Методическая статья

Отслеживание клеток в GFP-трансгенной данио рерио Использование системы Photoconvertible PSmOrange

DOI:

10.3791/53604

⸱

5 февраля 2016 г.

 ,  ,  , 
1Medical Faculty Mannheim, Department of Cell and Molecular Biology, Heidelberg University, 2COS and Nikon Imaging Center at the University of Heidelberg, Heidelberg University, 3Excellenzcluster CellNetworks, University of Heidelberg

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы создали фотоконвертируемую систему PSmOrange как мощный, простой и недорогой инструмент для отслеживания клеток in vivo в трансгенных фонах GFP. Этот протокол описывает его применение в модельной системе рыбок данио.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Быстрое развитие прозрачных эмбрионов рыбок данио (Danio rerio) в сочетании с флуоресцентным мечением клеток и тканей позволяет визуализировать процессы развития так, как они происходят у живого животного. Представляющие интерес клетки могут быть помечены с помощью тканеспецифического промотора, который стимулирует экспрессию флуоресцентного белка (FP) для генерации трансгенных линий. Использование для этой цели флуоресцентных фотоконвертируемых белков позволяет дополнительно точно проследить за определенными структурами в пределах домена экспрессии. Подсветка белка в исследуемой области изменяет спектр его излучения и выделяет конкретную клетку или кластер клеток, оставляя другие трансгенные клетки в их первоначальном цвете. Основным ограничением является отсутствие известных промоторов для большого количества тканей у рыбок данио. С другой стороны, экраны ловушек генов и энхансеров генерируют огромные трансгенные ресурсы, дискретно помечая буквально все эмбриональные структуры, в основном GFP или, в меньшей степени, красными или желтыми FP. Подход к отслеживанию определенных структур в таких трансгенных фонах заключается в дополнительном введении вездесущего фотоконвертируемого белка, который может быть преобразован в интересующей клетке (клетках). Тем не менее, доступные фотоконвертируемые белки имеют зеленое и/или реже красное состояние излучения1 и поэтому часто не могут быть использованы для отслеживания клеток в FP-фоне существующих трансгенных линий. Чтобы обойти эту проблему, мы создали систему PSmOrange для рыбок данио2,3. Простая микроинъекция синтетической мРНК, кодирующей ядерную форму этого белка, помечает все ядра клеток оранжевой/красной флуоресценцией. При целенаправленной фотоконверсии белка он переключает свой спектр излучения на дальний красный. Квантовая эффективность и стабильность белка делают PSmOrange превосходным инструментом отслеживания клеток для рыбок данио и, возможно, других видов костистых рыб.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Экспоненциально улучшающиеся методы визуализации позволяют отслеживать процессы развития в течение периодов времени до примерно четырех дней подряд3. В рыбках данио и многих других животных модельных системах определенные клетки, ткани, аксональные или сосудистые структуры помечены трансгенными зелеными или иногда красными или желтыми флуоресцентными белками для облегчения визуализации. Однако в большинстве трансгенных линий трансген экспрессируется не в представляющих интерес клетках, а в дополнительных структурах, что затрудняет точное отслеживание, например, отдельных клеток или групп клеток.

Флуоресцентные фотоконвертируемые белки хорошо подходят для отслеживания клеток во время эмбрионального развития. Предпосылками для применения таких белков являются долгоживущая природа, хорошо разнесенный диапазон излучения при конверсии и яркая флуоресценция. Доступные фотоконвертируемые белки включают те, которые изменяют свой диапазон излучения при конверсии, такие как Kaede4, KiGR5, mEos26, PS-CFP2 или Dendra27, и другие, которые флуоресцентны только при фотоактивации (PAmCherry8, PAGFP9 или PATagRFP10). Однако их применение для отслеживания клеток у существующих FP-трансгенных животных ограничено, поскольку они часто включают зеленое флуоресцентное состояние или не удовлетворяют всем вышеперечисленным критериям. Совсем недавно Субач и его коллеги сообщили о белке PSmOrange, который изменяет свое излучение с оранжевого/красного на дальний красный при фотоконверсии и был успешно применен в клетках в культуре и культивируемых клетках, введенных мышам2.

