Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

Summary

Three-dimensional culture in alginate beads, due to its simplicity and reproducibility, was chosen to maintain the pituitary adenoma cells. The procedures included an initial enzymatic digestion and mechanical dissociation of the tumor tissue, and the subsequent cell suspension was encapsulated in alginate beads.

Abstract

Способ трехмерного культивирования описан в котором аденома клетки первичной гипофиза выращивают в альгинатные гранулы. Альгинат является полимер, полученный из бурых морских водорослей. Вкратце, опухолевая ткань разрезают на мелкие кусочки и представлен на ферментативным расщеплением коллагеназой и трипсином. Далее, клетки суспензию. Суспензию опухолевых клеток смешивали с 1,2% альгината натрия и по каплям в ₂ раствора CaCl, и альгинат / клеточную суспензию гелеобразное при контакте с _{CaCl 2} с образованием сферических шариков. Клетки, встроенные в альгинатные гранулы поставляются с питательными веществами, предоставляемых культуральных средах, обогащенных 20% FBS. Трехмерная культура в альгинатные гранулы сохраняет жизнеспособность клеток аденомы в течение длительных периодов времени, до четырех месяцев. Кроме того, эти клетки могут быть освобождены от альгината путем промывки бусины с цитрат натрия и высевали на покровные стекла для дальнейших анализов иммуноцитохимических. Использование челМодель L культура позволяет для фиксации и визуализации цитоскелета с минимальным дезорганизации. Таким образом, альгинатные гранулы обеспечивают надежную систему культуры для поддержания клеток аденомы гипофиза.

Introduction

Трехмерные каркасы были широко используется в культивирования клеток, поскольку они обеспечивают трехмерное структурную поддержку для культивируемых клеток и поддержание клетки к клетке связи ^1. Естественно, полученные полимерные материалы были использованы, чтобы сделать трехмерные каркасы включая тип I коллаген, хитозан и альгинат. Альгинат является естественным полимером, полученным из водорослей Macrocystispyrifera коричневый моря (Kelp). Этот полимер состоит из повторяющихся звеньев β-D-маннуроновой кислоты (М) и & alpha; -L-гулуроновой кислоты (G) ² и образует стабильные гели в присутствии определенных двухвалентных катионов, таких как кальций и барий. _{(CaCl 2)} растворы хлорида кальция обычно используются в качестве реагента сшивающего чтобы сформировать альгинатные гранулы. Растворов альгинатов упал в _{CaCl 2} немедленно сформировать трехмерные сферические гели. Когда раствор альгината смешивают с клетками, клетки инкапсулированы в альгината бEADS ^3.

Альгинат имеет свойства, которые дают ему возможность быть использованы в качестве матрицы для инкапсуляции различных клетках, в том числе хондроцитами ^4, скелетных миобластов ^{5 и} нервных стволовых клеток ^6. Это инертный материал и допускает диффузию питательных веществ, кислорода и продуктов метаболизма, которые поддерживают выживание и функции клеток; кроме того, в отличие от других систем культивирования гелевых основе, клетки, культивируемые в течение альгинатные гранулы могут также быть освобождены от эшафота использованием энтеросорбенты кальция, такие как цитрат натрия, и клетки затем могут быть собраны для дальнейших исследований ^7.

Аденомы гипофиза, как правило, доброкачественные опухоли с низким уровнем распространения. Крысы линии аденомы гипофиза клеточные были успешно культивируют в двумерной системе ^8. Тем не менее, эта культура секреторных опухолей гипофиза клеток человека не является эффективным развитие; дисперсные опухоли гипофиза клетки растут слабов культуре, клетки обладают ограниченной прикрепление и распространение, и клетки обычно образуют плавающие агрегаты в культуральной чашке ^9,10.

Несколько попыток было сделано, чтобы получить опухоль гипофиза клеточной суспензии, в том числе ферментативной и механической дисперсионного подхода ^11, только с механической дисперсионного подхода ^{12 и} культивирования опухолевых эксплантов ^10. С помощью этих подходов, разные авторы получили жизнеспособные прилипшие культур в течение различных периодов времени. Мощности опухоли секреторных клеток выживать в этих двумерных систем зависит от типа опухоли и их скорости пролиферации ^9. Тем не менее, в долгосрочной культур, клетки с фибробластов фенотипов преобладают ^11,13. Этот документ описывает способ получения первичной культуры от аденомы гипофиза клеток, инкапсулированных в альгинатные гранулы, которые дополнительно высвобождает их из альгината помост, который позволяет подробный анализаспекты их клеточной биологии, например, их цитоскелета договоренностей.

