Методическая статья

Первичный энтодермальная эпителиальной клетки культуры из желтка мембраны японского перепела Эмбрионы

8.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/53624

⸱

10 марта 2016 г.

 ,  ,  , 
1Department of Animal Science and Technology, National Taiwan University

В этой статье

Краткое содержание

Для изучения механизма утилизации липидов в мембранах желточного мешка на поздних стадиях эмбрионального развития птиц мы создали первичную систему культивирования эмбриональных эндодермальных эпителиальных клеток японского перепела.

Аннотация

Мы установили энтодермальную эпителиальной модель клеточной культуры (EEC) для изучения функции некоторых ферментов и белков в опосредовании использование пищевых веществ эмбрионов птиц в процессе разработки. Оплодотворенные Японские перепелиные яйца инкубировали при 37 ° С в течение 5 дней, а затем желток собирали мешка мембраны (YSM) установить ЕЭС систему культуры. Мы выделили эмбриональную энтодермы слой из YSM, и разрезали мембрану в 2 - 3 мм кусочки и частично переваривают коллагеназы перед посевом в 24-луночные культуральные планшеты. ОЦОД пролиферируют из ткани и готовы для проведения исследований на клеточных культурах. Мы обнаружили , что ОЦОД имели типичные характеристики YSM в естественных условиях, например, накопление липидных капель, экспрессия стерол O-ацилтрансферазы и липазы липопротеинов. Частичное лечение пищеварение значительно увеличило успешную ставку ЕЕС культуры. Используя EECS, мы показали, что экспрессия SOAT1 регулируется цАМФ гependent протеинкиназы связанный путь. Эта первичная японская система перепела ЕЕС культура является полезным инструментом для изучения эмбриональных липидный транспортировки и уточнить роль генов, участвующих в опосредовании использования питательных веществ в YSM во время эмбрионального развития птиц.

Введение

Основной питательный ресурс птичьего эмбриона желток, состоящий из 33% липидов, 17% белка, и 1% золы. 1 Во время эмбрионального развития желточный мешок мембрана (YSM) растет изнутри эмбриональном брюшной полости и постепенно охватывает желток поверхность. Начиная со 2 -й день эмбрионального, экспрессия генов , связанные с липидного обмена и ангиогенеза постепенно увеличивается в YSM и YSM развивается медленно ворсинок выступы. 8,9 Эти прогнозы увеличивают всасывание питательных веществ желтка для поддержки эмбрионального развития. YSM является внезародышевый ткани , которая содержит три зародышевых листка, энтодермы, мезодермы и эктодермы. 14 желточный мешок эктодерма лица белке и связи с желточной оболочки , чтобы мягко покрыть желтка. Энтодермальные эпителиальные клетки сталкиваются непосредственно к яичным желтком и служат в качестве питательных порталов утилизации. 6 По мере расширения YSM, энтодермальную эпителиальной клетки (EECS) можно разделить на Шапе и функциональность на две группы, площадь желточными и площадь vasculosa. 7

Площадь желточная состоит из клеток эндодермы и отстоит от эмбриона; Площадь vasculosa состоит из клеток мезодермы и охватывает дифференцированные EECS с кровеносных сосудов и соединительной ткани. Эмбриональным 5-й день, желток полностью покрыта эктодермы и энтодермы из YSM и сосудистый площадь быстро растет. YSM поглощает, recomposes и освобождает липиды (как желток происхождения липопротеинов очень низкой плотности) и белков в эмбриональном кровеносную систему. 9, 2 Таким образом, мы установили первичный японский перепел эмбриональных энтодермальную эпителиальной системы культивирования клеток, чтобы изучить механизмы липида использование в YSM во время эмбрионального развития птиц.

Липиды, такие как триацилглицерина, лецитина, фосфолипидов и эфиров холестерина (СЕ) являются основными источниками энергии для эмбрионов птиц. На ранних стадиях развития, желток липиды сomposed из всего лишь 1,3% CE и повышается до 10-15% в среднесрочной перспективе птичьего эмбрионального развития 3, 11 Сложный эфир холестерина. синтезируется из холестерина стерол O-ацилтрансферазы 1 (SOAT1) в области птичьего эмбриона YSM. 4

Форма хранения холестерина CE, CE осуществляется в липопротеинов и липопротеины транспортируется циркуляционной к тканям. 13 За неделю до люка происходит быстрый рост эмбрионов птиц. Примерно 68% из оставшихся содержание липидов в желтке всасываются во время этой стадии. 10 Механизм , посредством которого желток липиды используются могут быть уточнены с помощью ЕЕС исследовательской модели. Протокол культура курица ЕЕС была создана для достижения этой цели исследования. 2, 9 Тем не менее, из - за низкой вероятностью успеха эксплантов ткани усовершенствованную процедуру ЕЕС культивирования клеток необходима для изучения функции некоторых ферментов и белков в опосредовании использование питательных веществ путем эмбрионов птиц в процессе разработки.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Примечание: Эта процедура представляет собой модификацию протокола культуры куриной модели , разработанной Бауэром и др 2013 и Наказава др 2011. 2,9..

