Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Трехмерная альгинат-шарик культуре человеческих клеток аденомы гипофиза

10.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/53637

⸱

18 февраля 2016 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, Biophysics and Neurosciences, Center for Research and Advanced Studies (CINVESTAV-IPN), 2Department of Experimental Pathology, Nacional Institute of Neurology and Neurosurgery

В этой статье

Краткое содержание

Трехмерная культура в альгинатных бусинах, благодаря своей простоте и воспроизводимости, была выбрана для поддержания клеток аденомы гипофиза. Процедуры включали в себя начальное ферментативное расщепление и механическую диссоциацию опухолевой ткани, а последующую клеточную суспензию инкапсулировали в альгинатные шарики.

Аннотация

Способ трехмерного культивирования описан в котором аденома клетки первичной гипофиза выращивают в альгинатные гранулы. Альгинат является полимер, полученный из бурых морских водорослей. Вкратце, опухолевая ткань разрезают на мелкие кусочки и представлен на ферментативным расщеплением коллагеназой и трипсином. Далее, клетки суспензию. Суспензию опухолевых клеток смешивали с 1,2% альгината натрия и по каплям в 2 раствора CaCl, и альгинат / клеточную суспензию гелеобразное при контакте с CaCl 2 с образованием сферических шариков. Клетки, встроенные в альгинатные гранулы поставляются с питательными веществами, предоставляемых культуральных средах, обогащенных 20% FBS. Трехмерная культура в альгинатные гранулы сохраняет жизнеспособность клеток аденомы в течение длительных периодов времени, до четырех месяцев. Кроме того, эти клетки могут быть освобождены от альгината путем промывки бусины с цитрат натрия и высевали на покровные стекла для дальнейших анализов иммуноцитохимических. Использование челМодель L культура позволяет для фиксации и визуализации цитоскелета с минимальным дезорганизации. Таким образом, альгинатные гранулы обеспечивают надежную систему культуры для поддержания клеток аденомы гипофиза.

Введение

Трехмерные каркасы были широко используется в культивирования клеток, поскольку они обеспечивают трехмерное структурную поддержку для культивируемых клеток и поддержание клетки к клетке связи 1. Естественно, полученные полимерные материалы были использованы, чтобы сделать трехмерные каркасы включая тип I коллаген, хитозан и альгинат. Альгинат является естественным полимером, полученным из водорослей Macrocystispyrifera коричневый моря (Kelp). Этот полимер состоит из повторяющихся звеньев β-D-маннуроновой кислоты (М) и & alpha; -L-гулуроновой кислоты (G) 2 и образует стабильные гели в присутствии определенных двухвалентных катионов, таких как кальций и барий. (CaCl 2) растворы хлорида кальция обычно используются в качестве реагента сшивающего чтобы сформировать альгинатные гранулы. Растворов альгинатов упал в CaCl 2 немедленно сформировать трехмерные сферические гели. Когда раствор альгината смешивают с клетками, клетки инкапсулированы в альгината бEADS 3.

Альгинат имеет свойства, которые дают ему возможность быть использованы в качестве матрицы для инкапсуляции различных клетках, в том числе хондроцитами 4, скелетных миобластов 5 и нервных стволовых клеток 6. Это инертный материал и допускает диффузию питательных веществ, кислорода и продуктов метаболизма, которые поддерживают выживание и функции клеток; кроме того, в отличие от других систем культивирования гелевых основе, клетки, культивируемые в течение альгинатные гранулы могут также быть освобождены от эшафота использованием энтеросорбенты кальция, такие как цитрат натрия, и клетки затем могут быть собраны для дальнейших исследований 7.

Аденомы гипофиза, как правило, доброкачественные опухоли с низким уровнем распространения. Крысы линии аденомы гипофиза клеточные были успешно культивируют в двумерной системе 8. Тем не менее, эта культура секреторных опухолей гипофиза клеток человека не является эффективным развитие; дисперсные опухоли гипофиза клетки растут слабов культуре, клетки обладают ограниченной прикрепление и распространение, и клетки обычно образуют плавающие агрегаты в культуральной чашке 9,10.