Чтобы исследовать пригодность белка для отслеживания клеток в живом эмбрионе, мы создали экспрессионную конструкцию для микроинъекции H2B-PSmOrange с ядерной меткой в эмбрионы рыбок данио. Мы обнаружили, что белок выполняет все предпосылки для успешного отслеживания клеток в трансгенном фоне GFP в течение первых 4 (а возможно, и более) дней эмбрионального развития рыбок данио. За это время у рыб завершается большая часть миграционных процессов клеток, что делает систему PSmOrange отличным дополнением к набору инструментов для рыбок данио.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Н2В-PSmOrange мРНК In Vitro Транскрипция и мРНК Очистка

  1. Линеаризуем H2B-PSmOrange содержащий шт.2 + плазмиды с помощью фермента рестрикции NotI в соответствии с инструкциями изготовителя.
    Примечание: Выполните следующие шаги, используя соответствующие средства защиты, такие как перчатки и халате, чтобы предотвратить загрязнение и деградацию мРНК.
  2. Очищают линеаризованной ДНК с использованием набора для очистки или фенол-хлороформ методы, основанные ПЦР в соответствии с протоколами производителей.
  3. Используйте 1 мкг линеаризованной ДНК-матрицы для транскрипции Sp6-мРНК в соответствии с инструкциями изготовителя.
  4. Удалить ДНК добавлением 1,0 U РНКазы DNAseI в течение 10-20 мин при 37 ° С.
  5. Очистка мРНК с использованием РНК очистки на комплект в соответствии с протоколом производителя.
  6. Для повышения чистоты мРНК и концентрации, осаждения мРНК путем добавления 6 мкл ацетата натрия (3,0 М, рН 5,2) и 150 мкл 96% этанола. Выдержите мixed раствор при -20 ° С в течение по меньшей мере 30 мин и до 24 ч.
  7. Собирают мРНК, вращая раствора при 18.407 х г в течение 45 мин при 4 ° С. Отменить жидкость и ресуспендируют мРНК в 150 мкл 70% этанола. Смешайте и центрифугировать раствор в течение дополнительных 15 мин при 4 ° С. Откажитесь от жидкости, сушить гранулы в течение 5 минут на льду и ресуспендируют мРНК в 20 мкл сверхчистой РНКазы свободной воды.
  8. Оценка концентрации и чистоты мРНК фотометрического измерения 1: мРНК разбавления 100 (мРНК 1 мкл в 99 мкл сверхчистой РНКазы свободной воды).
  9. Для кратковременного хранения, держать решение мРНК при -20 ° С. Для длительного хранения, держать мРНК при -80 ° С.

2. Н2В-PSmOrange мРНК микроинъекции в эмбрионы рыбок данио

  1. Настройка спаривания парах ночь перед инъекцией с использованием TG (Foxd3: GFP); TG (FLH: GFP) дважды трансгенных рыб (или любой другой GFP трансгенных рыб). Оставьте рыбу разделенных размещения распоркумежду ними, чтобы контролировать время спаривания.
  2. Удалить прокладку утром впрыска и пусть сопряжение рыбы в течение 20 мин.
  3. Во время спаривания, разбавить мРНК Н2В-PSmOrange к конечной концентрации 130 пг / нл (в РНКазы свободной воды) и передача 6 мкл раствора для инъекций в микроинъекции капилляра с использованием наконечника microloader. Проверьте объем впрыска с помощью калиброванного стекло. Отрегулируйте давление впрыска до придать 2 NL решение мРНК (260 PG).
  4. Сбор яйца в стерилизованные пластиковые чашки Петри, содержащей 1x эмбрионов (E3) среде.
  5. Передача от 20 до 30 эмбрионов с инъекционной чашки с помощью пластиковой пипетки Пастера.
  6. Вводят 2 NL мРНК, содержащие раствор в клетке или чуть ниже ячейки в желток на стадии одной клетки 11.
  7. Передача вводили эмбрионы в чашке Петри, содержащей 1x E3 среду, удалить неоплодотворенные или нет нормально развивающихся эмбрионов и выращивать их при 28 ° С.
    Примечание: Светозащита Oе эмбрионов не требуется в течение всего эксперимента.
  8. Повысить эмбрионов данио в 1x E3 среды и добавить 0,2 мм ПТУ (1-фенил-2 тиомочевины) после гаструляции ингибировать пигментацию. Изменение среды дважды в день, чтобы свести к минимуму опасность бактериальных загрязнений.

