Разработка Backbone циклический пептид библиотека как потенциал Противопаразитарные терапии Использование микроволнового облучения

Summary

Описан простой и общий метод синтеза циклических пептидов с помощью микроволнового облучения. Эта процедура позволяет синтезировать основные циклические пептиды с коллекцией различных конформаций при сохранении боковых цепей и фармакофорных фрагментов, и, следовательно, позволяет проводить скрининг на биоактивную конформацию.

Abstract

Белок-белковые взаимодействия (ИПП) принимают непосредственное участие почти во всех биологических процессов и связан со многими заболеваниями человека. Таким образом, есть серьезные усилия, чтобы цель ИЦП в области фундаментальных исследований, так и в фармацевтической промышленности. Белок-белковые интерфейсы, как правило, большие, плоские, и часто не хватает карманов, усложняя открытие малых молекул, которые нацелены на такие сайты. Альтернативные подходы в отношении использованием антител имеют ограничения из-за плохого пероральной биодоступности, низкая клеток проницаемости и неэффективности производства.

Использование пептидов целевой PPI интерфейсы имеет несколько преимуществ. Пептиды имеют более высокую гибкость, конформационные повышенной селективности и, как правило, недороги. Тем не менее, пептиды имеют свои собственные ограничения в том числе плохой стабильности и неэффективность пересечения клеточных мембран. Чтобы преодолеть эти ограничения, пептид циклизации может быть выполнена. Циклизация было продемонстрировано, чтобы улучшить селективность пептид, Метаболическую стабильность, и биодоступность. Тем не менее, предсказания биологически активный конформацию циклического пептида не является тривиальной. Чтобы преодолеть эту проблему, одна подход привлекательным оно для скрининга библиотеки сфокусированный на экране, в котором все магистральные циклические пептиды имеют одинаковую первичную последовательность, но отличаются параметров, влияющих свою конформацию, таких как размер кольца и положении.

Мы описываем подробный протокол для синтеза библиотеку магистральных циклических пептидов, ориентированные на конкретные паразитов ИЦП. Использование рационального подхода к проектированию, мы разработали пептидов, полученных из леса белка L eishmania рецептора активированной киназы С-(отсутствие). Мы предположили, что последовательности в отсутствии, что сохраняющиеся в паразитов, но не в хозяина млекопитающего гомолога, может представлять сайты взаимодействия для белков, которые имеют решающее значение для жизнеспособности паразитов. Циклические пептиды были синтезированы с использованием микроволнового излучения, чтобы уменьшить время реакции и повыситьЭффективность. Разработка библиотеки системообразующих циклических пептидов с различными размерами кольца облегчает систематическое экран для наиболее биологически активной конформации. Этот метод обеспечивает общий, быстрый и легкий путь к синтезу циклических пептидов.

Introduction

Белок-белковые взаимодействия (ИПП) играют ключевую роль в большинстве биологических процессов, от внутриклеточного передачи сигнала к гибели клеток ^1. Следовательно, ориентации ИЦП имеет фундаментальное значение для фундаментальных исследований и терапевтического применения. ИПП может регулироваться конкретных и стабильных антител, но антитела дорого и сложно в изготовлении и имеют низкую биодоступность. Кроме того, ИПП может быть мишенью малых молекул. Малые молекулы легче синтезировать и недороги по сравнению с антителами; Однако, они относительно менее гибким и подходит лучше небольших полостей, чем крупные белок-белковых интерфейсов ^2,3. Ра....

Protocol

1. Оборудование и реактивы Подготовка

1. Подготовка оборудования
   1. Выполните все шаги внутри вытяжного шкафа с использованием надлежащего средства индивидуальной защиты.
   2. Химически синтезируют пептиды на твердом носителе с использованием микроволновой печью синтезаторе пептидов с дополнительным модулем Discover, снабженный волоконно-оптического датчика температуры для управления микроволновой подачу питания в тефлоновый реактор (30 мл, со стеклянной фритты) или в одноразовую полипропилена Картридж (12 мл, с грубой фритты).
   3. Для правильного смешивания, подключиться азота в реакционный сосуд, или в качестве альтернативы уплотнение обоих....