Несколько попыток было сделано, чтобы получить опухоль гипофиза клеточной суспензии, в том числе ферментативной и механической дисперсионного подхода 11, только с механической дисперсионного подхода 12 и культивирования опухолевых эксплантов 10. С помощью этих подходов, разные авторы получили жизнеспособные прилипшие культур в течение различных периодов времени. Мощности опухоли секреторных клеток выживать в этих двумерных систем зависит от типа опухоли и их скорости пролиферации 9. Тем не менее, в долгосрочной культур, клетки с фибробластов фенотипов преобладают 11,13. Этот документ описывает способ получения первичной культуры от аденомы гипофиза клеток, инкапсулированных в альгинатные гранулы, которые дополнительно высвобождает их из альгината помост, который позволяет подробный анализаспекты их клеточной биологии, например, их цитоскелета договоренностей.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Это исследование было одобрено для использования человеческого материала со стороны местных этических комитетов медицинского учреждения, а также Центр исследований и развитие исследований Национального Политехнического института.

1. Опухоль Образец Приобретение

  1. Получить аденомы гипофиза биопсию тканей от пациента через транс-клиновидной хирургической процедуры 14.
  2. Собирают пробу аденомы гипофиза и поместите его в стерильный стеклянный флакон, содержащий 50 мл свежего 199 культуральной среде (M199), обогащенной 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 0,6 мг / мл бикарбоната натрия, 2,4 мг / мл HEPES и 1% антибиотики (пенициллин / стрептомицин) при рН 7,4. Поддержание образца в стеклянной бутылке на льду.
    Примечание: опухолевая ткань может быть обработана несколькими кадровыми после операции.
  3. Транспорт образец опухоли в лабораторию в стеклянной бутылке на льду.

2. Получение ферментативного тканевого Диссоциация Solutions, тоТрипсин Ингибитор раствора и растворов альгинатов

Примечание: Перед процедурой культивирования клеток подготовить следующие решения. Фильтр все решения с использованием мембранного 0,22 мкм фильтр перед использованием.

  1. Подготовьте коллагеназы 1% раствора растворением 5 мг коллагеназы (типа I) в 5 мл М199-бессывороточной.
  2. Подготовьте трипсином 0,01% раствор путем растворения 0,01 г трипсина в 10 мл PBS-EDTA 0,3%.
  3. Подготовьте 0,1% раствор ингибитора трипсина растворением 2 мг ингибитора трипсина сои в 20 мл М199-бессывороточной.
  4. Подготовьте ДНКазы раствора посредством растворения 20 мкл ДНКазы I 134 ед / мл в 4 мл раствора ингибитора трипсина.
  5. Приготовьте раствор EGTA (1,2 м) путем растворения 22,8 мг EGTA в 40 мл 155 мМ NaCl. Доводят рН до 7,4. Продолжить до конечного объема 50 мл.
  6. Получают раствор HEPES (20 мм) путем растворения 238 мг HEPES в 50 мл 155 мМ NaCl.
  7. Подготовьте 1,2% раствор альгината путем растворения 1.2г альгината натрия в 100 мл раствора HEPES. Автоклав решение альгинат.
  8. Получают раствор кальция (102 мМ) путем растворения 750 мг CaCl 2 в 50 мл раствора HEPES, отрегулировать рН до 7,4

