Разработка Backbone циклический пептид библиотека как потенциал Противопаразитарные терапии Использование микроволнового облучения

Summary

Описан простой и общий метод синтеза циклических пептидов с помощью микроволнового облучения. Эта процедура позволяет синтезировать основные циклические пептиды с коллекцией различных конформаций при сохранении боковых цепей и фармакофорных фрагментов, и, следовательно, позволяет проводить скрининг на биоактивную конформацию.

Abstract

Белок-белковые взаимодействия (ИПП) принимают непосредственное участие почти во всех биологических процессов и связан со многими заболеваниями человека. Таким образом, есть серьезные усилия, чтобы цель ИЦП в области фундаментальных исследований, так и в фармацевтической промышленности. Белок-белковые интерфейсы, как правило, большие, плоские, и часто не хватает карманов, усложняя открытие малых молекул, которые нацелены на такие сайты. Альтернативные подходы в отношении использованием антител имеют ограничения из-за плохого пероральной биодоступности, низкая клеток проницаемости и неэффективности производства.

Использование пептидов целевой PPI интерфейсы имеет несколько преимуществ. Пептиды имеют более высокую гибкость, конформационные повышенной селективности и, как правило, недороги. Тем не менее, пептиды имеют свои собственные ограничения в том числе плохой стабильности и неэффективность пересечения клеточных мембран. Чтобы преодолеть эти ограничения, пептид циклизации может быть выполнена. Циклизация было продемонстрировано, чтобы улучшить селективность пептид, Метаболическую стабильность, и биодоступность. Тем не менее, предсказания биологически активный конформацию циклического пептида не является тривиальной. Чтобы преодолеть эту проблему, одна подход привлекательным оно для скрининга библиотеки сфокусированный на экране, в котором все магистральные циклические пептиды имеют одинаковую первичную последовательность, но отличаются параметров, влияющих свою конформацию, таких как размер кольца и положении.

Мы описываем подробный протокол для синтеза библиотеку магистральных циклических пептидов, ориентированные на конкретные паразитов ИЦП. Использование рационального подхода к проектированию, мы разработали пептидов, полученных из леса белка L eishmania рецептора активированной киназы С-(отсутствие). Мы предположили, что последовательности в отсутствии, что сохраняющиеся в паразитов, но не в хозяина млекопитающего гомолога, может представлять сайты взаимодействия для белков, которые имеют решающее значение для жизнеспособности паразитов. Циклические пептиды были синтезированы с использованием микроволнового излучения, чтобы уменьшить время реакции и повыситьЭффективность. Разработка библиотеки системообразующих циклических пептидов с различными размерами кольца облегчает систематическое экран для наиболее биологически активной конформации. Этот метод обеспечивает общий, быстрый и легкий путь к синтезу циклических пептидов.

Introduction

Белок-белковые взаимодействия (ИПП) играют ключевую роль в большинстве биологических процессов, от внутриклеточного передачи сигнала к гибели клеток ^1. Следовательно, ориентации ИЦП имеет фундаментальное значение для фундаментальных исследований и терапевтического применения. ИПП может регулироваться конкретных и стабильных антител, но антитела дорого и сложно в изготовлении и имеют низкую биодоступность. Кроме того, ИПП может быть мишенью малых молекул. Малые молекулы легче синтезировать и недороги по сравнению с антителами; Однако, они относительно менее гибким и подходит лучше небольших полостей, чем крупные белок-белковых интерфейсов ^2,3. Различные исследования показали, что пептиды, которые проще и дешевле, чем антитела и более гибким, чем малые молекулы, могут связываться белковые интерфейсы ИПП и регулировать ^4,5. Глобальный рынок терапевтический пептид был оценен примерно пятнадцать миллиардов долларов в 2013 году и растет на 10,5% однолетнийLLY ^6. Кроме того, есть более чем 50 продаются пептиды, около 270 пептидов в различных фазах клинических испытаний, и около 400 пептидов в передовых доклинических стадиях ^7. Несмотря на многочисленные пептиды используются в качестве лекарственных средств, пептиды по-прежнему представляют несколько проблем, которые ограничивают их широкое применение в том числе плохой биодоступности и стабильности, неэффективности пересечения клеточных мембран, и конформационной гибкости ^8,9. Один из вариантов для преодоления этих недостатков является применение различных модификаций, таких как местные (D-аминокислоты и N-алкилирования) и глобальных (циклизации) ограничений ^8,10-12. Эти модификации также происходят естественно. Например, циклоспорин А, иммунодепрессант циклический пептид естественно, содержит один D-аминокислоты и подвергается N-алкилирования модификации ^13,14.

