Здесь мы приводим протокол для конкретного миРНК опосредованного мРНК истощения с последующим анализом иммунофлуоресценции оценить мейоза сборку и организацию шпинделя в ооцитах мыши. Этот протокол предназначен для разрушения в пробирке транскриптов и функциональной оценке различного шпинделя и / или ЦОМТ факторов, ассоциированных в ооцитах.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Мейоза шпинделя оценка в мышь ооцитов по миРНК-обеспечиваемого молчания
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Ошибки в сегрегации хромосом во время мейотического деления в гаметах могут привести к анеуплоидии, которая впоследствии передается эмбриону при оплодотворении. Возникающая в результате анеуплоидия у развивающихся эмбрионов признана основной причиной потери беременности и врожденных дефектов, таких как синдром Дауна. Точная сегрегация хромосом критически зависит от формирования веретенообразного аппарата микротрубочек, однако этот процесс остается плохо изученным в ооцитах млекопитающих. Интересно, что мейотическая сборка веретена отличается от митоза и регулируется, по крайней мере частично, уникальными центрами организации микротрубочек (MTOC). Оценка MTOC-ассоциированных белков может дать ценную информацию о регуляторных механизмах, которые управляют формированием и организацией мейотического веретена. В данной статье мы описываем методы выделения ооцитов мышей и истощения белков, ассоциированных с MTOC, с использованием миРНК-опосредованного подхода к тестированию функции. Кроме того, описаны условия фиксации ооцитов и иммунофлуоресцентного анализа для оценки формирования и организации мейотического веретена.
Введение
Мейоз является уникальным процессом деления, что происходит в гамет (яйцеклеток и сперматозоидов) и включает в себя два последовательных деления, не вмешиваясь синтез ДНК, чтобы отделить гомологичные хромосомы и сестринские хроматиды во время мейоза-I и мейоз-II, соответственно 1. Ошибки в сегрегации хромосом во время деления мейоза ооцитов может привести к анеуплоидии, которые наследуется эмбриона во время оплодотворения. Примечательно, что заболеваемость анеуплоидии в развивающихся эмбрионов увеличивается с продвижения материнского возраста и является основной причиной врожденных врожденных дефектов, а также потери беременности у женщин 1,2, таким образом, подчеркивает важную необходимость, чтобы понять молекулярную основу анеуплоидии во деления мейоза ,
Во время деления клетки, расхождение хромосом в решающей степени зависит от комплектации аппарата микротрубочек веретена и установления стабильных хромосомных из микротрубочек взаимодействий для правильного крепления к противоположной шпинделяполюса. Важно отметить, что формирование мейоза шпинделя в ооцитах млекопитающих отличается от митоза в соматических клетках, и регулируется уникальных микротрубочек организации центров (MTOCs), которые не имеют центриолей 3,4. Основные белки, необходимые для нуклеации микротрубочек и организации локализуются в ооцитов MTOCs, в том числе гамма-тубулина, который катализирует сборку микротрубочек. Кроме того, pericentrin функций, как одного из важнейших строительных лесов белка, который связывает и анкеров гамма-тубулина, а также других факторов на MTOCs 5. Примечательно, наши исследования показывают, что истощение основных ЦОМТ связанных белков нарушает мейоза организации шпинделя и приводит к ошибкам хромосом в ооцитах, которые не в полной мере решены путем сборки веретена контрольно-пропускном пункте (SAC) 6,7. Таким образом, дефекты в шпинделя стабильности, которые не вызывают задержку мейоза, представляют собой значительный риск в содействии анеуплоидии. Несмотря на их существенную роль в сборке и шпинделя организации, ооцитов MTOC протЭйн состав и функции еще недостаточно изучена.