3. Первичный Культура клеток и альгинат инкапсуляции

  1. Внутри шкафу с ламинарным потоком, поместите опухолевую ткань в 35 мм чашки Петри, содержащие примерно 20 мл PBS Са 2+ и Mg 2+ свободного, рН 7,4 (PBS *).
  2. Возьмите ткань с хирургическим пинцетом и поместить его в другую чашку Петри, содержащую свежий PBS *, аккуратно мыть ткани. Повторите этот шаг, пока красные кровяные клетки и мусор не будут удалены.
  3. Использование хирургического пинцет, провести аденомы гипофиза ткани, и с небольшим хирургическим ножницами, нарезать его на мелкие кусочки. С помощью пипетки Пастера с закругленными краями, передавать фрагменты ткани и PBS * в 15 мл пробирку, центрифуге при 68 мкг в течение 10 мин при комнатной температуре.
    Примечание: Чтобы закруглить края в Пастерапипетка, слегка пламени кончик пипетки в горелку.
  4. Извлеките PBS * с использованием пипетки Пастера и добавить 3-5 мл раствора коллагеназы (примерно 5 мл на 65 мм 3 ткани), смешать два-три раза путем инвертирования. Инкубируйте ткани в коллагеназы в течение 30 мин при 37 ° С в постоянном вращении.
  5. Центрифуга трубки при 68 мкг в течение 10 мин при комнатной температуре и удалить коллагеназы с помощью пипетки Пастера.
  6. Добавьте 5 мл ДНКазы и смешать два-три раза путем инвертирования, затем центрифуги трубку при 68 мкг в течение 10 мин при комнатной температуре.
    Примечание: Если ткань не полностью диссоциирует, выполнить вторую ферментативного расщепления трипсином в течение 3 мин при 37 ° С. Прекратить пищеварение добавлением 2 объемов раствора ингибитора трипсина.
  7. Аспирируйте супернатант с пипетки Пастера и выбросить. Повторное приостановить осадок в 1 объеме раствора EGTA и смешать с 2 объемами раствора альгината.
  8. Аккуратно перемешайте клеточную суспензию и альгинатс помощью пипетки с помощью пипетки Пастера. Использование стерильного шприца с иглой 21 G, снимите поршень; использовать пипетку, чтобы загрузить шприц с альгината и клеток раствором.
  9. Аккуратно вставьте поршень в шприц и тщательно дозировать раствор альгината-клеток капельный в стеклянном стакане, содержащем около 30 мл на богатых кальцием раствором.
  10. Поместите иглу шприца примерно 5 см до раствора CaCl 2. Альгинат-Суспензию клеток гели при контакте с CaCl 2 с образованием сферических шариков. Хранить альгинатные гранулы в растворе кальция в течение 5 мин.
    Примечание: Перемешать стеклянную мензурку, в которой удаляются гранулы. Переместить его медленно с рукой круговыми движениями, чтобы предотвратить их от прилипания к друг другу.
  11. Осторожно снимите решение кальция с пипетки Пастера, и мыть бисером дважды с 3-5 мл M199 обогащенных 20% FBS.
  12. Перенесите альгинатные гранулы в обычный культуры T25 тканиКолба с использованием стерильного шпателя, добавить 4-5 мл M199 обогащенный 20% FBS и инкубировали при 37 ° C в увлажненном инкубаторе с 5% CO 2. Изменение культуральной среды каждый третий день.

4. Освободить клетки из альгината

Примечание: Перед освобождения клетки от альгинатные гранулы, покровные мм диаметр пальто 13 с поли-D-лизина.

ВНИМАНИЕ: Серная кислота весьма едкую кислоту, и APTS МОЖЕТ ПРИВЕСТИ раздражение глаз и кожи. ИСПОЛЬЗОВАТЬ латексные перчатки для обработки этих реагентов.