3. Эмбрион Вложение

  1. Выберите GFP (зеленый) и PSmOrange (оранжевый / красный) коэкспрессирующей эмбрионов с использованием бинокулярного микроскопа, снабженного флуоресценции лампы и соответствующие фильтры выбросов. Перенесите положительные эмбрионов в стерильной чашке Петри, содержащей 1x E3 среду.
  2. Dechorionate эмбрионы под стереомикроскопа с помощью щипцов 12.
  3. Передача одного эмбриона в 1,5 мл пробирку, содержащую 1,0 мл подогретого 1,0% агарозы низкой температурой (LMA), полученного в сверхчистой воды с помощью отключения пипетки (P200). Примечание: Нагреть LMA до 80 ° С и остыть в течение 3-5 минут при комнатной температуре, прежде чем вложение эмбрион.
  4. Передача эмбриона в 150 мкл LMA впатрон покровного стекла и отрегулировать ориентацию эмбриона, например спинной стороной вниз в эксперименте, описанном в перевернутом конфокальной лазерной сканирующей микроскопии A1R + (или любого другого подходящего микроскопом), с помощью тонкой пластмассовый наконечник. Когда LMA полимеризуется, заполнить камеру с рыбой в воде, содержащей 0,2 мм ПТУ и 0,02% этил-3-аминобензойной метансульфонат (Tricaine) для анестезии.
  5. Перед визуализации образца, подождите 15 минут, чтобы выяснить влияние Tricaine. Анестезии предотвращает движения эмбрион, который можно контролировать с помощью стереомикроскопа, снабженного светлого освещения.
    Примечание: Камеры могут быть повторно использованы в два раза.

4. PSmOrange фотоконверсии

  1. Поместите образец под микроскопом и конфокальной сканирования образца с указанием зоны, чтобы photoconvert использованием 488 нм и 561 нм лазеров для визуализации GFP и PSmOrange соответственно.
    Примечание: Используйте перевернутую конфокальной лазерной сканирующей микроскопии A1R + на перевернутой ГНАGE TiEcontrolled с помощью программного обеспечения визуализации микроскопа и оснащены 488 нм, 561 нм и 640 нм лазеров для фотоконверсии и визуализации. Однако применение, конечно, не ограничено этим микроскопом тех пор, пока лазерные линии для преобразования и обработки изображений доступны.
    1. Поместите цель 20X воздуха в месте (NA: 0,75; WD: 1.0 мм; угол обзора: 0,64 х 0,64 мм).
    2. Используйте следующие параметры микроскопа для обнаружения белка PSmOrange Перед фотоконверсии: 561 нм лазер, 0,74 мВт, измеренную при фокальной плоскости выше цели.
      Примечание: Это соответствует 40% от этой системы (измерение в фокальной плоскости является единственным способом для определения эффективной мощности). Регулировка мощности лазера согласно экспериментальным потребностей как эффективность инъекций Н2В-PSmOrange может меняться.
    3. Добавить факторы масштабирования, чтобы выделить интересующую область. Увеличениями сократить время получения изображений и, следовательно фототоксичности.
  2. Приобретать Z-стек, закрывающую структуруs интерес, используя 488 нм и 561 нм лазеров в последовательном режиме (режим линии 1-> 4). Закрепить Z-шаг между 1,0 и 2,0 мкм. Линия среднем и частота развертки может быть использован для оптимизации качества изображения.
  3. Сканирование образца и выберите интересующую область (ROI) инструмента, чтобы выделить область для photoconvert. Закрепить ROI как область стимуляции. Выберите модуль стока Активация / отбеливания, активировать 488 нм лазер, проверяя соответствующий флажок и установите 488 нм лазер до 80% (1 мВт мощности лазера, измеренный на цели). Установить скорость сканирования до 0,5 сек / кадр.
  4. Откройте фотопреобразования полезность (ND стимуляции) и задайте параметры фотоконверсии.
    1. Нажмите на команду "Добавить", чтобы указать протокол фотопреобразования.
    2. Набор "Фаза" 1 в меню "Приобретение / стимуляции» на «приобретение» и указать количество изображений, которые будут приобретены до фотоконверсии в меню "петли".
    3. Набор "Фаза" 2 "Stimulation "и ввести номер стимуляции событий должны быть выполнены.
    4. Регулировка "Фаза" 3, как описано для "Фаза" 1. Дополнительно, вставить ожидание "Фаза" после "Фаза" 2 при вводе времени, чтобы ждать до последнего раунда получения изображения.
    5. После того как все параметры заданы, применить настройку стимуляции и запустить фотоконверсии.
      Примечание: Мощность лазера, частота сканирования и число итераций для каждого раунда фотоконверсии может варьироваться и отличаться от эмбриона эмбриона. Установка для запуска с показан в таблице 1.
  5. Приобретать окончательное Z-стек, используя 488 нм, 561 нм и 640 нм лазеров применения настроек, как указано выше. Установите 640 нм лазер для визуализации преобразованный PSmOrange используя высокую мощность лазера (до 4,5 мВт).