Модификация природных аминокислот, чтобы вызвать локальные ограничения, такие как D- и N-алкилированием, часто влияет на пептид9, S биологической активности. Тем не менее, циклизация, в котором последовательность интерес может оставаться таким же, скорее всего, чтобы сохранить биологическую активность. Циклизация является весьма привлекательным способом ограничить пептид конформационные пространство за счет уменьшения равновесие между различных конформаций. Это увеличивает биологическую, как правило, активность и селективность путем ограничения пептид в активной конформации, который опосредует только одну функцию. Циклизация также улучшает стабильность пептида, сохраняя пептид в конформации, которая меньше признанной ферменты, разрушающие. Действительно, циклические пептиды были показаны улучшились метаболическую стабильность, биодоступность, и селективность по сравнению с их аналогами линейных ^15-17.

Тем не менее, циклизация может быть обоюдоострым мечом, так как в некоторых случаях ограничение может предотвратить пептидов от достижения биологически активный конформацию. Чтобы преодолеть это препятствие, сфокусированный библиотеку, в которой все пептиды в ту же основную sequencе и, следовательно, постоянные фармакофоров могут быть синтезированы. Пептиды в библиотеке отличаются параметрами, которые влияют на их структуру, таких как размер и положение кольца, для того, чтобы впоследствии скрининга наиболее биоактивного конформации ^9,18.

Пептиды могут быть синтезированы как в растворе и пептидного синтеза в твердой фазе (SPPS) подхода, который в настоящее время является более распространенным подходом синтез пептидов и будет обсуждаться дальше. SPPS представляет собой процесс, посредством которого химические превращения выполняются на твердой подложке через линкер подготовить широкий спектр синтетических соединений ^19. SPPS позволяет их установку пептиды путем последовательного сцепления аминокислот ступенчатым образом от С-конца, который прикреплен к твердой подложке, на N-конце. N-альфа-аминокислот, боковые цепи должен быть экранирован защитных групп, которые стабильны в условиях реакции, используемых при удлинении пептида, чтобы обеспечить добавление одной аминокислоты на стер. На заключительном этапе, пептид высвобождается из смолы и боковой цепью защитные группы удалены одновременно. В то время как пептид синтезируют, все растворимые реагенты могут быть удалены из пептида-твердой подложке матрицы путем фильтрации и смыл в конце каждой стадии связывания. При такой системе, большой избыток реагентов при высокой концентрации может управлять реакции сочетания к завершению, и все стадии синтеза могут быть выполнены в том же сосуде без переноса ^{материала} 20.

Хотя SPPS имеет некоторые ограничения, такие как производство неполных реакций, побочных реакций, нечистых реагентов, а также трудности мониторинга реакции ^21, преимущества SPPS сделали его "золотым стандартом" для синтеза пептидов. Эти преимущества включают в себя опцию, чтобы включить ненатуральных аминокислот, автоматизация, простое очищение, свернутые физические потери, и использование избытка реагентов, в результате чеговысокие урожаи. SPPS было показано быть чрезвычайно полезным в синтезе сложных последовательностей ^21,22, флуоресцентные модификаций ^{23 и} пептидных библиотек ^24,25. SPPS также очень полезно для других узлов поли-цепи, такие как олигонуклеотиды, олигосахариды ^{26,27 28,29,} и пептидных нуклеиновых кислот ^30,31. Интересно, что в некоторых случаях, SPPS было показано, что выгодно для синтеза малых молекул, которые традиционно изготавливают в растворе ^32,33. SPPS используется как в небольших масштабах для научных исследований и преподавания ^34,35, а также больших масштабах в промышленности ^36-38.

Две стратегии синтеза, которые используются главным образом в методологии SPPS для синтеза пептидов бутилоксикарбонил (Вос) и 9-флуоренилметоксикарбонил (Fmoc). Оригинальный стратегия введена SPPS был Вос, что требует условий сильной кислотой, чтобы удалить боковые защитные группы и отщепления пептида с RЕсин. Fmoc-пептид на основе синтеза, однако, использует умеренные базовых условий и является более мягким альтернативой кислотно-лабильных Boc протокола ^39. Стратегия Fmoc использует мультиплексирование с ортогональным трет-бутил (TBU) защиту боковой цепи, который удаляется на последней стадии синтеза, а отщепление пептида от смолы в кислых условиях.

Общий принцип синтеза пептидов на твердом носителе представлена ​​на Рисунке 1. Исходное аминокислоты, маскируется временной защитной группы на N-альфа-конце, загружают на смоле от С-конца. Полупостоянная защитную группу, чтобы замаскировать боковую цепь также используется, если необходимо (Рисунок 1, Шаг 1). Синтез целевого пептида собран из С-конца к N-концу с помощью повторяющихся циклов снятия защиты с N-α-временного защитной группы (рисунок 1, шаг 2) и соединительных следующего защищенной аминокислоты (рис 1 Онг> Шаг 3). После последнего аминокислота загружен (Рисунок 1, Шаг 4), пептид отщепл ют от полимерной подложки и полупостоянных защитные группы удаляют (рис 1, Шаг 5).

