборатории, чтобы расширить возможности исследователей с простым и эффективным подходом для осуществления ферментативного расщепления белков в процессе подготовки к анализу MS в течение нескольких минут. Подход основан на использовании гидрофобных, С18-частиц, которые предварительно загружены в капилляре или микрожидком устройстве, и адсорбцию белка (ов), представляющие интерес на эти частицы с последующим ферментативным расщеплением во время инфузии фермента над уплотненный слой и захватили белок (белки). При таком подходе субстрат иммобилизованные через нековалентных взаимодействий, а фермент вливают над иммобилизованным белком. Эффективность протеолитического расщепления увеличивается на большой поверхности частиц областей, которые выставляют белок для обработки ферментативной, уменьшение расстояния и времени диффузии и из поверхности частиц, улучшается перенос массы, отсутствие ковалентное, которые могут влиять на активность фермента, способность быстро evaluatе комбинации различных ферментов, одноразовости и мультиплексированием, если процесс выполняется в микрожидком формате. Этот подход демонстрируется с использованием смеси стандартных белков и трипсин-наиболее часто используемым ферментом для протеолитического расщепления до обнаружения ESI-MS. Масс-спектрометр используется для обнаружения в данном исследовании была линейная ловушка квадрупольного (LTQ) инструмент.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Получение капилляра микрореакторе

  1. Обрежьте внутренний диаметр 100 мкм (ID) х наружный диаметр (OD) капилляра 360 мкм в длину 7-8 см, а 20 мкм ID х 90 мкм OD капиллярную 3-5 см со стеклянной капиллярной скалывателе; проверить под микроскопом, что оба капиллярные концы имеют чистый, ровный срез, без каких-либо выступающих заусенцев.
  2. Вставьте 20 мкм ID х 90 мкм OD капилляр в один конец 100 мкм ID х 360 мкм OD капилляра, при длине ~ 6 мм; в случае необходимости, соблюдать эту операцию под микроскопом.
  3. Нанесите маленькую капельку клея E6000 вокруг стыке мкм ID капилляров 90 мкм OD / 100 с концом ватной палочкой, и пусть клей лечения O / N при комнатной температуре.
  4. Вырезать 20 мкм, вставленный ID х 90 мкм OD капилляр длиной ~ 10-15 мм; это будет ионизацией электрораспылением эмиттера.
  5. Предварительно сократить 1/32 "OD PEEK, 1/16" OD PEEK и 1/16 "OD PTFE ваннаING на куски 4-5 см в длину; это будут рукава, используемые в капиллярных союзах для обеспечения подключения к герметичны.
  6. Подключите противоположный конец 100 мкм ID х 360 мкм OD капилляра к PEEK союза; использование 1/32 "PEEK рукав а для обеспечения подключения к герметичны.
  7. Вставить / затянуть кусок ~ 5 см длиной 1/16 "PTFE трубки в противоположный конец союза.
  8. Взвесить ~ 4 мг С18 (5 мкм) частиц в предварительно очищенный / сушат 2 пузырек мл стекл; добавляют 0,5 мл изопропанола, закройте пробирку и дисперсных суспензии в ванне ультразвукового дезинтегратора.
  9. Вывод с помощью 250 мкл шприца приблизительно 200 мкл суспензии, вставьте иглу шприца в "PTFE трубки из PEEK союза 1/16, и медленно дозировать суспензии в 100 мкм ID х 360 мкм OD капилляра, наблюдать под микроскопом, что и капиллярная заполняет с частицами до тех пор , длиной 2-3 мм упаковки достигается, это будет микрореактор (рис 1) 20 μ.м ID капиллярная удерживает частицы в микрореакторе через Keystone эффект. 15
  10. Ополосните микрореактор с ~ 50 мкл раствора H 2 O / CH 3 CN 50:50 об / об, а затем с ~ 50 мкл раствора H 2 O / CH 3 CN 98: 2 об / об.