5. Демонтаж эмбрионов от LMA

  1. Удалить эмбрион, содержащий камеру с микроскопом. Осторожно снимите эмбрион из агарозного Uпеть щипцов.
  2. Передача эмбриона в новом стерилизуют пластиковой чашке Петри или в стерилизованную 6-луночного планшета, содержащего 1x E3 и 0,2 мм ПТУ. Инкубируйте эмбрион при 28 ° С до желаемой стадии развития.

6. Анализируя судьбу Photoconverted PSmOrange белковых клеток, экспрессирующих

  1. Re-внедрить эмбрион, как описано в пунктах 3.3 и 3.4.
  2. Поместите образец под микроскопом и конфокальной сканирования образца для идентификации photoconverted клетки (640 нм) при GFP трансгенной интересующей структуры (488 нм).
  3. Приобретать Z-стек, охватывающий структур, представляющих интерес с помощью 488 нм, 561 нм и 640 нм лазеров в последовательном режиме (режим линии 1-> 4). Закрепить Z-шаг между 1,0 и 2,0 мкм. Линия среднем и частота развертки может быть использован для оптимизации качества изображения.
  4. Используйте один из следующих методов для идентификации клеток, которые взаимодействуют экспресс GFP и photoconverted белок.
    1. На заказ автоматические Фиджи ИзображениеJ Макро 3
      1. Размывания оригинальная стека с помощью "GaussianBlur" плагин (→ Процесс → Фильтры → GaussianBlur) и вычесть гладкую стеки от оригинала с помощью "изображение калькулятора" плагин (→ Процесс → Калькулятор Изображение). Используйте этот шаг, чтобы визуализировать структуры интереса и уменьшить время вычислений для анализа.
      2. Применить определенные пороговые значения на зеленые и дальней красной каналов для того, чтобы подчеркнуть photoconverted клетки (→ Изображение → Настройка → Порог). Используйте "Анализ частиц" инструмент для обнаружения пороговых областей с подходящей настройкой (→ Анализ → Анализ частиц).
      3. Откройте "Изображение Калькулятор" плагин и отображения перекрывающихся трансформирования в зеленом и дальнего красного канала в желтом (→ Процесс → Image Calculator).
    2. ПО для обработки изображений микроскоп для оценки данных 3D
      1. Отображение стека в3D с помощью опции просмотра шоу громкости (→ 3D Визуализация меню → Том View). Используйте графический интерфейс для выбора зеленый, красный и дальнего красного каналов, регулировки яркости и контрастности и обрезать 3D стек, чтобы выделить photoconverted область (рисунок 1).
        Примечание: Подобные методы анализа данных доступны в большинстве популярных программ для анализа изображений.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Рисунок 1 иллюстрирует пример системы PSmOrange фотопреобразования. Шишковидной Комплекс представляет собой консервативный структура в позвоночных спинной промежуточного мозга. Как и во многих других позвоночных, этот комплекс состоит из шишковидной органа в центре промежуточного мозга и parapineal клеток левосторонней. Элегантные, но трудоемкие uncaging эксперименты показали, что parapineal клетки происходят в передней части шишковидной органа 13. В ТГ (Foxd3...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Трансгенные эмбрионы, несущие флуоресцентные журналистам помогли принципиально понять эмбриональное развитие. Тем не менее, есть еще насущную необходимость промоторов для облегчения конкретного визуализацию конкретных конструкций. В их отсутствие, исследователи опираются на методы, такие как фотопревращения флуоресцентных белков, чтобы узнать о происхождении и развитии их структуры, представляющей интерес. Это, в свою очередь, является важнейшей предпосылкой для выявления молекулярных механизмов, участвующих в его разви...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим O. Subach за предоставление оригинальной плазмиды H2B-PSmOrange и нашу команду по уходу за рыбами. Мы благодарны Центру обработки изображений Nikon при Гейдельбергском университете за доступ к оборудованию для микроскопии и программному обеспечению для анализа. Мы выражаем признательность за поддержку Core Facility Live Cell Imaging Mannheim в CBTM (DFG INST 91027/10-1 FUGG). Эта работа была поддержана Excellenzcluster CellNetworks, EcTop Spatio-time coordination of signaling processes (EcTop 2), Университетом Гейдельберга для C.A.B. и Медицинским факультетом Мангейма Университета Гейдельберга и DFG (FOR 1036/2, 298/3-1 и 298/6-1) для M.C.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Набор для очистки ПЦРQiagen28104
mMESSAGE mMACHINE SP6 Набор для транскрипцииAmbionAM1340
RNeasy MiniElute Cleanup KitQiagen74204
Пластик Пастеральфа лабораторииLW4000
Original H2B-PSmOrange PlasmidAddgene31920Плазмида, описанная в статье, является доступно в Carl
lab FemtoJet МикроинъекторEppendorf5247 000.013
Щипцы (5 Inox)NeoLab2-1633
Lab-Tek II Chambered #1.5 Немецкая система защитных стекол Nunc155382
Nikon A1R+Nikon GmbH ГерманияБез номера
Nikon PLAN Apo λ 20X воздушный объектив Nikon GmbH ГерманияБез номера
NIS Элементы AR Программное обеспечение (v. 4.30.02)Nikon GmbH Германия/Лабораторная визуализацияNo Номер