Тестирование функции специфических белков-мишеней в ооцитах млекопитающих является сложной задачей, так как клетки становятся транскрипционно покоя незадолго до возобновления мейоза 8,9. Следовательно, предовуляторного ооциты полагаться на материнской магазинах мРНК возобновить мейоз и поддерживать деления мейоза, а также первых делений дробления после оплодотворения 10,11. Эффективность РНК-интерференции (RNAi), опосредованной деградации мРНК транскриптов в ооцитах млекопитающих хорошо известна и материнской РНК завербованные для перевода во время мейоза созревания особенно поддаются миРНК ориентации 12-14. Таким образом, микроинъекции коротких интерферирующих РНК (миРНК) в ооциты предоставляет ценную подход к истощению целевых мРНК для функционального тестирования.
Здесь мы опишем методы для выделения ооцитов мыши и миРНК опосредованного истощения конкретных transcriPTS, чтобы проверить функцию важного ЦОМТ связанного белка, pericentrin. Кроме того, описаны условия анализа иммунофлуоресцентных оценить мейоза образование шпинделя в ооциты.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Этот протокол был одобрен уходу и использованию комитета Институциональные животных (IACUC) в университете Грузии.
1. Подготовка
- Для ооцитов культуры, приобретение или только приготовить минимальной необходимой среде (MEM), и дополнить 3 мг / мл бычьего сывороточного альбумина (БСА), как показано в таблице 1. Поместите бутылку из полистирола на балансировку загрузки (тары к нулю). Добавить все реагенты, кроме BSA, в порядке и воспитывать конечного объема с MQ-воде по весу в общей сложности 250 г. Затем добавить BSA, позволяют растворить и стерилизовать фильтр.
Примечание: Описанный МЕМ среды требует для уравновешивания и инкубации клеток с медицинской газовой смеси 5% CO 2, 5% O 2 и 90% N 2. Тем не менее, другие средства массовой информации (например, CZB) могут быть использованы, которые позволяют для инкубации клеток в 5% CO 2 в атмосферных условиях. - Для ооцитов микроинъекции, купить или приготовить M2 среду.
- Подготовьте рпреобладающий кобылье сыворотки гонадотропин (PMSG) в концентрации 5 МЕ / 100 мкл.
- Покупка и восстановить запасы миРНК в рабочей концентрации 1 мкМ.
2. Мышь ооцитов Коллекция
- ДЕНЬ 1: стимулировать развитие фолликула и увеличить число предовуляторного фолликулов, управлять 5 МЕ ГСЖК внутрибрюшинно самкам мышей 48 ч до сбора яйцеклеток.
- ДЕНЬ 3: Для сбора и культуры ооцитов, настроить 35 мм культуры блюда с 3 мл MEM / BSA с добавлением 1 мкг / мл милринон. Это ингибитор фосфодиэстеразы поддерживает ооцитов в профазе-я арестую и предотвращает срыв зародышевого пузырька (GVBD). Равновесие культуру блюда в медицинской газовой смеси, по крайней мере 15 мин.
Примечание: Милринон дополнить СМИ, на всем протяжении ооцитов коллекции, а также ооцитов микроинъекции и 24 ч культура удержания период поста миРНК. - Получить яичники из самок мышей, используя установленную лабораторию практикует 15 и передать на новое блюдо культуры с предварительно нагретой и уравновешивают MEM / BSA / милринон.
- Место культуры блюдо на стадии стереомикроскопом для сбора ооцитов. Релиз кучевые-ооцитов-комплексы (КОК в) вручную пробивани антральных фолликулов с 27 г хвои. Исправление один яичник на дно чашки для культивирования, с 27 г иглы, прикрепленной к 1 мл шприца, и использовать вторую иглу, чтобы проколоть все крупных фолликулов. Повторите для каждого яичника.
- Используя стандартные процедуры рот пипетки или другие средства ооцитов стремление, собрать все ооциты, окруженные 2 или более слоев компактных кучевые клеток. Перевести КОК, чтобы новое блюдо и инкубировать при 37 ° С в течение 1 ч.