  1. В вытяжном шкафу, с точки пинцета погружают покровные в стакане чашку Петри, содержащую 20% водной серной кислотой в течение 1 ч при комнатной температуре.
  2. Декантируйте серную кислоту, и мыть покровные пять раз дистиллированной водой в течение 5 мин каждый. Использование точка пинцет место чистые покровные в чашке Петри, содержащей 0,1 М NaOH в течение 5 мин при комнатной температуре 15.
  3. Слейте NaOH и мыть один раз DistilСветодиодные воды, аспирация воды и высушить покровные.
  4. Используйте микропипетки, чтобы покрыть покровные с APTS (аминопропил-триэтоксисилана) в течение 4 мин (используйте 500 мкл на 6 покровные) залить чашку Петри с дистиллированной водой. Быстро аспирации воды и продолжают мыть дистиллированной водой, двигаясь покровные с точкой пинцетом, чтобы позволить воде проникать под.
  5. Аспирируйте воду и высушить покровные, используя точку пинцет поместить покровные в чистую чашку Петри и стерилизовать их внутри микроволновой печи в течение 3 раза, 45 секунд каждый. Добавить 1,000 мкл стерильной воды до 100 мкг поли-D-лизином (0,1 мг / мл).
  6. Инкубируйте покровные с приблизительно 50 мкл поли-D-лизином в течение 5 мин при комнатной температуре. Аспирируйте поли-D-лизина полностью.
    Примечание: Это важно, поскольку растворимые поли-D-лизина в культуральной среде могут ингибировать пролиферацию клеток.
  7. Промыть покровные пять раз стерильной водой в течение 5 мин каждый. Аспирируйте улerile водой и дать высохнуть покровные внутри шкафа ламинарного потока.
  8. Для анализа актинового цитоскелета, освободить клеток гипофиза из альгината. Возьмите некоторые из альгинатные гранулы из колбы культуры с использованием пипетки 1 мл и поместите их в 15 мл трубки.
  9. Добавьте 5 мл 55 мМ цитрата натрия (растворить 323,6 мг Na 3 C 6 H 5 O 7, 2 H 2 O в 20 мл HEPES раствор) и центрифуги при 68 мкг в течение 10 минут при комнатной температуре. Аспирируйте супернатант и отбросить.
  10. Повторное приостановить осадок в 1 мл теплого M199 обогащенных 20% ФСБ; осторожно перемешать клеточной суспензии с помощью пипетки Пастера.
    ВНИМАНИЕ: фаллоидином И DAPI токсичны. Используйте перчатки для обработки этих реагентов.
  11. Для подсчета клеток, передавать 125 мкл 0,4% -ным раствором трипанового синего до 1,5 мл трубки. Добавить 75 мкл M199 и 50 мкл полученной клеточной суспензии на последнем этапе (коэффициент разбавления = 5). Тщательно перемешать.
  12. Используйте наконечник микропипетки для PLACе примерно 10 мкл суспензии клеток сине-Трипановый в гемоцитометра камере.
  13. Граф клеток в счетчике гемоцитометра использованием инвертированного микроскопа с фазово-контрастным освещением. Подсчет всех клеток в центре площади 1 мм и четырех 1 мм угловых квадратов. Получение клеточной плотности на миллилитр путем умножения среднее значение в квадрате на коэффициент разбавления -. 10 4 Например, если средние отсчетов на площади 45 клетки х 5 х 104 = 2,25 х 106 клеток / мл.
    Примечание: Граф клеток в десять квадратов гемоцитометра камере. Не рассчитывайте клетки затрагивающие среднюю линию на нижней и правой сторон.
  14. Семенной 35000 клеток на 13 мм стеклянные диаметром покровные покрытые поли-D-лизина.

