Ткань Характеристика после нового метода Дезагрегирование для кожи Micro-трансплантатов поколения

Summary

Протокол описывает новый метод дезагрегации тканей человека и создать аутологичных микро-трансплантаты, которые, в сочетании с коллагеном губок, порождающие человека био-комплексов, готовых к использованию в лечении поражений кожи. Кроме того, эта система сохраняет жизнеспособность клеток микро-трансплантатов в разное время после механической дезагрегации.

Abstract

Несколько новых методов были разработаны в области биотехнологии для получения аутологичных клеточных суспензий во время операции, с тем чтобы обеспечить еще один этап лечения острых и хронических кожных поражений. Кроме того, управление хронических, но и острых ран в результате травмы, диабета, инфекций и других причин, остается сложной. В этом исследовании мы описываем новый метод для создания аутологичных микро-трансплантаты из кожной ткани одного пациента и их клинического применения. Кроме того, в пробирке биологическая характеристика кожной ткани , полученной из кожи, де-epidermized дермы (DED) и дермы полиорганной и / или доноров нескольких тканей также была проведена. Все ткани были разбиты по этим новым протоколом, что позволяет нам получить жизнеспособные микро-трансплантатов. В частности, мы сообщали, что этот инновационный протокол способен создать био-комплексы, составленные аутологичных микро-трансплантатов и коллагеновых губок, готовых наносить на кожных поражений. Клиникал применение аутологичных биологических комплексов на поражения ног также сообщалось, показывая улучшение как процесса повторного epitalization и мягкости поражения. Кроме того, наша модель в пробирке показали , что жизнеспособность клеток после механического разукрупнения с этой системой поддерживается в течение долгого времени до семи (7) дней культуры. Мы также наблюдали, с помощью проточной цитометрии, что пул клеток, полученных из дезагрегации состоит из нескольких типов клеток, в том числе мезенхимальные стволовые клетки, которые оказывают ключевую роль в процессах регенерации и восстановления тканей, для их высокой регенеративного потенциала. Наконец, мы продемонстрировали в пробирке , что эта процедура сохраняет стерильность микро-трансплантатов при культивировании в чашки с агаром. Таким образом, мы приходим к выводу, что этот новый регенеративный подход может быть перспективным инструментом для врачей, чтобы получить в одну стадию жизнеспособного, стерильный и готов к использованию микро-трансплантаты, которые могут быть применены по отдельности или в сочетании с наиболее распространенным биологическим scaffoLDS.

Introduction

В последние годы несколько новых методов были разработаны в области биотехнологии для получения аутологичных клеточных суспензий во время операции, с тем чтобы обеспечить один шаг лечения острых и хронических кожных поражений. Кроме того, управление острыми, но в основном хронических ран в результате травмы, диабета, инфекций и других причин, остается сложной. Существует свидетельств того, что хронические раны стали серьезной глобальной проблемой здравоохранения, в результате чего огромное финансовое бремя на системы здравоохранения во всем мире ^1.

Чтобы увеличить скорость успеха в лечении поражений кожи, отсутствие обширной манипуляции (в том числе сотовой усиления) и поддержание стерильных условий необходимы для того, чтобы создать клеточную суспензию, которую может быть выполнено немедленно на поврежденный участок пациентов, что позволит избежать более длительного обработки в чистых помещениях, таких как мобильные заводы. улицаarting из небольших биопсий кожи, шлифовка, центрифугирования и других методов разделения (например, ферментативным или механические), которые часто используются для получения суспензии клеток, которые могут быть выращены в среде для роста. Все эти методы обычно требуют длительного времени выполнения, подчеркивая клеточных структур, а также приводит к снижению жизнеспособности клеток. Другим важным аспектом является получение аутологичных клеточной суспензии готов к использованию клиницистами, например, для ремонта поврежденных участков. Кроме того, хорошо известно , что трансплантаты аутологичных ткани выживают процедуры передачи , чтобы в конечном итоге выжить в месте реципиента принципами индукции и проводимости ^{2, 3.} Идеальная трансплантат ткани должны быть легко доступны и имеют низкую антигенность и доноров сайта заболеваемости ^4.

На основании этих доказательств, первая цель данного исследования состояла в том, чтобы создать аутологичных био-комплексы, пригодные дляклиническое применение в восстановлении тканей. Для этой цели мы описываем новый метод для получения аутологичных микро-трансплантаты, начиная от кожных тканей, которые были с разбивкой по этому протоколу. Случай презентации также описано здесь в качестве клинического применения аутологичных микро-трансплантатов, полученных этим протоколом в сочетании с коллагеном губок. Такой подход уже сообщалось , чтобы быть эффективными в механической дезагрегации тканей человека ⁵ и он был использован в клинике для трансплантатов и регенерации тканей дермы ^6,7, а также для регенеративной терапии соединительной ткани в полости рта челюстно - лицевой хирургии ^8-10 ,

Кроме того, второй целью данного исследования было биологическая характеристика кожных тканей после того, как их дезагрегации по этому протоколу. С этой целью различные гомологичные образцы кожной ткани происходит от области ствола различных полиорганнойи / или доноры нескольких тканей были обработаны в соответствии с национальными правилами по заготовке, переработке и распределению тканей для трансплантации (НСТ 2013) на Эмилия-Романья Региональный Skin Bank.