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lombardo, V. A., Sporbert, A., Abdelilah-Seyfried, S. Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development. J. Vis. Exp. (4350), (2012).
  2. Subach, O. M., et al. A photoswitchable orange-to-far-red fluorescent protein, PSmOrange. Nature Methods. 8, 771-777 (2011).
  3. Beretta, C. A., Dross, N., Bankhead, P., Carl, M. The ventral habenulae of zebrafish develop in prosomere 2 dependent on Tcf7l2 function. Neural Development. 8, 19(2013).
  4. Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 12651-12656 (2002).
  5. Habuchi, S., Tsutsui, H., Kochaniak, A. B., Miyawaki, A., van Oijen, A. M. mKikGR, a monomeric photoswitchable fluorescent protein. PLoS One. 3, e3944(2008).
  6. McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein. Nature Methods. 6, 131-133 (2009).
  7. Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2 and Dendra2. Nature Protocols. 2, 2024-2032 (2007).
  8. Subach, F. V., et al. Photoactivatable mCherry for high-resolution two-color fluorescence microscopy. Nature Methods. 6, 153-159 (2009).
  9. Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells. Science. 297, 1873-1877 (2002).
  10. Subach, F. V., Patterson, G. H., Renz, M., Lippincott-Schwartz, J., Verkhusha, V. V. Bright monomeric photoactivatable red fluorescent protein for two-color super-resolution sptPALM of live cells. J Am Chem Soc. 132, 6481-6491 (2010).
  11. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), e1115(2009).
  12. JoVE Science Education Database. Essentials of Biology 2: Mouse, Zebrafish, and Chick. Zebrafish Breeding and Embryo Handling. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5150/zebrafish-breeding-and-embryo-handling (2015).
  13. Concha, M. L., et al. Local tissue interactions across the dorsal midline of the forebrain establish CNS laterality. Neuron. 39, 423-438 (2003).
  14. Auer, T. O., Duroure, K., Concordet, J. P., Del Bene, F. CRISPR/Cas9-mediated conversion of eGFP- into Gal4-transgenic lines in zebrafish. Nature Protocols. 9, 2823-2840 (2014).
  15. Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome Research. 24, 142-153 (2014).
  16. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322, 1065-1069 (2008).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

ZImage J FijiNIS Elements

Похожие статьи