2. Приготовление растворов образцов

Примечание: Операции, которые вовлекают обработки органических растворителей и кислот и приготовления раствора должны быть выполнены в вытяжном шкафу. Носите защитные очки, перчатки и защитную одежду.

  1. Ополосните CH 3 OH и высушить несколько стеклянных флаконах (4 мл) и полипропиленовые пробирки (15 мл).
  2. Приготовьте 10 мл раствора H 2 O / CH 3 CN (98: 2 об / об) в 15 мл полипропиленовую пробирку путем смешивания 9,8 мл H 2 O с 200 мкл CH 3 CN; перемешать с помощью обработки ультразвуком.
  3. Приготовьте 10 мл раствора H 2 O / CH 3 CN (50:50 об / об) в 15 мл полипропиленовую пробирку путем смешивания 5 мл H 2 </ суб> O 5 мл CH 3 CN; перемешать с помощью обработки ультразвуком.
  4. Приготовьте 4 мл подкисленного водного раствора (ТФУ 0,01% об / об) путем добавления 4 мкл TFA (10%) в 4 мл H 2 O / CH 3 CN (98: 2 об / об) в стеклянную пробирку емкостью 4 мл; перемешать с помощью обработки ультразвуком.
  5. Приготовьте 4 мл подкисленного органического раствора (ТФУ 0,01% об / об) путем добавления 4 мкл TFA (10%) в 4 мл H 2 O / CH 3 CN (50:50 об / об) в стеклянную пробирку 4 мл; перемешать с помощью обработки ультразвуком.
  6. Взвесить 16 мг NH 4 HCO 3 с аналитическим микровесов в стеклянную пробирку емкостью 4 мл; добавить 4 мл H 2 O / CH 3 CN: раствор (98 2 об / об) и дисперсных с помощью ультразвука; это приводит к 50 мМ раствора NH 4 HCO 3 (рН ~ 7,8) в водном буфере.
  7. Взвесить 5 мг стандартного белка (например, бычий сывороточный альбумин, гемоглобин α / β, цитохром С, карбоангидразы, α-2-HS-гликопротеина и т.д.) с аналитическим микровесов в стеклянную пробирку емкостью 4 мл; добавить 4 мл ДИ Wateг и рассеивать с помощью ультразвука; Как правило, это приводит к концентрации раствора высокой мкМ уровня.
  8. Готовят 1 мл раствора белка (1-2 мкм) путем разбавления раствора высокой концентрации мкМ уровне с соответствующим объемом NH 4 HCO 3 (50 мМ) водного буфера; перемешать с помощью обработки ультразвуком.
  9. Готовят раствор трипсина (5 мкМ) , при растворении 20 мкг секвенирование класса трипсина в 170 мкл NH 4 HCO 3 (50 мМ) водного буфера; рассеивать путем обработки ультразвуком.

3. Экспериментальная установка

Примечание: Система LTQ-МС оснащена модифицированным источником ESI, который включает самодельный XYZ-этап, который позволяет состыковка масс-спектрометр для различных входных выборок подходов.