5. цитоскелета Композиция

  1. После 48 ч в культуре, удалить культуральной среды с помощью пипетки Пастера и быстро добавить 500 мкл на покровное ЗФР, немедленно удалить PBS.
  2. Фикс и проницаемыми тон клетки с 500 мкл на покровное фиксации буфера (0,1 М PIPES, рН 6,75, 4% ПЭГ-6000, 1 мМ EGTA, 1 мМ MgSO 4, 0,5% Тритон Х-100 и 2% формальдегида) в течение 10 мин при 37 ° С
  3. Удалить буфер фиксации и добавить 500 мкл на покровное 3,5% параформальдегидом в PBS в течение 30 минут при комнатной температуре. Удалить решение параформальдегида.
  4. Промыть покровные три раза, добавляя 500 мкл на покровное ЗФР в течение 5 мин каждый. Промыть покровные при комнатной температуре, в постоянном перемешивании.
  5. Инкубируйте клетки с 50 мМ хлорида аммония в течение 10 мин, аспирации раствор хлорида аммония и повторить шаг 5,4.
  6. Инкубируйте клетки с 1% BSA (IgG-фри, протеазы бесплатно) в PBS в течение 30 мин, удаления раствора BSA и повторите шаг 5,4.
  7. Инкубируйте клетки с 50 мкМ родамина-сопряженных фаллоидином в течение 7 минут при комнатной температуре, повторите шаг 5,4.
  8. Инкубируйте клетки с 255 мкМ DAPI, разбавленным PBS в течение 5 мин при комнатной температуре, повторите шаг 5,4. Наконец смонтировать тон покровные с монтажной среды и запечатать их с лаком для ногтей.
  9. Получение изображений из механизмов актина цитоскелета с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии с целью 63x, при 541 нм возбуждения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Этот протокол был успешно применен в культуре и поддержания клеток гипофиза аденомы в альгинатные гранулы для различных периодов времени рисунке 1 показана внедренные клетки в альгинатные гранулы после трех месяцев. эти клетки обладают би-рефракционной округлые формы под перевернутой оптического микроскопа (рис 1). Рисунок 2 показывает локализацию N-кадгерина в аденомой клеток гипофиза крыс, встроенных в альгината. N-кадгерина локализова...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Этот протокол имеет несколько важных шагов. Первый шарик размером однородности, который необходим для поддержания те же условия диффузии питательных веществ и газов в каждом из клеточной культуры. По нашему опыту, использование 21 G иглы, чтобы сделать альгинатные гранулы позволяет для приобретения эффективного культуры одинакового размера гранулы. Вторым важным фактором является расстояние от иглы; это расстояние не должно быть более 5 см из раствора кальция, чтобы избежать деформированные жемчуг и мертвые клетки из-за...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарим г-на О. Риоса за его техническую помощь.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
<сильно>реагент  Питательная среда
199 Инвитроген 31100-027Для культуры, теплой в 37° C водяная баня перед применением 
Фетальная бычья сыворотка PAAA15-751
Бикарбонат натрия (NaHCO3)Merck106329
N-(2-гидроксиэтил) пиперазин-N´-2этансульфоновая кислота (HEPES)Sigma H-4034
Пенициллин/стрептомицинPAAP11-010
PBS (фосфатный буферный раствор Дульбекко)Invitrogen 21600-044
Коллагеназа типа I поУортингтону4176
Трипсин Инвитроген 27250-018
Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА)Research Organics3002E
Ингибитор трипсина сорбобов Инвитроген 17075-029
ДНКWorthington2139
Альгиновая кислота, из Macrocystis pyrifera (Kelp)Sigma A-2158
Хлорид кальция (CaCl2)J.T. Baker1332
Цитрат натрия (Na3C6H5O7)J.T. Baker3646
Пиперазин-N,N′-бис(2-этансульфоновая кислота) (PIPES)Research Organics9624P
Полиэтиленгликоль 6000 (PEG 6000)Calbiochem528877
этилена гликольтетрауксусная кислота (EGTA)Research Organics9574E
Сульфат магния (MgSO4)J.T. Baker2500
Triton-X 100SigmaX100
ФормальдегидJ.T. Baker2106
ПараформальдегидSigmaP6148
Хлорид аммония (NH4Cl)J.T. Baker660
BSA Бычья сыворотка Альбумин без IgG-FreeJackson Immuno Research001-000-161
Фаллоидин– Тетраметилродамин B изотиоцианатSigmaP1951токсичен. Используйте перчатки для работы с этим реагентом 
4',6-Диамидино-2-фенилиндол, дигидрохлорид (DAPI)Invitrogen D1306Токсичный. Используйте перчатки для работы с этим реагентом 
Серная кислота (H2SO4)J.T. Baker9681Высококоррозионная. Используйте перчатки для работы с этим реагентом 
Гидроксид натрия (NAOH)Merck1.06498Может вызывать раздражение глаз и кожи. Используйте перчатки для работы с этим реагентом 
(3-Аминопропил)триэтоксисилан (APTS)SigmaA-3648
Поли-D-лизина гидробромидSigmaP7280
Трипановый синий растворSigmaT8154 
Name    Company  Каталожный номер  >Комментарии
Оборудование  Может вызывать рак. Используйте перчатки для работы с этим реагентом 
Ротатор Boekel ScientificModel 230300
ЦентрифугаDuPont Corporation sorvall TC6
 Лабораторные приборымодели 314-820 
токсичный: Модель шейкер