- Осторожно снимите окружающие клетки от кучевые повторного осторожно пипеткой с 1 мл пипетки, установленной на объем аспирации 750 мкл. Повторите шаг пипетки около 12 рази позволяют ооциты, чтобы восстановить в течение 5 мин. Продолжайте в том же порядке, пока все или большинство из кучевых клеток были удалены. Передача оголенных ооцитов в другую чашку для культивирования и позволяют прийти в равновесие при 37 ° С в течение 15 мин.
- Выделяют оголенных ооцитов на три экспериментальные группы, которые будут использоваться для: (I) микроинъекции конкретных миРНК против мишени интерес, (II) микроинъекции неспецифических (контроль) киРНК, и (III) не-вводили контрольной группе, чтобы учесть Условия культивирования.
3. Яйцеклетка Микроинъекция
- Настройка культуральные чашки с 3 мл М2 среде с Milrinone (1 мкг / мл) в течение ооцитов микроинъекции. Подготовка культуры блюд, содержащих MEM / BSA / милринон для мытья и последующего культуры вводили ооцитов.
Примечание: М2 среда содержит буфер HEPES и требует предварительного нагрева при температуре 37 ° С в течение 15 мин при атмосферных условиях. MEM требует предварительной потепление и уравновешивание с помощью медицинской газа, как описаноD выше. - Подготовка системы микроинъекции. Загрузка инъекционную иглу 5 мкл 1 мкМ раствора киРНК конкретного. Обеспечения проведения пипетки и иглу для микроманипуляторами системы микроинъекции и настроить узел впрыска с калиброванного объема и давления.
- Поместите 200 мкл микро-капли М2 СМИ на внутренней стороне крышки 3 см культуры блюдо и добавить яйцеклетки для установки и выравнивания системы микроинъекции.
- Использование яйцеклетки в качестве руководства, отрегулировать положение холдинговых и инъекционных игл. Применение отрицательного давления к удерживающей пипеткой осторожно закрепить ооциты и отрегулировать положение инъекционной иглы к наибольшему диаметру клетки. Настройте параметры, чтобы микроинъекции примерно 10 мкл на миРНК решения в любом месте в цитоплазме ооцита.
Рисунок 1. Яйцеклетка микроинъекции настроить. ( А) представитель образ 200 мкл микро-капли М2 СМИ размещены на крышке от 3 см блюдо культуры, с проведением пипетки и инъекционной иглой, расположенной на левой и правой, соответственно. (Б) Группа профаза-я арестован ооцитов (GV-этап) до микроинъекции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. - Верните крышку на сцену стереомикроскопа и добавить 200 мкл микро-капли свежего М2 СМИ. Добавить группу ооцитов (~ 10) в микро-капли в рот пипеткой, или альтернативных методов, а затем вернуться крышку с микро-капли на сцену микроинъекции.
- Приступить к microinject отдельные ооциты. Безопасный одну яйцеклетку с холдингом пипетки, медленно вставьте кончик инъекционной иглой в цитоплазму и изгнать объем впрыска раствора миРНК. Тщательно убрать иглу для инъекций и МОве вводят яйцеклетки в положение в нижней части микро-капли. Перемещение безуспешно инъекционные ооцитов в положение, в верхней части микро-капли.
- Повторите процедуру микроинъекции с каждым яйцеклетки. Для поддержания оптимального жизнеспособности яйцеклетки, microinject лишь небольшое число яйцеклеток одновременно. Убедитесь, что этот процесс не займет более нескольких минут, чтобы предотвратить температуры и рН изменения в микро-капли.
- Аспирируйте успешно вводят ооцитов или тщательно перемещать крышку с микро-капли вводили ооцитов к стереомикроскопа. Передача инъекционные жизнеспособных яйцеклеток в рот пипеткой или альтернативных методов, чтобы MEM / BSA / Milrinone среду для мытья и равновесия при 37 ° С.