  1. Отсоедините капиллярную микрореактор из PEEK союза и подключения к PEEK Tee.
  2. Вставьте долго ~ 2 см провод Pt в боковом плече PEEK Tee; используйте 1/32 "PEEK втулка дл обеспеченигерметичны соединения и для изоляции провода Pt.
  3. Подключение 50 мкм ID х OD 360 мкм (~ 0,5 м длиной) перенос образца капиллярную на противоположном конце PEEK Tee; использование 1/32 "PEEK рукав а для обеспечения подключения к герметичны.
  4. Закрепите PEEK тройник на XYZ-стадии и положение ESI эмиттер ~ 2 мм от масс-спектрометра на входе капилляра.
  5. Подключите провод Pt к источнику питания ESI масс-спектрометра.
  6. Подключите противоположный конец передачи образца капилляра к штуцеру из нержавеющей стали; использование 1/16 "PEEK втулка с для обеспечения подключения к герметичны.
  7. Подключение длиной 4-5 см 1/16 "PTFE трубки к противоположному концу союза из нержавеющей стали и вставьте 250 мкл иглу шприца в тефлоновой трубке, включите насос и установить скорость потока на необходимом уровне (например, 2 мкл / мин).
  8. Входные параметры тандем MS сбора данных в пакет программного обеспечения, который управляет прибором МСd сохранить в виде файла метода к готовой установки для выполнения анализа; для системы LTQ-MS, используйте параметры анализа зависимые следующие данные: динамическое исключение позволило в течение 180 сек с шириной исключения масс ± 1,5 м / г; один MS сканирование с последующим одним зумом и MS 2 сканирует на топ - 5 наиболее интенсивных пиков, увеличить ширину сканирования ± 5 м / г; столкновения индуцированной диссоциации (CID) параметры, установленные по ширине изоляции 3 м / г, нормированной энергии столкновения 35%, активации Q 0,25 и времени активации 30 мс.

4. Микрожидкостных Setup

  1. Подготовьте микрожидком устройство из стекла или полимерных подложек; 16-18 компоновка устройства обеспечивается на рисунке 2А, состоящий из микрореакторе (1) (0,13 мм длина х ширина 2 мм х 50 мкм , глубиной) , соединенную с входным отверстием (2 ), выходное отверстие (3) и боковое отверстие (4); соединительные каналы для жидкостных манипуляций ~110 мкм в ширину и ~ 50 мкм глубиной; многоканальная структура (5), состоящая из ~ 1.5-2 мкм глубиной х 10 мкм в ширину х 100 мкм длиной микроканалы помещены 25 мкм друг от друга, будут действовать в качестве фильтра для удержания частиц в микрореакторе.
  2. Включение соединения жидкости доставки к чипу склеиванием специализированные разъемы к портам на входе, или путем разработки полимерного стенд , который приспосабливает фитинги для подачи жидкости (рис 2В). 16
  3. Приготовьте суспензию частиц C18 (5 мкм), как описано в пункте 1.8; доставить суспензии до микрореакторе с помощью шприца с помощью 1/16 "PTFE трубки , соединенный с чипом порта (4); герметизировать отверстие после загрузки частиц с эпоксидным клеем и отверждения в течение 1 ч в печи при 90 ° С 16.
  4. Вставьте капилляр (20 мкм ID х 90 мкм длиной OD х 10 мм) в выходном отверстии, печать с E6000 клеем, и пусть лекарство O / N; это станет ESI эмиттер ( 6).
  5. Подключение 50 мкм ID х OD 360 мкм (~ 0,5 м длиной) перенос образца капиллярного к входному порту чипа (2); подсоедините противоположный конец капиллярной к 250 мкл шприца и шприцевой насос, как описано в 3,6-3,7.
  6. Поместите облегченной PEEK Tee разъем на линии передачи образца непосредственно перед впускным отверстием (2) и вставить провод Pt на боковой ручке тройника, как описано в пункте 3.2; это будет ESI электрод.
  7. Закрепите микрожидкостных устройств на этапе XYZ с эмиттером ESI, расположенной ~ 2 мм от впускного масс-спектрометра капилляра; подготовить МС для анализа, как описано в 3.8.

5. Образец Загрузка, протеолитическим расщеплением и элюирования для MS Analysis

Примечание: Все шаги передачи раствор / образец выполняются с помощью шприцевого насоса и должен позволить в течение нескольких дополнительных минут для завершения, чтобы компенсировать мертвой Volumэс, связанные с линиями передачи и из микрореакторе; необходимое время будет зависеть от скорости потока, участвующих.