Ссылки

  1. Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as Extracellular Matrix Mimics for 3D Cell Culture. Biotechnol. Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
  2. Amsden, B., Turner, N. Diffusion characteristics of calcium alginate gels. Biotechnol. Bioeng. 65 (5), 605-610 (1999).
  3. Andersen, T., Strand, B., Formo, K., Alsberg, E., Christensen, B. Alginates as biomaterials in tissue engineering. Carbohydrate chemistry. Rauter, A. P., Lindhorst, T. K. Vol. 37, Royal Society of Chemistry. 227-258 (2012).
  4. Jonitz, A., et al. Differentiation capacity of human chondrocytes embedded in alginate matrix. Connect. Tissue. Res. 52 (6), 503-551 (2011).
  5. Hill, E., Boontheekul, T., Mooney, D. J. Designing scaffolds to enhance transplanted myoblast survival and migration. Tissue. Eng. 12 (5), 1295-1304 (2006).
  6. Purcell, E. K., Singh, A., Kipke, D. R. Alginate composition effects on a neural stem cell-seeded scaffold. Tissue. Eng. Part. C. Methods. 15 (4), 541-550 (2009).
  7. Wee, S., Gombotz, W. R. Protein release from alginate matrices. Adv. Drug. Deliv. Rev. 31 (4), 267-285 (1998).
  8. Tashjian, A. H. Jr Clonal strains of hormone-producing pituitary cells. Methods. Enzymol. 58, 527-535 (1979).
  9. Fasekas, I., et al. Characterization of human pituitary adenomas in cell cultures by light and electron microscopic morphology and immunolabeling. Folia. Histochem. Cytobiol. 43 (2), 81-90 (2005).
  10. Kohler, P. O., Bridson, W. E., Rayford, P. L., Kohler, S. E. Hormone Production by Human Pituitary Adenomas in Culture. Metabolism. 18 (9), 782-788 (1969).
  11. Kletzkky, O. A., Marrs, R. P., Rundall, T. T., Weiss, M. H., Beierle, J. W. Monolayer and suspension culture of human prolactin-secreting pituitary adenoma. Am. J. Obstet. Gynecol. 138 (6), 660-664 (1980).
  12. Melmed, S., Odenheimer, D., Carlson, H. E., Hershman, J. M. Establishment of functional human pituitary tumor cell cultures. In Vitro. 18 (1), 35-42 (1982).
  13. Thompson, K. W., Vincent, M. M., Jensen, F. C., Price, R. T., Schapiro, E. Production of hormones by human anterior pituitary cells in serial culture. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 102 (2), 403-408 (1959).
  14. Cappabianca, P., Cavallo, L. M., Solari, D., Stagno, V., Esposito, F., de Angelis, M. Endoscopic endonasal surgery for pituitary adenomas. World neurosurg. 82 (6 Suppl), S3-S11 (2014).
  15. Aplin, J. Model Matrices for Studing Cell Adhesion. Measuring cell adhesion. Curtis, A. S. G., Lackie, J. M. , John Wiley & Sons. 110-111 (1991).
  16. Guiraud, J. M., et al. Human prolactin-producing pituitary adenomas in three-dimensional culture. In. Vitro. Cell. Dev. Biol. 27 (3), 188-190 (1991).
  17. Ma, H. L., Hung, S. C., Lin, S. Y., Chen, Y. L., Lo, W. H. Chondrogenesis of human mesenchymal stem cells encapsulated in alginate beads. J. Biomed. Mater. Res. A. 64 (2), 273-281 (2003).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Трехмерная альгинат-шарик культуре человеческих клеток аденомы гипофиза
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.