Results

Здесь мы опишем развитие целенаправленной небольшой библиотекой системообразующих циклических пептидов, которые специфически целевым жизненные ИЦП паразита Leishmania и действовать в качестве противопаразитарных средств (для обзора о пептидов, которые нацелены на ИЦП в качестве противопаразитарных средств ^87). Через синтез новых магистральных циклических пептидов, фармакофоров сохраняются в помосте выдвижной размера. Сила сфокусированного библиотеки предлагаемого здесь является возможность варьироват.......

Discussion

Синтез сфокусированного библиотеки магистральных циклических пептидов, полученных из-за отсутствия белка паразита Leishmania использованием полностью автоматизированной микроволновой синтезатор описано. Сосредоточенный библиотека циклических пептидов был разработан с консервативных фармакофоров и различных линкеров. Добавление различных линкеров, таких как глутаровый ангидрид, ангидрид янтарной кислоты, адипиновой кислоты, пимелиновой кислоты, лизин, орнитин и других строительных блоков могут быть использованы .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
Solid Support, Rink Amide AM смола ML	CBL	BR-1330	загрузка: 0,49 ммоль/г
Fmoc-Ala-OH	Advanced Chemtech	FA2100
Fmoc-Arg(Pbf)-OH	Advanced Chemtech	FR2136
Fmoc-Asn(Trt)-OH	Advanced Chemtech	FN2152
Fmoc-Asp(OBut)-OH	Advanced Chemtech	FD2192
Fmoc-Cys(Trt)-OH	Advanced Chemtech	FC2214
Fmoc-Gln(Trt)-OH	Advanced Chemtech	FQ2251
Fmoc-Glu(OtBu)-OH	Advanced Chemtech	FE2237
Fmoc-Gly-OH	Advanced Chemtech	FG2275
Fmoc-His(Trt)-OH	Advanced Chemtech	FH2316
Fmoc-Ile-OH	Advanced Chemtech	FI2326
Fmoc-Leu-OH	Advanced Chemtech	FL2350
Fmoc-Lys(Boc)-OH	Advanced Chemtech	FK2390
Fmoc-Met-OH	Advanced Chemtech	FM2400
Fmoc-Phe-OH	Advanced Chemtech	FF2425
Fmoc-Pro-OH	Advanced Chemtech	FP2450
Fmoc-Ser-(tBu)-OH	Advanced Chemtech	FS2476
Fmoc-Thr(tBu)-OH	Advanced Chemtech	FT2518
Fmoc-Trp(Boc)-OH	Advanced Chemtech	FW2527
Fmoc-Tyr(But)-OH	Advanced Chemtech	FY2563
Fmoc-Val-OH	Advanced Chemtech	FV2575
1-метил-2-пирролидинон (NMP)	Sigma	328634	<сильный>Внимание Токсичное/Легковоспламеняющееся/Раздражающее.
N,N-диметилформамид (DMF)	Alfa Aesar	43465	Caution Toxic. Используйте высококачественный ДМФА для устранения побочных реакций, таких как удаление Fmoc в результате следов диметиламинов при разложении ДМФА.
Дихлорметан (DCM)	Sigma	D65100	<сильный>Внимание Вредный
дибромметан (ДБМ)	Sigma	D41868	<сильный>Осторожно Вредная
трифторуксусная кислота (ТЖК)	Sigma	T62200	<сильный>Внимание Коррозионная/токсичная
трифторуксусная кислота, класс ВЭЖХ (ТФК)	Sigma	91707	<сильное>Внимание Коррозионный/токсичный
Диэтилэтер	Sigma	31690	<сильное>Внимание Легковоспламеняющийся/вредный
триизопропилсилан (TIS)	Sigma	233781	<сильное>Внимание Раздражающая/легковоспламеняющаяся
вода, ВЭЖХ класса	Sigma	270733
Ацетонитроил, ВЭЖХ класса (ACN)	Fisher Научный	A998-4	<сильный>Внимание Легковоспламеняющийся/раздражающий/вредный
<ем>N,N-Диизопропилэтиламин (DIEA)	Sigma	3440	<сильный>Осторожно Коррозионный/легковоспламеняющийся
Пиперидин	Sigma	W290807	<сильный>Осторожно Токсичный/легковоспламеняющийся
Пиридин	Sigma	270970	<сильное>Внимание Легковоспламеняющийся/Вредный