  1. Ополосните микрореактор и подготовить его для анализа путем инфузии водного раствора NH 4 HCO 3 (50 ммоль) в H 2 O / CH 3 CN (98: 2 об / об) в 2 мкл / мин в течение 5 мин; используют 250 мкл шприца.
  2. Нагрузка образца белка (1 мкМ) на микрореакторе настаиванием раствор образца по 2 мкл / мин в течение 5 мин; используют 250 мкл шприца.
  3. Влить раствор трипсина (5 мкМ) в течение адсорбированного белка на микрореакторе в 2 мкл / мин в течение 1-3 мин.
  4. Гасят протеолитическую процесс пищеварения путем промывки микрореакторе с подкисленным водным раствором TFA (0,01% об / об) в H 2 O / CH 3 CN (98: 2 об / об) со скоростью 2 мкл / мин в течение 5 мин; используют 250 мкл шприца.
  5. Начать элюируют протеин переваривается из микрореакторе настаиванием подкисленного органического раствора TFA (0,01%об / об) в H 2 O / CH 3 CN (50:50 об / об) со скоростью 300 л / мин.
  6. Включите процесс сбора данных MS и напряжение ESI (~ 2000 В); сбор данных MS, используя параметры сбора данных, представленных в шаге 3.8; наблюдать элюцию триптических пептидов.