Рисунок 1. Общая схема твердофазного пептидного синтеза. N-α-защищенной аминокислоты закреплена с помощью карбоксильной группы с помощью линкера к смоле (стадия 1). Желаемый пептид, собраны в линейном виде с С-конца к N-концу повторяющихся циклов снятия защиты с временной защищающей группой (ТПГ) из N-альфа (шаг 2) и соединением аминокислот (шаг 3). После выполнения синтез (шаг 4), то полу-постоянные защитные группы (SPG) снимают защиту во время расщепление пептида (шаг 5).получить = "_blank"> Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

После сборки полного пептидной цепи, циклизация может быть достигнуто путем нескольких альтернатив: (А) с головы до хвоста циклизации - это удобный способ, но ограничена, поскольку она обеспечивает только один вариант для циклизации (рис 2А), (б) циклизация с использованием аминокислот из последовательности интерес, которые содержат биологически активные функциональные группы - однако, использование этих аминокислот могут влиять на биологическую активность (Фигура 2В), и (с) циклизацию добавлением аминокислот (или другие строительные блоки), не нарушая биоактивный последовательность. Введение этих молекул широко, как это позволяет производить ориентированных библиотек, не изменяя последовательность интерес (фиг.2с).

F2. Альтернативный igure пептид циклизации стратегии (А) голова к хвосту циклизации, через пептидную связь между С-концом и N-концом. (Б) циклизации между функциональными группами, такими как дисульфидной связи между остатками цистеина (1) или амидной связи между боковыми цепями лизина к аспарагиновой кислоты / глутаминовой (2), или боковой цепи, чтобы N- или С-конца (3 -4); (С) циклизация путем добавления дополнительных аминокислот или производных аминокислот или небольших молекул, например, перед (R0) и после (R7) биологически активное последовательности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Микроволновая печь-помощь синтеза использует микроволнового излучения для нагрева реакции, тем самым ускоряя органических химических превращений ^40,41. Микроволновая химия основана на способности реагента / растворитель, чтобы поглотитьмикроволновая энергия и конвертировать ее в тепло ^42. Перед технология получила широкое распространение, основные недостатки пришлось преодолеть, в том числе управляемости и воспроизводимости протоколов синтеза и отсутствие доступных систем для адекватных температуры и давления управления ^43,44. Первый доклад СВЧ-помощь синтеза пептидов проводили с использованием кухня микроволновая синтезировать несколько коротких пептидов (7-10 аминокислот) со значительным улучшением эффективности связи и чистоты ^45. Кроме того, микроволновая энергия была показана для уменьшения агрегации цепи, уменьшить побочные реакции, ограничить рацемизацию, и улучшить сцепные ставки, которые все решающее значение для сложных и длинных последовательностей ^46-53.

В настоящее время применение микроволнового облучения для синтеза пептидов или родственных соединений на твердой подложке, весьма обширен, в том числе (а) синтеза в воду вместо органического растворителя ^54; (В) Синтез пептидов собщие пост-трансляционной модификации, такие как гликопептиды ^55-58 или ^59-61 фосфопептиды, синтез, как правило, затруднено из-за низкой эффективности связывания стерически затрудненных производных аминокислот; (С) Синтез пептидов с модификацией в основной цепи, например, azapeptides, которые могут быть образованы путем замены C (A) от аминокислотного остатка с атомом азота, ⁶² или пептоиды, чей боковой цепи соединен с Амид азота, чем атома Cα ^63,64; (D), синтез циклических пептидов ^65-71; и (Е) Синтез комбинаторных библиотек ^51,72. Во многих случаях, авторы сообщили более высокую эффективность и сокращение времени синтеза с использованием микроволнового излучения, по сравнению с обычным протоколом.

Использование рациональную конструкцию ^73-75, мы разработали анти-паразитарные пептиды, которые были получены от рецептора эшафот L eishmania в FOг активированного C-киназы (отсутствие). ОТСУТСТВИЕ играет важную роль в ранней фазе инфекции Leishmania ^76. Паразиты, выражающие более низкие уровни отсутствия не паразитируют даже ослабленным иммунитетом мышам ^77, как отсутствие участвует в основных паразитов сигнализации процессов и синтеза белка ^78. Таким образом, не хватает ключевой белок эшафот ^{79 и} ценным объектом наркотиков. Сосредоточение внимания на последовательностях в отсутствии которые сохраняются в паразитов, но не в принимающей млекопитающих гомологов RACK, мы определили пептид 8 аминокислот (RNGQCQRK), что снижение Leishmania зр. Жизнеспособность в культуре.