История болезни:

A 35-летний пациентка показывает сложную травму из-за автомобильной аварии был принят в отделении интенсивной терапии больницы Анконы. Пациент показал инфекцию на ноге из-за открытой раны и сложный перелом, стабилизированный внешней фиксации. Два радикала санацию были выполнены и когда рана стала чистой после отрицательной Прессотерапия (VAC терапия) и надкостницы выглядели здоровыми, мы применили протокол по истечении двух месяцев с момента восстановления. После дезагрегации с этой системой, микро-трансплантаты, полученные были использованы для создания био-комплексы с коллагеновой губки, которые впоследствии были имплантированы для того, чтобы исследовать их эффективность по ремонту повреждений.

Protocol

Заявление по этике: так как клиническое применение протокола требует использования кожным аутогенной ткани пациента, его характеристика в пробирке проводили до клинического применения на гомологичной кожной ткани в Эмилия - Романья Региональный банк кожи с соблюдением требований национальных правил по заготовке, переработке и распределение тканей для трансплантации (НСТ 2013).

1. Био-комплекс здания для клинического применения

Примечание: Этот протокол клинически основанный на использовании Rigeneracons (ткань дезинтегратор) и Rigenera Machine (тканевой системы дезинтегратор) (Рис . 1А) Дезинтегратор ткани представляет собой биологический медицинский разрушитель человеческих тканей, способных нарушить небольшие кусочки тканей с использованием сетки, представленную шестиугольными лезвиями и фильтрующих элементов и компонентов внеклеточного матрикса с отсечкой около 50 микрон.

1. Соберите skinsamples пациента через биopsy пуансон (Фиг.1В) и дезагрегации добавлением 1 мл физиологического раствора для каждой части , чтобы получить аутогенные трансплантаты ^{микро-6,7,9} (или см шаг 2.1).
2. Поместите 1 мл микро-трансплантатов на коллагеновых губок (Рисунок 1C) toform био-комплексы использовать для клинического применения.
3. Культура еще 1 мл микро-трансплантатов на коллагене губок в присутствии 6 мл DMEM среде , дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки при 37 ° С в атмосфере 5% СО ₂ увлажненной атмосфере.
4. После 3-х дней культивирования фиксируют био-комплексы с 0,3% параформальдегидом в течение 10 мин при комнатной температуре. Налейте парафин с конкретным дозатором непосредственно на образце. Получают срезы с помощью микротома толщиной 5 мкм и поместить непосредственно в стеклянном салазкам.
5. Погружают парафиновые срезы 5 мкм в стакане для гистологического анализа, содержащий 15 - 20 мл ксилола (имеющийся в продаже - смесь м-ксилол (40 - 65%), п-ксилол (20%), о-ксилол (20% ) и ETHил бензола (6 - 20%) и следы толуола, триметилбензол, фенол, тиофен, пиридин и сероводород) в течение 3 минут каждый.
6. Погружают ломтики в убывающем сортов (100% до 70%) этанола (100% этаноле в течение 1 ч, 95% этанола в течение 1 ч, 80% этанола в течение 1 часа, 70% этанола в течение 1 ч), а затем деионизированной воды для де-paraffinizing и регидратации секции.
7. Пятно разделы с 1 - 2 мл 1 г / л Ematoxylin за 1 - 2 мин, а затем промыть в воде, чтобы удалить любые излишки Ematoxylin.
8. Пятно секции для 4 - 5 мин с спиртовым раствором эозин Y при 1% концентрации в смеси с этанолом 70% и разводят в воде.
9. Используйте 1 - 2 мл эозина Y для каждой секции слайдов и промыть под проточной водой.
10. Погрузитесь секции в увеличении сортов этанола (см шаг 1.6) и , наконец, после прохождения в ксилоле в течение 1 ч, покровное с основанным монтажа mediumand наблюдать под световым микроскопом при 100 - кратном увеличении (рис 1D).