6. Обработка данных

  1. Процесс данные тандем MS с поисковой системой, совместимой с исходным форматом данных MS.
    1. Процесс исходных файлов LTQ-MS, используя организм определенной базы данных минимально избыточных белков; загрузить исходные данные в поисковой системе, установить массовые допуски родительских и ионных фрагментов до 2 и 1 Da, соответственно, и использовать только полностью триптические фрагменты до двух пропущенных расколы для поиска; не позволяют посттрансляционных модификаций; установить высокие и средние доверительный уровень ложных обнаружения (FDR) до 1% и 3%, соответственно, и не позволяют посттрансляционных модификаций.
  2. Фильтрация данных, чтобы выбрать только высокое довериепептид соответствует с белками в базе данных; оценить белковые и пептидные на уровне результатов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Представитель результатом протеолитического процесса пищеварения осуществляется одновременно на смеси белков, с описанными выше микрореакторы (фиг.1 или 2), представлена ​​в таблице 1. Таблица содержит уникальные пептидные последовательности , которые идентифицируют конкретный белок, крест корреляция оценка (Xcorr) (т.е. балл , который характеризует качество экспериментального к теоретико-матч для соответствующего спектра масс тандем), количеств...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Микрореактор описано в данной работе, обеспечивает простую в реализации экспериментальной установки для осуществления ферментативного расщепления белков для проведения анализа MS и идентификацию менее чем за 30 мин. Явные преимущества этой системы, по сравнению с традиционными подходами, включают простоту, скорость, низкий расход реагентов и низкие затраты. В частности, нет необходимости в дорогостоящих иммобилизованных бусин трипсина и патронов. Подготовка капиллярной микрореакторе проста (рис 1А), и м...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантом NSF/DBI-1255991 для IML.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Ионная ловушка ESI-MSThermo ElectronLTQМасс-спектрометр LTQ используется для получения тандемных данных MS
XYZ stageNewportMultiple partsСамодельный столик XYZ используется для адаптации коммерческого источника LTQ nano-ESI для приема входных данных от различных систем доставки образцов
СтереомикроскопEdmund opticsG81-278Микроскоп используется для наблюдения за процессом упаковки микрореактора
Аналитические весы/MetlerVWR46600-204Весы используются для взвешивания образцов белка
Ультразвуковая ванна/BransonVWR33995-540Звуковая ванна используется для смешивания/гомогенизации образцов и диспергирования суспензии частиц C18
Шприцевой насос 22Harvard Apparatus552222Микронасос используется для загрузки, промывки и элюирования образца и фермента на и из упакованного капиллярного микрореактора
Milli-Q системы сверхчистой водыEMD MilliporeZD5311595 Водная система MilliQ используется для подготовки очищенной деионизионной воды
Pipettor/Eppendorf (1,000  &микро; l)VWR53513-410Дозатор используется для измерения небольших объемов проб растворов
Pipettor/Eppendorf (100  &микро; l)VWR53513-406Дозатор используется для измерения небольших объемов пробных растворов
Pipettor/Eppendorf (10  &микро; l)VWR53513-402Дозатор используется для измерения небольших объемов растворов проб
капилляров плавленого диоксида кремния (100 & микро; m ID x 360 & микро; m OD)Polymicro TechnologiesTSP100375Этот капилляр используется для изготовления микрореактора
Капилляр из плавленого кремнезема (20  &микро; m ID x 100 & микро; m OD)Polymicro TechnologiesTSP020090Этот капилляр используется для изготовления эмиттера ESI
капилляра из плавленого диоксида кремния (50  &микро; m ID x 360 & микро; m OD)Polymicro TechnologiesTSP050375Этот капилляр используется для переноса образцов и элюента из шприцевого насоса в капиллярный микрореактор