Здесь мы описываем протокол для синтеза циклических пептидов магистральных, полученных из последовательности белка ОТСУТСТВИЕ описанной выше. Пептиды были синтезированы на твердой подложке с использованием микроволнового нагрева с помощью методологии SPPS с протоколом Fmoc / Tbu. Пептиды, конъюгированный с ТАТ пептид _47-57 (YGRKKRRQRRR) несущей посредством амидной связи, какчасть SPPS. ТАТ на основе транспорт различных грузов в клетки был использован для более чем 15 лет и доставка груза в субклеточных органелл была подтверждена ^80. Четыре различных линкеров, янтарная и глутаровый ангидрид, а также адипиновой кислоты и пимелиновой, были использованы для выполнения циклизации генерировать линкеров карбоновых кислот от двух до пяти атомов углерода. Циклизация было сделано с использованием микроволновой энергии и окончательные расщепления и боковой цепи шаги снятия защиты проводили вручную без микроволновой энергии. Применение автоматизированной микроволновой синтезатора улучшило чистоту продукта, увеличение выхода продукта и снижение продолжительности синтеза. Этот общий протокол может быть применен к другим исследований, которые используют пептиды, чтобы понять важную молекулярный механизм в пробирке и в естественных и дальнейшее развитие потенциальных лекарственных препаратов для человека заболеваний.

Protocol

1. Оборудование и реактивы Подготовка

1. Подготовка оборудования
   1. Выполните все шаги внутри вытяжного шкафа с использованием надлежащего средства индивидуальной защиты.
   2. Химически синтезируют пептиды на твердом носителе с использованием микроволновой печью синтезаторе пептидов с дополнительным модулем Discover, снабженный волоконно-оптического датчика температуры для управления микроволновой подачу питания в тефлоновый реактор (30 мл, со стеклянной фритты) или в одноразовую полипропилена Картридж (12 мл, с грубой фритты).
   3. Для правильного смешивания, подключиться азота в реакционный сосуд, или в качестве альтернативы уплотнение обоих концов полипропиленовой картриджа, и поместить на роторной качалке.
   4. Для слива реакционных смесей или моет, подключиться к вакуумом через ловушку отходов.
   5. Поместите оптоволоконного зонда в реакционный сосуд.
2. Подготовка реагентов
   1. Подготовка смолы путем взвешивания Каток Амид AM смолы 100-200 меш (0,204 мг), Добавляют 5 мл 1: 1 смеси N, N-диметилформамиде (ДМФ) / дихлорметан (ДХМ), в реакционный сосуд / полипропилена картриджа для промывки смолы вниз, встряхивают в течение 2-4 ч, чтобы должным образом набухают, и слейте.
   2. Готовят 0,2 М 9-флуоренилметоксикарбонилом (Fmoc) амино кислотных растворах при растворении соответствующего Fmoc-аминокислоты в ДМФ и вихрь смеси до аминокислоты не растворятся (таблица 1).
   3. Готовят 0,45 М раствор активатора смесь растворением 18,96 г О - (бензотриазол-1-ил) - N, N, N ', N' -tetramethyluronium гексафторфосфат (HBTU) в 100 мл ДМФ и встряхиванием смеси, пока твердое вещество растворяют (табл 1).
   4. Подготовьте 2 М активатора базовую смесь раствор путем объединения 34,8 мл N, N-диизопропилэтиламин (DIEA) с 65,2 мл 1-метил-2-пирролидинона (NMP) (Таблица 1).
   5. Готовят 0,1 М раствора смеси снятия защиты путем растворения 3,37 г 1-гидроксибензотриазола (HOBt)в 250 мл 20% о / о раствор пиперидина в ДМФ и встряхиванием смеси, пока твердое вещество растворяют (таблица 1).

2. Fmoc-защищенных аминокислот Муфта

1. Связь аминокислот
   1. Добавить аминокислоту (2,5 мл) / активатор (1 мл) / активатор базу (0,5 мл) в реакционный сосуд / полипропилена картриджа и пусть реакция протекать в течение 300 сек (25 Вт, 75 ° C, таблица 2). Слейте раствор.
   2. Вымойте смолы с ДМФ. Добавить DMF к смоле в течение 120 сек (7 мл, 0 W, RT) и слейте раствор. Повторите пять раз.
2. Фмок снятие защиты
   1. Добавить 7 мл 20% пиперидина в ДМФА с 0,1 М HOBt в реакционный сосуд / полипропилен картриджа и инкубируют в течение 30 сек (45 Вт, 75 ° C, таблица 2).
   2. Слейте реакционной смеси.
   3. Добавить 7 мл 20% пиперидина в ДМФА с 0,1 М HOBt в реакционный сосуд / полипропилен картридж и инкубировать в течение 180 сек (45 Вт, 75 ° С, Таблица 2).
   4. Слейте реакционной смеси.
   5. Вымойте смолы с ДМФ. Добавить DMF к смоле для 120 сек (7 мл 0 W, R) и слейте раствор. Повторите пять раз.
      Примечание: При желании, приостановить процедуру здесь и возобновить на более поздний срок.
3. После этапа аминокислоты связи, мыть смолы с DCM и магазин по крайней мере несколько дней при 4 ° С (в течение более длительного периода хранения смолы в - 20 ° С).
   1. Перемещение смолы из реакционного сосуда в полипропиленовую картриджа.
   2. Вымойте смолы с DCM. Добавить DCM к смоле в течение 120 сек (7 мл, 0 W, RT) и слейте раствор. Повторите три раза.
   3. Печать полипропиленовой картридж плотно с верхней крышки и кран.
   4. Перед началом нового синтеза, набухание смолы в течение 3-4 ч в ДМФ (7 мл).
4. Мониторинг синтез
   1. С помощью теста Кайзера (нингидриновый) или тест хлоранила быстро определить ход выполнениясинтез. При желании, выполнить мелкого реакции расщепления для определения чистоты и массы синтезированного пептида. Смотрите раздел 9.
      Примечание: Для дальнейшего поиска неисправностей см таблицу 3.
5. Повторите шаги 2.1 и 2.2, как требуется для синтеза пептида целевой: Arg(Pbf)-Asn(Trt)-Gly-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Lys(Mtt)-Gly-Gly-Tyr(But)-Gly-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf).