1. Подготовить здоровый эмбриональном 5-й день эмбрионы из японского перепела

  1. 1-е место мужского и женского пола 3 половозрелых японского перепела вместе в одной клетке. Подача питания и воды вволю. Отрегулировать свет в животном помещении до 14 ч света и 10 ч темноты.
  2. Соберите оплодотворенную икру в пластиковых мешках каждый день во второй половине дня и держать их в 16 ° C холодильник, чтобы замедлить скорость роста эмбрионов.
  3. После сбора достаточного количества яиц в течение двух недель, инкубировать оплодотворенные яйца в 37 ° C инкубаторе с хорошей вентиляцией в течение пяти дней.

2. Подготовка базальной среды и промывные растворы

  1. С помощью DMEM / F-12 среду (рН доводили до 7,2) в качестве среды для роста, и дополнить его10% новорожденный телячьей сыворотки (NBCs) и 1% Пен-Strep Ampho. Раствор (ПСА; пенициллина, 10 5 ед / л стрептомицина, 100 мг / л, амфотерицин В, 0,25 мг / л).
  2. Готовят раствор фосфатно-буферный раствор (PBS), на 10-кратным концентрации для хранения; использовать 1x раствор PBS (содержащий NaCl, 137.93 мМ; KCl, 2,667 мМ, KH 2 PO 4, 1.471 мм, Na 2 HPO 4 -7Н 2 O, 8,06 мМ, доведения рН до 7,2) помыть и увлажнить желтка мембраны время отделение энтодермы от яичного желтка и альбумина.
  3. Используйте DMEM среду (рН доводили до 7,2), чтобы вновь приостановить энтодермы гранул.

3. Сбор первичных EECS от японского перепела YSMs

  1. Выдержите собранные яйца в течение 5 дней (этап 1.3). Осмотрите яйца от яйца Кандлер, чтобы подтвердить нормальное эмбриональное развитие.
    Примечание: На 5-й день эмбрионального, граница YSM мезодермы очень ясно и 3 эмбриональные слои менее плотно связаны друг с другом, так что легко ОбьТайн эндодермы. Используйте только яйца, показывающие нормальное развитие капиллярного кровообращения для коллекций YSM.
  2. Очистите скорлупу тщательно с использованием пресной воды и 75% этанола. Откройте скорлупу из положения воздушной камеры с помощью пары ножниц, мягко кожуры и собрать всю YSM пинцетом и поместить в 10 см блюдо культуры, наполненную 37 ° C 1x PBS.
  3. С помощью пары ножниц удаления эмбриона, желток и белок яичный, и осторожно промыть YSM с 1x PBS три раза и поместите YSM в растворе PBS в культуральной чашке 10 см.
  4. Используйте пинцет и ножницы, чтобы удалить эктодерму из YSM. Используйте 2 щипцов, один, чтобы прочно удерживать слой эндодермы клетки, а другой держать капиллярную мезодермы.
  5. Под микроскопом рассекает, растащить и отделить энтодерму от края мезодермы в направлении эмбриона. Собирают светло-желтый энтодермы в 50 мл центрифужные пробирки с помощью пипетки и место в 15 мл ростовой среды в 37 ° C Ватаэр ванны, пока все коллекции тканей не будут завершены.