Стеклокапиллярный скалывальщикSupelco23740-UЭто инструмент для резки капилляров из плавленого кремнезема нужной длины
КлейЭклектика ИзделияE6000 CraftЭтот клей используется для фиксации излучателя ESI в капиллярном микрореакторе или микрофлюидной микросхеме
Эпоксидный клейEpo-Tek353NDTЭтот клей используется для герметизации микрофлюидного входного отверстия, через которое загружаются частицы С18
фазы Частицы С18 (5  &микро; m)Agilent TechnologiesZorbax 300SB-C18Это частицы C18, на которых белки адсорбированы; частицы были экстрагированы из 4  мм x 20 см Колонна C18 LC из
шприца/стекла Agilent (250 &; l)Hamilton81130-1725RNСтеклянные шприцы используются для загрузки суспензии частиц C18 в капиллярный микрореактор и для доставки образца и элюентов в микрореактор
Внутренний восстановительный союз PEEK (от 1/16" до 1/32")ValcoZRU1.5FPKЭтот союз используется для подключения 250 & микро; l шприц к микрореактору для загрузки 5&микро; м суспензия
из нержавеющей стали (1/16")ValcoZU1XCШтуцер из нержавеющей стали используется для соединения иглы стеклянного шприца с инфузионным капиллярным
микрообъемным соединителем PEEK Tee (1/32")ValcoMT.5XCPKТройник Peek используется для подключения капилляра для переноса проб к капиллярному микрореактору; на его боковом рычаге можно вставить тройник с проволокой Pt
(облегченный вес)ValcoC-NTXFPKЭтот тройник используется для подачи напряжения ESI на микрофлюидный чип через линию передачи проб
Pt wire (0,404 мм)VWR66260-126Провод Pt обеспечивает электрическое соединение для генерации ESI и подключается к масс-спектрометру ESI по электропитанию
трубки из ПТФЭ (1/16" OD)ValcoTTF115-10FTТефлоновая трубка используется для обеспечения герметичного соединения между иглой шприца и соединением из нержавеющей стали.
ПЭЭК трубка (0,015" Внутренний диаметр x 1/16" OD)Upchurch Scientific1565Трубка Peek используется в качестве втулки для обеспечения герметичного соединения между соединением из нержавеющей стали и 50  &микро; m ID передаточная капиллярная
трубка PEEK (0,015" Внутренний диаметр x 1/32" OD)ValcoTPK.515-25Трубка Peek используется в качестве втулки для обеспечения герметичного соединения между капиллярами из плавленого кремнезема и
резаком для полимерных трубокValcoJR-797Этот резак используется для предварительной резки 1/16" и 1/32" Полимерная трубка Peek, которая используется в качестве рукава для герметичных соединений кусками длиной ~4-5 см
Янтарный флакон (2 мл)Agilent HP-5183-2069Флаконы используются для приготовления растворов образцов и суспензии частиц C18 
Флакон янтарный (4 мл)VWR66011-948Флаконы используются для приготовления образцов растворов
Полипропиленовая пробирка (15  ml)Fisher12-565-286DФлаконы используются для приготовления буферных растворов
Цилиндр (100 мл)VWR24710-463Цилиндр используется для измерения объемов растворителя
Цилиндр (10 мл)VWR24710-441Цилиндр используется для измерения объемов растворителя
Наконечники для пипеток (1,000 & микро; l)VWR83007-386Наконечники для пипеток используются для измерения небольших объемов растворов для проб
Наконечники для пипеток (100 &; l)VWR53503-781Наконечники для пипеток используются для измерения небольших объемов растворов для проб
Наконечники для пипеток (10 &; l)VWR53511-681Наконечники для пипеток используются для измерения небольших объемов образцовых растворов
Стеклянные подложкиНанопленкаB270 белая коронка, 3" x 3"Это стеклянные подложки для изготовления микросхем
Фитинг гайки с наружной резьбой (1/16 дюйма)UpchurchP203XЭтот фитинг используется для подключения трансферных капилляров к микрофлюидному чипу
Нанопорт в сбореUpchurchN-122HЭтот фитинг используется для подключения трансферных капилляров к микрофлюидному чипу
Стандарты белкаSigmaMultiple #
Ацетонитрил, марка ВЭЖХ FisherA955
Метанол, маркаВЭЖХFisherA452
Изопропанол, марка ВЭЖХSigma650447
трифторуксусная кислотаSigma302031
бикарбонат аммонияAldrichA6141
Трипсин, секвенирование классаPromegaV5111
обратной Peek Tee Clean-cut