3. ангидрид / Кислота Сцепление

1. Ангидрид
   1. Вымойте смолы с NMP. Добавить NMP к смоле для 120 сек (7 мл, 0 Вт, RT) и слейте раствор. Повторите три раза.
   2. Растворить 10 эквивалентов соответствующего ангидрида в NMP (5 мл), добавляют 1 эквивалент 4-диметиламинопиридин (ДМАП) и 10 эквивалентов DIEA к решению (таблица 1).
   3. Добавить 10: 1: 10 смесь ангидрида / DMAP / DIEA к смоле и инкубировать в течение 300 сек (25Вт, 75 ° С, Таблица 2). Слейте раствор.
   4. Вымойте смолы с NMP. Добавить NMP к смоле для 120 сек (7 мл, 0 Вт, RT) и слейте раствор. Повторите три раза.
2. Кислота связь
   1. Вымойте смолы с ДМФ. Добавить DMF к смоле в течение 120 сек (7 мл, 0 W, RT) и слейте раствор. Повторите три раза.
   2. Растворить 10 эквивалентов соответствующего дикарбоновой кислоты в ДМФА (5 мл). Добавить 1 эквивалент DMAP и 10 эквивалентов N, N 'диизопропилкарбодиимид (DIC) в растворе (Таблица 1).
   3. Предварительно активировать смесь путем перемешивания в течение 30 мин.
   4. Добавьте смесь к смоле и инкубировать в течение 300 сек (25 Вт, 75 ° C, таблица 2) и слейте раствор.
   5. Вымойте смолы с ДМФ. Добавить DMF к смоле в течение 120 сек (7 мл, 0 W, RT) и слейте раствор. Повторите шаг три раза.

4. N-метилтритила (МТТ) Защита в группах снятия защитыион

Примечание: боковую цепь лизина была защищена с N-метилтритила (МТТ) ^81, защитной группой, которая может быть удалена избирательно в кислых условиях лабильных ^82,83. Снятия защиты Mtt защитную группу вручную в шейкере без микроволновой энергии.

1. Передача смолы в полипропиленовую картриджа, снабженный крышкой и краном вилки.
2. Вымойте смолы с DCM. Добавить DCM к смоле в течение 120 сек (7 мл, 0 W, RT) и слейте раствор. Повторите три раза.
3. Добавить 15-25 мл смеси 1% трифторуксусной кислоты (TFA), 5% триизопропилсилана (TIS), и 94% DCM в полипропиленовой картриджа на один грамм смолы.
   Примечание: ТФК является сильной кислотой и коррозионными и чрезвычайно раздражает кожу, глаза и легочной ткани.
   1. Держите концентрированные растворы ТФК в капюшоне на все времена.
   2. Используйте соответствующие средства индивидуальной защиты (защитные очки, халате и перчатки) и работу в хорошо проветриваемом шкафу. Изменение перчатки Незамедлительноесли они вступают в контакт с ТФК и сразу очистки любых разливов. Если кожа или глаза вступают в контакт с кислотой, промойте пораженный участок промыть водой и вымыть за 15 мин.
4. Поместите картридж полипропиленовый на шейкере и встряхивают в течение 5 мин при комнатной температуре.
5. Слив раствора из полипропилена картриджа с применением вакуума.
6. Повторите шаги 4.3-4.5, три раза.
7. Вымойте смолы с DCM. Добавить DCM к смоле в течение 120 сек (7 мл, 0 W, RT) и слейте раствор. Повторите пять раз.

5. Циклизация линейный пептид

1. Вымойте смолы с DCM. Добавить DCM к смоле в течение 120 сек (7 мл, 0 W, RT) и слейте раствор. Повторите пять раз.
2. В 50 мл полипропиленовую трубку, растворить 5 эквивалентов бензотриазол-1-окси-лы-трис-pyrrolidinophosphonium hexafluorphosphate (РуВОР), в дибромметане (дБм, 5 мл) и добавления 10 эквивалентов DIEA в раствор (таблица 1).
3. Добавьте смесь к смоле и инкубировать в течение 300 сек (25 Вт, 75 ° C, таблица 2). Слейте раствор.
4. Вымойте смолы с DCM. Добавить DCM к смоле в течение 120 сек (7 мл, 0 W, RT) и слейте раствор. Повторите три раза.