4. Расщепление энтодермы Ломтики по коллагеназы

  1. Свежеиспеченный раствориться 6,5 единиц IV коллагеназы типа в 10 мл DMEM.
  2. Центрифуга 50 мл трубки (3.4) при 130 х г в течение 3 мин при комнатной температуре. Аспирируйте среды и поместить все энтодерму в культуральной чашке 6 см с помощью пипетки. Добавить раствор коллагеназы 1 мл к этой культуре блюдо.
  3. Нарезать энтодерму собранную из 2-х эмбрионов перепела с парой изогнутых ножниц до размера каждого среза составляет примерно от 2 до 3 мм. Используйте капельницы, собрать все кусочки в 50 мл центрифужные пробирки вместе с 9 мл раствора коллагеназы свежего.
  4. Дайджест ткани с коллагеназой в течение 30 мин в ванне 37 ° C встряхивания воды при 175 оборотах в минуту. Это частичное расщепление коллагеназой используется для улучшения пролиферации клеток эксплантов.
  5. Центрифуга при 130 х г в течение 3 мин при комнатной температуре и осторожно удалить фракцию супернатанта с помощью пипетки, Промывают осадок опусканием в 20 мл DMEM и удалить фракцию супернатанта после 130 XG центрифугированием в течение 3 мин.
  6. Повторно приостанавливать осадок с 12 мл ростовой среды (DMEM / F12 с добавлением 10% NBCS и 1% PSA) и семена мягко и равномерно в 24-луночный планшет (каждый раствор хорошо с 500 мкл клеток).
  7. Выдержите эксплантов ткани при температуре 37 ° С в 5% CO 2 в воздухе в течение 2 дней , чтобы позволить клеткам пролиферировать из тканей.
  8. Инкубируйте клетки в течение еще ​​2 -х дней и характеризуют для жизнеспособности клеток с помощью протокола жизнеспособности клеток для анализа. 15
    Примечание: Живые клетки поддерживать восстановительную среду внутри цитоплазмы. Ресазурин, активный ингредиент, является нетоксичным, клетка проницаема соединение, которое имеет голубой цвет и практически не флуоресцентный. При добавлении в клеточных культурах, ресазурина сводится к резоруфином в цитозоль по митохондриальных ферментов. Резоруфином имеет красный цвет и сильно флуоресцирующие. Жизнеспособные клетки непрерывно преобразовывать ресазурин в резоруфином, растет в ценеasing общую флуоресценцию и цвет культуральной среды, окружающей клетки.
  9. Выполните энтодермы эпителиальных клеток изоляции тотальной РНК, обратной транскрипции и количественной ПЦР в реальном времени экспрессии мРНК гена - маркера , как описано. 16,17
    1. Используйте обратную ПЦР транскриптазы для обнаружения SOAT1 мРНК (смысл: 5'-GAAGGGGCCTATCTGGAACG-3 '; антисмысловой: 5'-ATCTGCACGTGACATGACCA-3'; ПЦР-продукта = 168 пар оснований) в качестве специфического маркера ЕЭС клеток. Используйте бета-актина мРНК (смысл: 5'- TGGTGAAGCTGTAGCCTCTC-3 '; антисмысловой: 5'- GTGATGGACTCTGGTGATGG-3'; ПЦР продукт = 151 п.н.) в качестве гена домашнего хозяйства и внутреннего контроля.
    2. С помощью гель-электрофореза для определения размера продукта РТ-КПЦР. Готовят 1% агарозном геле и смешайте 10 мкл КПЦР продукта с 2 мкл красителем. Нагрузка 10 мкл смеси в каждую лунку в агарозном геле в 1%, и запустить гель путем 100В в течение 30 мин.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Для достижения цели создания последовательной и полезной модели клеток, нам нужно расширить и стабилизировать скорость пролиферации и производительность птиц EECS. Мы сравнили прямой инкубацию эндодермы, без ферментативного расщепления с эндодермы частично переваренной протеолитическими ферментами, такими как коллагеназы или коллагеназы плюс 0,6 ед диспаза. Диспазу представляет собой амино-эндопептидазы, что гидролизует N-концевые пептидные связи неполярных аминокислотных остатков. В то ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Поскольку предыдущая система культура имеет лишь ограниченный успех, необходима лучшая система культуры. Японский перепел YSM эндодермы требует лечения протеолитических ферментов, таких как коллагеназы, чтобы ослабить межклеточных соединений для достижения более высокой производительности роста в эксплантов экс-естественных условиях. Наши данные показывают , что число клеток с частичной обработки переваривания были больше , чем от культуры непереваренной ткани после посева в течение 2 -х дней (рисунок 1).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Отсутствуют конкурирующие финансовые интересы или другие конфликты интересов. Мы не получали никакого финансирования ни от одной частной компании.

Благодарности

Финансирование разработки текущего протокола, в частности, при поддержке "Цель для плана Top университет" Национального университета Тайваня, Тайвань (грант ID-104R350144), а также Министерства науки и технологий Тайваня (грант ID: НАИБОЛЕЕ 104 -2313-B-002-039-MY3). Мы особенно благодарим центр биотехнологии Национального университета Тайваня за предоставление комнаты животных и лабораторных помещений для текущего исследования.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Dulbecco's Modified Eagle MediumGibco by Life technologies12800-017 10 X 1 LДля промывки гранул EEC
D-MEM/F-12Gibco by Life technologies12400-024 10 X 1 LВ качестве базальной среды при культивировании EEC
NBCSGibco by Life technologies16010-159В качестве расходной сыворотки при культивировании EEC
Pen-Strep Ampho. РастворBI (Биологическая промышленность)03-033-1B 100 млДля ослабления возможной инфекции 
Коллагеназа IV типаGibco от Life technologies17104-019 1 г  Коллагеназа представляет собой протеазу, обладающую специфичностью для связи между нейтральной аминокислотой (X) и глицином в последовательности Pro-XGly-Pro. В качестве протеазы для диссоциации клеток из первичной ткани.
24-луночный планшетFALCON® REF-353047Для EEC для присоединения и удлинения
50 мл полипропиленовых центрифужных пробирокCorning® CentriStarTM430829Для транспортировки мембран и переваривания ферментов
50 мл Трубка с коническим дном и колпачкомPRO TECHCT-50-PL-TWДля транспортировки мембран и переваривания ферментов
Реципрокная встряхивающая ваннаDEAGLESB302Для лучшего ферментативного переваривания на мембранах