Ссылки

  1. Petersen, D. H. Microfluidic Bioreactors. Encyclopedia of Microfluidics and Nanofluidics. , Springer Science+Business Media. New York. (2014).
  2. Matosevic, S., Szita, N., Baganz, F. Fundamentals and applications of immobilized microfluidic enzymatic reactors. J. Chem. Technol. Biotechnol. 86 (3), 325-334 (2011).
  3. Liu, Y., Liu, B., Yang, P., Girault, H. H. Microfluidic enzymatic reactors for proteome research. Anal. Bioanal. Chem. 390 (1), 227-229 (2008).
  4. Wu, H., Zhai, J., Tian, Y., Lu, H., Wang, X., Jia, W., Liu, B., Yang, P., Xu, Y., Wang, H. Microfluidic enzymatic-reactors for peptide mapping: strategy, characterization, and performance. LabChip. 4 (6), 588-597 (2004).
  5. Jin, L. J., Ferrance, J., Sanders, J. C., Landers, J. P. A microchip-based proteolytic digestion system driven by electroosmotic pumping. LabChip. 3 (1), 11-18 (2003).
  6. Asanomi, Y., Yamaguchi, H., Miyazaki, M., Maeda, H. Enzyme-immobilized microfluidic process reactors. Molecules. 7 (16), 6041-6059 (2011).
  7. Aravamudhan, S., Joseph, P. J., Kuklenyik, Z., Boyer, A. E., Barr, J. R. Integrated microfluidic enzyme reactor mass spectrometry platform for detection of anthrax lethal factor. 31.st. Annual International Conference of the IEEE EMBS, , 1071-1074 (2009).
  8. Liu, X., Lo, R. C., Gomez, F. A. Fabrication of a microfluidic enzyme reactor utilizing magnetic beads. Electrophoresis. 30 (12), 2129-2133 (2009).
  9. Liu, Y., Xue, Y., Ji, J., Chen, X., Kong, J., Yang, P., Girault, H. H., Liu, B. Gold nanoparticle assembly microfluidic reactor for efficient on-line proteolysis. Mol. Cell. Proteomics. 6 (8), 1428-1436 (2007).
  10. Wu, H., Tian, Y., Liu, B., Lu, H., Wang, X., Zhai, J., Jin, H., Yang, P., Xu, Y., Wang, H. Titania and alumina sol-gel-derived microfluidics enzymatic-reactors for peptide mapping: design, characterization, and performance. J. Proteome Res. 3 (6), 1201-1209 (2004).
  11. Ji, J., Zhang, Y., Zhou, X., Kong, J., Tang, Y., Liu, B. Enhanced protein digestion through the confinement of nanozeolite-assembled microchip reactors. Anal. Chem. 80 (7), 2457-2463 (2008).
  12. Hustoft, H. K., Brandtzaeg, O. K., Rogeberg, M., Misaghian, D., Torsetnes, S. B., Greibrokk, T., Reubsaet, L., Wilson, S. R., Lundanes, E. Integrated enzyme reactor and high resolving chromatography in "sub-chip" dimensions for sensitive protein mass spectrometry. Scientific Reports. 3 (3511), 1-7 (2013).
  13. Pramanik, B. N., Mirza, U. A., Ing, Y. H., Liu, Y. H., Bartner, P. L., Weber, P. C., Bose, A. K. Microwave-enhanced enzyme reaction for protein mapping by mass spectrometry: A new approach to protein digestion in minutes. Protein Sci. 11 (11), 2676-2687 (2002).
  14. Olszowy, P. P., Burns, A., Ciborowski, P. S. Pressure-assisted sample preparation for proteomic analysis. Anal. Biochem. 438 (1), 67-72 (2013).
  15. Lord, G. A., Gordon, D. B., Myers, P., King, B. W. Tapers and restrictors for capillary electrochromatography and capillary electrochromatography-mass spectrometry. J. Chromatogr. A. 768, 9-16 (1997).
  16. Lazar, I. M., Kabulski, J. L. Microfluidic LC Device with Orthogonal Sample Extraction for On-Chip MALDI-MS Detection. Lab Chip. 13 (11), 2055-2065 (2013).
  17. Harrison, D. J., Manz, A., Fan, Z. H., Ludi, H., Widmer, H. M. Capillary electrophoresis and sample injection systems on a planar glass chip. Anal. Chem. 64 (17), 1926-1932 (1992).
  18. Jacobson, S. C., Hergenroder, R., Koutny, L. B., Warmack, R. J., Ramsey, J. M. Effects of Injection Schemes and Column Geometry on the Performance of Microchip Electrophoresis Devices. Anal. Chem. 66 (7), 1107-1113 (1994).
  19. Armenta, J. M., Perez, M. J., Yang, X., Shapiro, D., Reed, D., Tuli, L., Finkielstein, C. V., Lazar, I. M. Fast Proteomic Protocol for Biomarker Fingerprinting in Cancerous Cells. J. Chromatogr. A. 1217, 2862-2870 (2010).
  20. Doucette, A., Craft, D., Li, L. Mass Spectrometric Study of the Effects of Hydrophobic Surface Chemistry and Morphology on the Digestion of Surface-Bound Proteins. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 14, 203-214 (2003).
  21. Lazar, I. M., Trisiripisal, P., Sarvaiya, H. A. Microfluidic Liquid Chromatography System for Proteomic Applications and Biomarker Screening. Anal. Chem. 78 (15), 5513-5524 (2006).
  22. Lazar, I. M., Karger, B. L. Multiple Open-Channel Electroosmotic Pumping System for Microfluidic Sample Handling,". Anal. Chem. 74 (24), 6259-6268 (2002).
  23. Lazar, I. M., Rockwood, A. L., Lee, E. D., Sin, J. C. H., Lee, M. L. High-speed TOFMS Detection for Capillary Electrophoresis. Anal. Chem. 71 (13), 2578-2581 (1999).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Ферментативное расщеплениерасщепление белковраствор трипсиначастицы C18масс-спектрометриякапиллярная колонкаионизация электрораспылениемэлюирование пептидованализ образца
Быстрое Ферментативный Обработка белков для обнаружения MS с проточный микрореакторе
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.