6. Расщепление и Снятие защиты боковой цепи групп

1. Промыть смолу ДХМ и диэтиловым эфиром.
   1. Добавить DCM к смоле в течение 120 сек (7 мл, 0 W, RT) и слейте раствор. Повторите два раза.
   2. Добавить диэтиловый эфир к смоле в течение 120 сек (7 мл, 0 W, RT) и слейте раствор. Повторите два раза.
2. Сушат смолы в вакуумном эксикаторе при комнатной температуре в течение по крайней мере 3 ч в течение гидроксида калия (КОН, 1-10 г).
3. Взвешивание высушенного полимера и перенести его на полипропиленовую картриджа.
4. Добавить 10 мл предварительно охлажденного кислоты (TFA) коктейль трифторуксусной расщепления (например, 90% ТФК, 2,5% воды, 2,5% TIS и 5% фенола) к каждому один грамм смолы.
5. Встряхнуть в течение 3 часовпри комнатной температуре.
6. Собирают раствор TFA расщепления путем фильтрации смолы в 50 мл полипропиленовую пробирку. Для фильтрации, использовать фритты, который находится в полипропиленовой картриджа 12 мл.
7. Добавить холодного диэтилового эфира (35 мл) в трубке.
8. Центрифуга течение 5 мин при 1,207 мкг при 4 ° С.
9. Декантировать Эфирный слой.
10. Повторите Шаг 6,7-6,9, в пять раз.

7. Сушка Backbone циклический пептид

1. Хранить осажденного пептида в той же трубе, и высушить его в вытяжном шкафу в течение 30 мин.
2. Растворить пептид в смеси 1: 1 воды и ацетонитрила (ACN).
3. Замораживание окончательное решение продукта в жидком азоте.
4. Лиофилизацией конечного продукта.

8. Характеризуя Backbone циклический пептид

1. Растворите небольшой образец (1 мг) продукта в воде (400 мкл).
2. Вводите растворенного пептида (10-200 мкл) с обращенной фазой высокоэффективной жидкостной chromatograpHY (ОФ-ВЭЖХ) Система для проверки чистоты пептида ^34.
3. Проверить массу пептида помощью масс-спектрометрии матрично-лазерной десорбцией ионизации (MALDI-MS) ^84.
   1. Смешайте 1 мкл (100 мкмоль) пептида в 1: 1 (объем / объем) смеси ацетонитрил: вода с 1 мкл матрицы (5 мг / мл, α-циано-4-гидроксикоричной кислоты) в соотношении 1: 1 (об / объем) смесь ацетонитрила: воды с ТФУ (0,1%).
   2. Пятно 1 мкл на МС-MALDI пластины.
   3. Высушите образец и поместите его в масс-спектрометре.
4. Взвесить пептид и рассчитать процентный выход.
5. Хранить при -20 ° C.

9. Мониторинг Синтез

1. Кайзер (нингидриновый) Тест ⁸⁵
   1. Подготовка реагентов решения.
      1. Получают раствор А путем растворения 16,5 мг калия цианида (KCN) в 25 мл дистиллированной воды. Развести 1 мл вышеуказанного раствора с 49 мл пиридина.
      2. Приготовьте раствор Bрастворением 1 г нингидрина в 20 мл этанола.
      3. Готовят раствор С растворением 40 г фенола в 20 мл этанола.
   2. С помощью теста Кайзера для проверки завершения связи аминокислот или снятия защитной группы.
      1. Передача несколько бусин из смолы в пробирку.
      2. Добавить три капли (~ 100 мкл) каждого раствора (А, В и С) и перемешать.
      3. Нагреть пробирку на нагревательном блоке при 110 ° С в течение 5 мин.
         Примечание: синие шарики (положительный результат) указывают неполное реакции сочетания или снятие защиты Fmoc защитной группы.
2. Хлоранил тест ⁸⁶
   1. Подготовьте следующие реагенты свежие для каждого теста.
      1. Готовят раствор 2% Хлоранил в ДМФА, раствор А.
      2. Готовят раствор 2% ацетальдегида в ДМФА, раствор Б.
   2. Проводят исследование Хлоранил проверки завершения сцепления аминокислоты или тон снятия защитной группы.
      1. Смешайте 100 мкл раствора А 100 мкл раствора В в 1,5 мл пробирку.
      2. Бросьте шарики в и осторожно встряхните в течение 5 мин.
         Примечание: темно-коричневого цвета шарики (положительный результат) указывают снятия защитной группы Fmoc или неполной реакции сочетания.
3. Реакция расщепления Мелкомасштабное
   1. Удалить небольшое количество смолы на 3 мл полипропиленовую картриджа, снабженный крышкой и краном вилки.
   2. Рассматривать с 2 мл смеси 95% TFA, 2,5% воды и 2,5% TIS.
   3. Встряхнуть смесь в течение 30 мин при комнатной температуре.
   4. Удаления смолы фильтрованием, использу фритты полипропилена картриджа и выпаривают растворители потоком азота.
   5. Остаток растворяют в воде и анализируют с помощью ВЭЖХ продукта и / или МС.