- Используя другую группу ооцитов, повторить процесс микроинъекции с новой инъекционной иглой с грузом неспецифических миРНК для контрольной группы. Вымойте ооцитов в MEM / BSA / милринон и передачи в отдельную чашку для культивирования.
- Культура все группыооцитов в течение 24 ч в MEM / BSA / милринон при 37 ° С в атмосфере медицинской газа.
Примечание: 'милринон блок "период культура необходима для истощения мРНК / белка эффективность целевой.
4. яйцеклеток Культура для мейотических созревания
- ДЕНЬ 4: Для каждой экспериментальной группы ооцитов настройки 4 культуры блюда (35 мм) с 3 мл MEM / BSA. Дополнение один СМИ блюдо на группу с 10% (высокое качество) эмбриональной телячьей сыворотки (FBS), чтобы использовать для созревания ооцитов. Разрешить все культуральные чашки для уравновешивания при 37 ° С в медицинской газовой смеси.
- Чтобы освободить ооцитов от "Milrinone блока", последовательно мыть ооцитов три раза в блюдах, содержащих MEM / BSA, а затем передать ооцитов к созреванию блюдо с СМИ с 10% FBS. Культура все группы ооцитов в течение 17 ч при 37 ° С, для того, чтобы возобновить и прогрессирование мейоза.
- День 5: Подготовка решения для ооцитов FIXaции, в том числе: (I) 4% параформальдегида (PFA) в PEM буфера (100 мМ ТРУБЫ [рН 6,9], 1 мМ MgCl 2, 1 мМ EGTA) с 0,5% Тритон-X 100, и (II) ФБР с добавкой 5 % FBS, которые будут использоваться для мытья и блокировать ооцитов.
Примечание: Эти решения требуют предварительного нагрева до 37 ° С до ооцитов фиксации. - Для ооцитов фиксации (после 17 ч культуры), быстро передавать каждой экспериментальной группы ооцитов в рот пипеткой или альтернативных методов в отдельных скважинах (в блюдо 4-а), содержащего 750 мкл предварительно нагревают 4% раствор PFA и инкубировать при 37 ° C в течение 1 часа. Впоследствии мыть каждую группу ооцитов 3 раза (15 мин каждый) в 750 мкл подогретого PBS, содержащего 5% FBS.
- Блок ооциты в 200 мкл PBS / FBS 5% O / N при 4 ° С для минимизации неспецифического связывания антитела.
5. Анализ Иммунофлуоресценции
- ДЕНЬ 6:
Примечание: иммунное окрашивание делается в нескольких луночного планшета и OOCytes серийно передается последовательных скважин, содержащий соответствующие антитела и мыть решения. Либо 48 или 96-луночные планшеты могут быть использованы, просто отрегулировать громкость решение на основе хорошо размера. Для 96-луночных планшетах использовать 200 мкл на лунку. Яйцеклетки передаются различных решений в следующем порядке: решения первичных антител - 3 мыть скважин - раствор вторичного антитела - 3 мыть скважин. Чтобы ограничить освещенность пластина может быть покрыта пленкой.
Приготовьте свежий PBS / FBS в 5% и использовать это решение для приготовления антител разведений (например, кролика против pericentrin (1/1000), мышиного анти-тубулина (1/1000)). - Передача фиксированных ооцитах каждой экспериментальной группы на отдельные лунки, содержащие 200 мкл (или 100 мкл, если меньше объема желательна) раствора первичных антител и покрывают скважины парафином. Инкубируйте в соответствии с оптимальными условиями антител специфических (например, 37 ° С в течение 1 ч, или 4 ° CO / N).
Примечание: Первичный dilutio антителп, а также определенное время инкубации и температуры требуется тестирование, чтобы определить оптимальные условия для различных антител, используемых. - После инкубации с первичными антителами, мыть ооцитов три раза в PBS / FBS 5% (10-15 мин каждый).