этанол (EtOH)	Sigma		459844<сильное>Внимание Легковоспламеняющееся/раздражающее
1-гидроксибензотриазола гидрат (HOBt)	Sigma	157260	<сильное>Внимание Легковоспламеняющееся/раздражающее/вредное
O-(Benzotriazol-1-yl)-N,N,N′,N′ - тетраметилурония гексафторфосфат (HBTU)	Sigma	12804	Caution Раздражающее/вредное
Бензотриазол-1-ly-oxy-tris-pyrrolidinophosphonium гексафторфосфат (PyBOP)	Advanced Chemtech	RC8602	Caution Раздражающее средство
Ninhydrin	Sigma	454044	<сильное>Внимание Вредно
Phenol	Sigma	P3653	<сильное>Внимание Коррозионный/токсичный
цианистый калий (KCN)	Sigma	11813	<сильное>Осторожно Очень токсичный
гидроксид калия (KOH)	Sigma	221473	<сильное>Внимание Токсичное
N,N' -Диизопропилкарбодиимид (DIC)	Sigma	38370	<сильный>Осторожно Легковоспламеняющийся/Токсичный
4-диметиламинопиридин (ДМАП)	Sigma	522805	<сильный>Осторожно Токсичный/раздражающий
Глутаровый ангидрид	Sigma	G3806	<сильный>Осторожно Легковоспламеняющийся/Раздражающий/Вредный
янтарный ангидрид	Sigma	239690	<сильное>Внимание Раздражающее/Вредное
Адипиновая кислота	Sigma	A26357	<Сильное>Внимание Токсичное/раздражающее Пимелиевая
кислота	Sigma	P45001	<Сильное>Внимание Токсичное/раздражающее
Хлоранил	Сигма	23290	<сильное>Внимание Токсичное/раздражающее
Ацетальдегид	Sigma	402788	<сильный>Внимание Легковоспламеняющийся/Токсичный
<сильный>ОБОРУДОВАНИЕ
Центрифуга	Beckman Coulter	Allegra 6R Центрифуга
Лиофилизатор	Labconco	freezone 4.5
Вакуумный насос	Franklin Electric	модель 1101101416 с мощностью 3/4 л.с	Alcatel насос с Franklin Motor
Полипропиленовый картридж 12 мл	Applied Separation	2419
Пробка колпачка для полипропиленового картриджа 12 мл	Applied Separation	8157
Полипропиленовый картридж 3 мл	Applied Separation	2413
Пробка колпачка для полипропиленового картриджа 3 мл	Applied Separation	8054
Запорные краны PTFE	Applied Separation	2406
Трубки плоские, 50 мл	VWR	21008-240
Экстракционный коллектор, 20 поз, 16 x 100 мм Пробирки	Waters	WAT200609
Shaker, BD adams nutator mixer	Fisher scientific	22363152
Nalgene HDPE узкое горлышко IP2 бутылки, 125  мл	Fisher scientific	03-312-8
Колба Эрленмейера	Fisher Scientific	FB-501, 500 мл
Нагревательный блок	Thermolyne	1760 для сухой ванны
Одноразовые трубки из боросиликатного стекла с гладким концом	Fisher Scientific	14-961-25
Микропипетки и наконечники Finnpipette	Thermo	20– 200 и 100– 1,000 μ l
Флаконы для ВЭЖХ - micro vl pp 400 &; l PK100	VWR	69400-124
Флакон ВЭЖХ - Синий Snap-It Cap	VWR	66030-600
Аналитическая колонка ВЭЖХ	Peeke Scientific	U1-5C18Q-JJ	ultro 120 5 &микро; m C18Q, внутренний диаметр 4,6 мм 150 мм
Преп колонка для ВЭЖХ, XBridge	Воды	OBD C18 5 & микро; м колонка	19 мм & 150 мм
Масс-спектрометр	Прикладные биосистемы	Вояджер DE-RP
Азотный баллон
Десикатор
Аналитическая система RP-HPLC Shimadzu LC-20			оснащена: контроллером системы CBM-20A, детектором SPD-20A, колонной печью CTO-20A, 2 x блоком подачи растворителя LC-20AD, автоподатчиком SIL-20AC, дегазатором DGU-20A5 (Shimadzu, MD, США).
Препаративная система RP-HPLC Shimadzu LC-20			оснащена: контроллером системы CBM-20A, детектором SPD-20A, колонной печью CTO-20A, 2 x блоком подачи растворителя LC-6AD и сборником фракций FRC-10A (Shimadzu, MD, США).