10. Лейшмания donovani промастиготы Жизнеспособность в культуре анализе

1. Лейшмания donovani (Л. donovani) роста и лечения условия
   1. Культура Л. donovani promastigotes в модификации Дульбекко из Орла Medium (DMEM) с 4,5 г / л глюкозы, L-глютамина, пируват натрия и в 26 ° C.
   2. Лечить L. donovani promastigotes с циклическими пептидами (100 мкМ) в течение 24 ч при 26 ° С.
2. Лейшмания donovani (Л. donovani) жизнеспособность анализ
   1. Оценка жизнеспособности паразитов с 20 мкл AlamarBlue в соответствии с протоколом производителя.
   2. Определить снижение AlamarBlue по измерения флуоресценции (при 570 нм и возбуждении 590 нм эмиссии). Более высокие значения флуоресценции указывают большую активность метаболизма и увеличение жизнеспособности паразитов.

Results

Здесь мы опишем развитие целенаправленной небольшой библиотекой системообразующих циклических пептидов, которые специфически целевым жизненные ИЦП паразита Leishmania и действовать в качестве противопаразитарных средств (для обзора о пептидов, которые нацелены на ИЦП в качестве противопаразитарных средств ^87). Через синтез новых магистральных циклических пептидов, фармакофоров сохраняются в помосте выдвижной размера. Сила сфокусированного библиотеки предлагаемого здесь является возможность варьироват...