- Передача ооцитов в раствор, содержащий флуоресцентно-конъюгированные вторичные антитела (например, 1/1 000 разбавление анти-кролик и анти-мышь антитела, конъюгированного с флюорохромами различных длин волн). Инкубируют в течение 1 ч при 37 ° С.
- Вымойте ооцитов три раза в PBS / 5% FBS (10 - 15 минут каждый).
- После окончательного стадии промывки, передавать ооциты на чистую предметное стекло и осторожно аспирации излишки промывочного раствора. Это иммобилизации ооцитов на поверхности стекла. Добавить 8 мкл монтажа СМИ (содержащий DAPI) и тщательно накладывать монтажную СМИ с 22 мм х 22 мм покровным. Опустите покровное медленно, чтобы избежать образования пузырьков и / или повреждения ооцитов.
Примечание: В качестве альтернативы, для поддержания 3-мерного свойства ооцита для конфокальной микроскопии анализа, добавить небольшой объем 100 мкм стеклянных бусин (в смеси с вазелином) к углам покровного стекла перед монтажом на слайде. - Хранить слайды при 4 ° С, или перейти к оценке мейоза прогрессии, а также анализа уровней экспрессии и локализации белка субклеточном использованием флуоресцентного микроскопа оснащен необходимыми фильтрами, чтобы соответствовать вторичных антител использовали.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Микроинъекция миРНК обеспечивает эффективный подход к деградации мРНК и последующего истощения белка в ооцитах, что позволяет эффективно и высоко специфический функциональное тестирование различных целевых факторов в пробирке. Впоследствии, иммунофлюоресценции используется для конкретного анализа фенотипа, а также для проверки истощение белка в миРНК впрыском ооцитов. В данном примере, флуоресцентный маркировки отдельных ооцитов с DAPI вместе с анти-тубулина и анти-pericentrin антител позволило: (я) подтвержден...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В то время как существует несколько методов экзогенной передачи нуклеиновой кислоты в соматических клетках, таких как электропорация и трансфекции, микроинъекции является оптимальным способом доставки молекул РНК в транскрипционно молчащих ооцитов мыши. Текущий протокол обеспечивает эффективный подход к истощению в пробирке специфических мРНК, которые позволяют функциональное тестирование другом шпинделе и / или ЦОМТ факторов, ассоциированных в ооцитах. Этот подход приводит к эффективной истощения стенограммы и...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать
Благодарности
Это исследование было частично поддержано Университетом Джорджии и грантом (HD071330) от Национальных институтов здравоохранения для MMV.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| <сильно>Реагенты | |||
| Гонадотропин сыворотки беременной кобылы (PMSG) | EMD Biosciences | 367222 | |
| минимальной незаменимой средой (MEM) | *Рецепт приведен в Таблице 1 | ||
| Сбалансированный солевой раствор Earle's (10x) | Sigma | E-7510 | |
| Sodium Бикарбонат | Sigma | S-5761 | |
| Пировиноградная кислота, соль натрия | Sigma | P-5280 | |
| Пенициллин G, соль калия | Sigma | P-7794 | |
| Стрептомицина сульфат | Sigma | S-9137 | |
| L-глютамин | Sigma | G-8540 | |
| EDTA, дигидрат динатриевой соли | Незаменимые | Sigma E-4884 | |
| (50x) | Gibco | 11130-051 | |
| MEM Витаминная смесь (100x) | Sigma | M-6895 | |
| Фенол Красный раствор | Sigma | P-0290 | |
| Бычья сыворотка альбумин (BSA) | Sigma | A1470 | |
| Milrinone | Sigma | M4659 | |
| Фетальная бычья сыворотка (FBS) | Гиклон | SH30070.01 | |
| EmbryoMax M2 Медиа с гепсом | МиРНК EMD Millipore | MR-015-D | |
| нацеленные на перицентрин | Qiagen | GS18541 | |