2. Сбор, Разбивка и экстракорпоральное Анализ тканей

1. С помощью дерматома, принимать независимые ткани кожи, папиллярной де-epidermized дермы (DED) или ретикулярной дермы (дермы), соответственно, на 0,6 мм, 1 мм или 2 мм толщиной от области ствола 4-х различных полиорганной и / или многоканальные доноров тканей в диапазоне от 40 до 55 лет, в соответствии с национальными правилами по заготовке, переработке и распространении тканей для трансплантации (CNT 2013).
   1. Аккуратно промойте все образцы в 0,9% растворе NaCl положить их в блюдо на орбитальном шейкере в течение 5 мин.
   2. Используя трепанобиопсия 5-мм, создавать образцы, которые являются однородными в диаметре от кожной ткани, DED и дермы и взвесьте все образцы тканей перед дезагрегации.
   3. Вставка, восемь трех или четырех однородных образцов ткани кожи, DED или дермы соответственно, в дезинтегратор ткани, добавлением 1,5 мл физиологического раствора для дезагрегации.
   4. Выполните разныевремена дезагрегации для всех образцов ткани , как указано в таблице 1.
   5. Используйте соотвествующее число перфорационных биопсий, полученных из образцов неповрежденной ткани в качестве контрольных.
   6. После механической дезагрегации, аспирация солевой раствор, содержащий микро-трансплантатов и поместить отдельно каждый образец в отдельную лунку 12-луночного планшета. Выполните тот же протокол для управления неповрежденными пробивных биопсий.
   7. Добавить 1 мл RPMI 1640, дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и антибиотики для каждого образца.
   8. Оценка жизнеспособности клеток немедленно. В каждую лунку, содержащую микро-трансплантат (полученный путем одновременного дезагрегации, восьми трех или четырех однородных образцах ткани кожи, DED или дермы соответственно) добавляют 1 мл среды, содержащей 0,5 мг / мл МТТ (3- [4,5- диметилтиазол-2-ил]) раствор бромида -2,5 дифенилтетразолийбромид и инкубировать в течение 3 ч при 37 ° с в атмосфере 5% СО ₂ / воздух. Выполните тот же протокол для интактного контроляпробивать биопсию.
   9. После инкубации, удалить всю среду, содержащую МТТ, и добавляют к каждому образцу 1 мл диметилсульфоксида (ДМСО) в течение 10 мин.
   10. Передача каждого образца и ДМСО в кювете и считывали при оптической плотности (OD) при 570 нм с использованием спектрофотометра. Рассчитать жизнеспособность клеток как отношение оптической плотности при длине волны 570 нм и вес в граммах (гр) ткани, использованными перед дезагрегации. Выполните тот же протокол для управления неповрежденными пробивных биопсий.
2. После механической дезагрегации, аспирация солевой раствор, содержащий микро-трансплантат, полученный из тканей кожи, DED и дермы образцы одного донора.
   1. Поместите отдельно каждую пробу в отдельную лунку 12-луночного планшета или в культуральной колбе для испытания жизнеспособности клеток и морфологического анализа соответственно.
   2. Культура микро-трансплантаты прибавлением 1 мл (12-луночный планшет) и 5 мл (культуральный флакон) в среде RPMI 1640 , дополненной 10% FBS и антибиотиков при 37 ° С в атмосфере 5% CO ₂ / AIг в течение 24 часов или 7 дней.
   3. Оценка жизнеспособности клеток через 24 часа или 7 дней (повторите шаги 2.1.8-2.1.10).
   4. Выполните морфологический анализ оценки присутствия суспензии клеток с помощью световой микроскопии после 24 часов и 7 дней культивирования в колбе.
   5. Анализируют образцы дермы для позитивности к мезенхимальных и маркеры гемопоэтических клеток, в том числе CD146, CD34 и CD45 антигенов с помощью анализа FACS ^6.
   6. Под ламинарного потока семян капот каждый микро-трансплантат (полученный путем одновременного дезагрегации, восьми трех или четырех однородных образцах ткани кожи, Дедом или дермы соответственно) и корреспондентскому небольшой фрагмент каждого образца ткани не полностью детализированном (> 50 мкм по размеру после того, как процесс дезагрегирования) на колумбийского агара, пластину, содержащую 5% овечьей крови отвар по 100 мкл.
   7. Инкубируйте планшет при 37 ° С в течение трех дней , а также выполнять микробиологического анализа на колумбийского агара пластины с целью оценки стерильности ¹¹,

Results

В этом предварительном исследовании, первая цель состояла в том, чтобы исследовать способность человека аутологичных микро-трансплантатов в сочетании с биологической поддержки, таких как коллаген, для производства био-комплексов, готовых к использованию. Эти био-комплексы были имплантированы у пациента с поражением ног , вызванного дорожно - транспортного происшествия (рис 2А) и полной повторной эпителизации , связанного с восстановлен...

Discussion

Это предварительное исследование показало , что микро-трансплантаты , полученные с помощью этого протокола можно комбинировать с коллагеновыми губками, как уже сообщалось в других клинических применениях, для оптимизации эффективности микро-трансплантаты имплантатов ^{9, 10.} В частности, это исследование показало , способность био -комплексы, состоящими из микро-трансплантатов и коллагеновых губок, адъювантной заживлению раны поражения ног после 30 дней от клинического применения. Кроме того, в пробирке

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rigenera Machine	Brain Wave	79210R
Rigeneracons	Brain Wave	79450S
MTT	Roche Diagnostic GmbH	11465007001
RPMI средний	PBI International	733-2292
DMEM средний	PBI International	F 0415
Антибиотики	биологические Отрасли промышленности PBI	03-038-1
Антитела для анализа FACS	eBiosciences	код 12-1469 для CD146-P; код 17-0349  для CD34-APC
Columbia agar	BioMerieux Company	43041
Condress®	Коллагеновая губка Abiogen Pharma		используется для биокомплексов
DMSO	Bioniche Pharma США LLC, Лейк Форест, IL
NaCl solution	Fresenius Kabi, Бад Хомбург, Германия
Xylene	Карло Эрба