Discussion

Синтез сфокусированного библиотеки магистральных циклических пептидов, полученных из-за отсутствия белка паразита Leishmania использованием полностью автоматизированной микроволновой синтезатор описано. Сосредоточенный библиотека циклических пептидов был разработан с консервативных фармакофоров и различных линкеров. Добавление различных линкеров, таких как глутаровый ангидрид, ангидрид янтарной кислоты, адипиновой кислоты, пимелиновой кислоты, лизин, орнитин и других строительных блоков могут быть использованы ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
Solid Support, Rink Amide AM смола ML	CBL	BR-1330	загрузка: 0,49 ммоль/г
Fmoc-Ala-OH	Advanced Chemtech	FA2100
Fmoc-Arg(Pbf)-OH	Advanced Chemtech	FR2136
Fmoc-Asn(Trt)-OH	Advanced Chemtech	FN2152
Fmoc-Asp(OBut)-OH	Advanced Chemtech	FD2192
Fmoc-Cys(Trt)-OH	Advanced Chemtech	FC2214
Fmoc-Gln(Trt)-OH	Advanced Chemtech	FQ2251
Fmoc-Glu(OtBu)-OH	Advanced Chemtech	FE2237
Fmoc-Gly-OH	Advanced Chemtech	FG2275
Fmoc-His(Trt)-OH	Advanced Chemtech	FH2316
Fmoc-Ile-OH	Advanced Chemtech	FI2326
Fmoc-Leu-OH	Advanced Chemtech	FL2350
Fmoc-Lys(Boc)-OH	Advanced Chemtech	FK2390
Fmoc-Met-OH	Advanced Chemtech	FM2400
Fmoc-Phe-OH	Advanced Chemtech	FF2425
Fmoc-Pro-OH	Advanced Chemtech	FP2450
Fmoc-Ser-(tBu)-OH	Advanced Chemtech	FS2476
Fmoc-Thr(tBu)-OH	Advanced Chemtech	FT2518
Fmoc-Trp(Boc)-OH	Advanced Chemtech	FW2527
Fmoc-Tyr(But)-OH	Advanced Chemtech	FY2563
Fmoc-Val-OH	Advanced Chemtech	FV2575
1-метил-2-пирролидинон (NMP)	Sigma	328634	<сильный>Внимание Токсичное/Легковоспламеняющееся/Раздражающее.
N,N-диметилформамид (DMF)	Alfa Aesar	43465	Caution Toxic. Используйте высококачественный ДМФА для устранения побочных реакций, таких как удаление Fmoc в результате следов диметиламинов при разложении ДМФА.
Дихлорметан (DCM)	Sigma	D65100	<сильный>Внимание Вредный
дибромметан (ДБМ)	Sigma	D41868	<сильный>Осторожно Вредная
трифторуксусная кислота (ТЖК)	Sigma	T62200	<сильный>Внимание Коррозионная/токсичная
трифторуксусная кислота, класс ВЭЖХ (ТФК)	Sigma	91707	<сильное>Внимание Коррозионный/токсичный
Диэтилэтер	Sigma	31690	<сильное>Внимание Легковоспламеняющийся/вредный
триизопропилсилан (TIS)	Sigma	233781	<сильное>Внимание Раздражающая/легковоспламеняющаяся
вода, ВЭЖХ класса	Sigma	270733
Ацетонитроил, ВЭЖХ класса (ACN)	Fisher Научный	A998-4	<сильный>Внимание Легковоспламеняющийся/раздражающий/вредный
<ем>N,N-Диизопропилэтиламин (DIEA)	Sigma	3440	<сильный>Осторожно Коррозионный/легковоспламеняющийся
Пиперидин	Sigma	W290807	<сильный>Осторожно Токсичный/легковоспламеняющийся
Пиридин	Sigma	270970	<сильное>Внимание Легковоспламеняющийся/Вредный
этанол (EtOH)	Sigma		459844<сильное>Внимание Легковоспламеняющееся/раздражающее
1-гидроксибензотриазола гидрат (HOBt)	Sigma	157260	<сильное>Внимание Легковоспламеняющееся/раздражающее/вредное
O-(Benzotriazol-1-yl)-N,N,N′,N′ - тетраметилурония гексафторфосфат (HBTU)	Sigma	12804	Caution Раздражающее/вредное
Бензотриазол-1-ly-oxy-tris-pyrrolidinophosphonium гексафторфосфат (PyBOP)	Advanced Chemtech	RC8602	Caution Раздражающее средство
Ninhydrin	Sigma	454044	<сильное>Внимание Вредно
Phenol	Sigma	P3653	<сильное>Внимание Коррозионный/токсичный
цианистый калий (KCN)	Sigma	11813	<сильное>Осторожно Очень токсичный
гидроксид калия (KOH)	Sigma	221473	<сильное>Внимание Токсичное
N,N' -Диизопропилкарбодиимид (DIC)	Sigma	38370	<сильный>Осторожно Легковоспламеняющийся/Токсичный
4-диметиламинопиридин (ДМАП)	Sigma	522805	<сильный>Осторожно Токсичный/раздражающий
Глутаровый ангидрид	Sigma	G3806	<сильный>Осторожно Легковоспламеняющийся/Раздражающий/Вредный
янтарный ангидрид	Sigma	239690	<сильное>Внимание Раздражающее/Вредное
Адипиновая кислота	Sigma	A26357	<Сильное>Внимание Токсичное/раздражающее Пимелиевая
кислота	Sigma	P45001	<Сильное>Внимание Токсичное/раздражающее
Хлоранил	Сигма	23290	<сильное>Внимание Токсичное/раздражающее
Ацетальдегид	Sigma	402788	<сильный>Внимание Легковоспламеняющийся/Токсичный
<сильный>ОБОРУДОВАНИЕ
Центрифуга	Beckman Coulter	Allegra 6R Центрифуга
Лиофилизатор	Labconco	freezone 4.5
Вакуумный насос	Franklin Electric	модель 1101101416 с мощностью 3/4 л.с	Alcatel насос с Franklin Motor
Полипропиленовый картридж 12 мл	Applied Separation	2419
Пробка колпачка для полипропиленового картриджа 12 мл	Applied Separation	8157
Полипропиленовый картридж 3 мл	Applied Separation	2413
Пробка колпачка для полипропиленового картриджа 3 мл	Applied Separation	8054
Запорные краны PTFE	Applied Separation	2406
Трубки плоские, 50 мл	VWR	21008-240
Экстракционный коллектор, 20 поз, 16 x 100 мм Пробирки	Waters	WAT200609
Shaker, BD adams nutator mixer	Fisher scientific	22363152
Nalgene HDPE узкое горлышко IP2 бутылки, 125  мл	Fisher scientific	03-312-8
Колба Эрленмейера	Fisher Scientific	FB-501, 500 мл
Нагревательный блок	Thermolyne	1760 для сухой ванны
Одноразовые трубки из боросиликатного стекла с гладким концом	Fisher Scientific	14-961-25
Микропипетки и наконечники Finnpipette	Thermo	20– 200 и 100– 1,000 μ l
Флаконы для ВЭЖХ - micro vl pp 400 &; l PK100	VWR	69400-124
Флакон ВЭЖХ - Синий Snap-It Cap	VWR	66030-600
Аналитическая колонка ВЭЖХ	Peeke Scientific	U1-5C18Q-JJ	ultro 120 5 &микро; m C18Q, внутренний диаметр 4,6 мм 150 мм
Преп колонка для ВЭЖХ, XBridge	Воды	OBD C18 5 & микро; м колонка	19 мм & 150 мм
Масс-спектрометр	Прикладные биосистемы	Вояджер DE-RP
Азотный баллон
Десикатор
Аналитическая система RP-HPLC Shimadzu LC-20			оснащена: контроллером системы CBM-20A, детектором SPD-20A, колонной печью CTO-20A, 2 x блоком подачи растворителя LC-20AD, автоподатчиком SIL-20AC, дегазатором DGU-20A5 (Shimadzu, MD, США).
Препаративная система RP-HPLC Shimadzu LC-20			оснащена: контроллером системы CBM-20A, детектором SPD-20A, колонной печью CTO-20A, 2 x блоком подачи растворителя LC-6AD и сборником фракций FRC-10A (Shimadzu, MD, США).