| Negative control siРНК | Qiagen | SI03650318 | |
| Параформальдегид (16% раствор) | Электронная микроскопия Sciences | 15710 | |
| Triton-X | Sigma | T-8787 | |
| Фосфатный буферный раствор (PBS) | Hyclone | SH30028.02 | |
| Антиперицентрин (кролик) | Covance | PRB-432C | |
| Антиацетилированный a-тубулин (мышь) | Sigma | T-6793 | |
| Козий антираббит Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-21430 | |
| Козий анти-мышь Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A-11017 | |
| Major Оборудование | |||
| Стереомикроскоп (SMZ 800) | Nikon | ||
| Вертикальный флуоресцентный Микроскоп | Leica Microsystems | ||
| Инвертированный микроскоп | Nikon | ||
| Система микроинъекций Femtojet | Eppenforf | ||
| Иглы для микроинъекций Eppendorf | |||
| для удержания (VacuTip) | Eppendorf | 930001015 | |
| Чашки | |||
| 35 мм | Corning Life Sciences | 351008 | |
| 4-луночные планшеты | Thermo Scientific | 176740 | |
| 96-луночные пластины | Corning Life Sciences | 3367 | |
| 0,45 мм CA Фильтрующая система | Corning Life Sciences | 430768 |
Ссылки
- Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nat Rev Genet. 13 (7), 493-504 (2012).
- Hassold, T. J., Hunt, P. A. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).
- Szollosi, D., Calarco, P., Donahue, R. P. Absence of Centrioles in the First and Second Meiotic Spindles of Mouse Oocytes. J Cell Sci. 11 (2), 521-541 (1972).
- Manandhar, G., Schatten, H., Sutovsky, P. Centrosome Reduction During Gametogenesis and Its Significance. Biol Reprod. 72 (1), 2-13 (2005).
- Zimmerman, W. C., Sillibourne, J., Rosa, J., Doxsey, S. J. Mitosis-specific anchoring of gamma tubulin complexes by pericentrin controls spindle organization and mitotic entry. Mol Biol Cell. 15 (8), 3642-3647 (2004).
- Ma, W., Baumann, C., Viveiros, M. M. NEDD1 is crucial for meiotic spindle stabilty and accurate chromosome segregation in mammalian oocytes. Dev Biol. 339 (439-450), (2010).
- Ma, W., Viveiros, M. M. Depletion of pericentrin in mouse oocytes disrupts microtubule organizing center function and meiotic spindle organization. Mol Reprod Dev. 81 (11), 1019-1029 (2014).
- Bouniol-Baly, C., et al. Differential Transcriptional Activity Associated with Chromatin Configuration in Fully Grown Mouse Germinal Vesicle Oocytes. Biol Reprod. 60 (3), 580-587 (1999).
- De La Fuente, R., Eppig, J. J. Transcriptional Activity of the Mouse Oocyte Genome: Companion Granulosa Cells Modulate Transcription and Chromatin Remodeling. Dev Biol. 229 (1), 224-236 (2001).
- Hodgman, R., Tay, J., Mendez, R., Richter, J. D. CPEB phosphorylation and cytoplasmic polyadenylation are catalyzed by the kinase IAK1/Eg2 in maturing mouse oocytes. Development. 128 (14), 2815-2822 (2001).
- De La Fuente, R. Chromatin modifications in the germinal vesicle (GV) of mammalian oocytes. Dev Biol. 292 (1), 1-12 (2006).
- Wianny, F., Zernicka-Goetz, M. Specific interference with gene function by double-stranded RNA in early mouse development. Nat Cell Biol. , 270-275 (2000).
- Svoboda, P., Stein, P., Hayashi, H., Schultz, R. M. Selective reduction of dormant maternal mRNAs in mouse oocytes by RNA interference. Development. 127 (19), 4147-4156 (2000).
- Svoboda, P. Renaissance of mammalian endogenous RNAi. FEBS Letters. 588 (15), 2550-2556 (1016).
- Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K., Nagy, A. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , Fourth Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2014).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