Ссылки

  1. Abeyrathne, E. D., Lee, H. Y., Ahn, D. U. Egg white proteins and their potential use in food processing or as nutraceutical and pharmaceutical agents--a review. Poult Sci. 92 (12), 3292-3299 (2013).
  2. Bauer, R., Plieschnig, J. A., Finkes, T., Riegler, B., Hermann, M., Schneider, W. J. The developing chicken yolk sac acquires nutrient transport competence by an orchestrated differentiation process of its endodermal epithelial cells. J Biol Chem. 288 (2), 1088-1098 (2013).
  3. Ding, S. T., Nestor, K. E., Lilburn, M. S. The concentration of different lipid classes during late embryonic development in a randombred turkey population and a subline selected for increased body weight at sixteen weeks of age. Poult Sci. 74 (2), 374-382 (1995).
  4. Ding, S. T., Lilburn, M. S. The developmental expression of acyl-coenzyme A: cholesterol acyltransferase in the yolk sac membrane, liver, and intestine of developing embryos and posthatch turkeys. Poult Sci. 79 (10), 1460-1464 (2000).
  5. Ding, S. T., Lilburn, M. S. The ontogeny of fatty acid-binding protein in turkey (Meleagridis gallopavo) intestine and yolk sac membrane during embryonic and early posthatch development. Poult Sci. 81 (7), 1065-1070 (2002).
  6. Kanai, M., Soji, T., Sugawara, E., Watari, N., Oguchi, H., Matsubara, M., Herbert, D. C. Participation of endodermal epithelial cells on the synthesis of plasma LDL and HDL in the chick yolk sac. Microsc Res Tech. 35 (4), 340-348 (1996).
  7. Mobbs, I. G., McMillan, D. B. Structure of the endodermal epithelium of the chick yolk sac during early stages of development. Am J Anat. 155 (3), 287-309 (1979).
  8. Mobbs, I. G., McMillan, D. B. Transport across endodermal cells of the chick yolk sac during early stages of development. Am J Anat. 160 (3), 285-308 (1981).
  9. Nakazawa, F., Alev, C., Jakt, L. M., Sheng, G. Yolk sac endoderm is the major source of serum proteins and lipids and is involved in the regulation of vascular integrity in early chick development. Dev Dyn. 240 (8), 2002-2010 (2011).
  10. Noble, R. C., Cocchi, M. Lipid metabolism and the neonatal chicken. Prog Lipid Res. 29 (2), 107-140 (1990).
  11. Shand, J. H., West, D. W., McCartney, R. J., Noble, R. C., Speake, B. K. The esterification of cholesterol in the yolk sac membrane of the chick embryo. Lipids. 28 (7), 621-625 (1993).
  12. Speier, J. S., Yadgary, L., Uni, Z., Wong, E. A. Gene expression of nutrient transporters and digestive enzymes in the yolk sac membrane and small intestine of the developing embryonic chick. Poult Sci. 91 (8), 1941-1949 (2012).
  13. Walzem, R. L., Hansen, R. J., Williams, D. L., Hamilton, R. L. Estrogen Induction of VLDLy Assembly in Egg-Laying Hens. J Nutr. 129 (2), 467S-472S (1999).
  14. Yoshizaki, N., Soga, M., Ito, Y., Mao, K. M., Sultana, F., Yonezawa, S. Two-step consumption of yolk granules during the development of quail embryos. Dev Growth Differ. 46 (3), 229-238 (2004).
  15. alamarBlue Cell Viability Assay Protocol. , Source: https://www.lifetechnologies.com/us/en/home/references/protocols/cell-and-tissue-analysis/cell-profilteration-assay-protocols/cell-viability-with-alamarblue.html#4 (2008).
  16. Lin, H. Y., Chen, C. C., Chen, Y. J., Lin, Y. Y., Mersmann, H. J., Ding, S. T. Enhanced Amelioration of High-Fat Diet-Induced Fatty Liver by Docosahexaenoic Acid and Lysine Supplementations. Biomed Res Int. 2014 (1), 310981(2014).
  17. Lin, Y. Y., et al. Adiponectin receptor 1 regulates bone formation and osteoblast differentiation by GSK-3β/β-Catenin signaling in mice. Bone. 64, 147-154 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

RT qPCRSOAT1

Похожие статьи