Protocol

Это исследование было одобрено для использования человеческого материала со стороны местных этических комитетов медицинского учреждения, а также Центр исследований и развитие исследований Национального Политехнического института. 1. Опухоль Образец Приобретение Получить аденомы гипофиза биопсию тканей от пациента через транс-клиновидной хирургической процедуры 14. Собирают пробу аденомы гипофиза и поместите его в стерильный стеклянный флакон, содержащий 50 мл свежего 199 культуральной среде (M199), обогащенной 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 0,6 мг / мл бикарбоната натрия, 2,4 мг / мл HEPES и 1% антибиотики (пенициллин / стрептомицин) при рН 7,4. Поддержание образца в стеклянной бутылке на льду. Примечание: опухолевая ткань может быть обработана несколькими кадровыми после операции. Транспорт образец опухоли в лабораторию в стеклянной бутылке на льду. 2. Получение ферментативного тканевого Диссоциация Solutions, тоТрипсин Ингибитор раствора и растворов альгинатов Примечание: Перед процедурой культивирования клеток подготовить следующие решения. Фильтр все решения с использованием мембранного 0,22 мкм фильтр перед использованием. Подготовьте коллагеназы 1% раствора растворением 5 мг коллагеназы (типа I) в 5 мл М199-бессывороточной. Подготовьте трипсином 0,01% раствор путем растворения 0,01 г трипсина в 10 мл PBS-EDTA 0,3%. Подготовьте 0,1% раствор ингибитора трипсина растворением 2 мг ингибитора трипсина сои в 20 мл М199-бессывороточной. Подготовьте ДНКазы раствора посредством растворения 20 мкл ДНКазы I 134 ед / мл в 4 мл раствора ингибитора трипсина. Приготовьте раствор EGTA (1,2 м) путем растворения 22,8 мг EGTA в 40 мл 155 мМ NaCl. Доводят рН до 7,4. Продолжить до конечного объема 50 мл. Получают раствор HEPES (20 мм) путем растворения 238 мг HEPES в 50 мл 155 мМ NaCl. Подготовьте 1,2% раствор альгината путем растворения 1.2г альгината натрия в 100 мл раствора HEPES. Автоклав решение альгинат. Получают раствор кальция (102 мМ) путем растворения 750 мг CaCl 2 в 50 мл раствора HEPES, отрегулировать рН до 7,4 3. Первичный Культура клеток и альгинат инкапсуляции Внутри шкафу с ламинарным потоком, поместите опухолевую ткань в 35 мм чашки Петри, содержащие примерно 20 мл PBS Са 2+ и Mg 2+ свободного, рН 7,4 (PBS *). Возьмите ткань с хирургическим пинцетом и поместить его в другую чашку Петри, содержащую свежий PBS *, аккуратно мыть ткани. Повторите этот шаг, пока красные кровяные клетки и мусор не будут удалены. Использование хирургического пинцет, провести аденомы гипофиза ткани, и с небольшим хирургическим ножницами, нарезать его на мелкие кусочки. С помощью пипетки Пастера с закругленными краями, передавать фрагменты ткани и PBS * в 15 мл пробирку, центрифуге при 68 мкг в течение 10 мин при комнатной температуре. Примечание: Чтобы закруглить края в Пастерапипетка, слегка пламени кончик пипетки в горелку. Извлеките PBS * с использованием пипетки Пастера и добавить 3-5 мл раствора коллагеназы (примерно 5 мл на 65 мм 3 ткани), смешать два-три раза путем инвертирования. Инкубируйте ткани в коллагеназы в течение 30 мин при 37 ° С в постоянном вращении. Центрифуга трубки при 68 мкг в течение 10 мин при комнатной температуре и удалить коллагеназы с помощью пипетки Пастера. Добавьте 5 мл ДНКазы и смешать два-три раза путем инвертирования, затем центрифуги трубку при 68 мкг в течение 10 мин при комнатной температуре. Примечание: Если ткань не полностью диссоциирует, выполнить вторую ферментативного расщепления трипсином в течение 3 мин при 37 ° С. Прекратить пищеварение добавлением 2 объемов раствора ингибитора трипсина. Аспирируйте супернатант с пипетки Пастера и выбросить. Повторное приостановить осадок в 1 объеме раствора EGTA и смешать с 2 объемами раствора альгината. Аккуратно перемешайте клеточную суспензию и альгинатс помощью пипетки с помощью пипетки Пастера. Использование стерильного шприца с иглой 21 G, снимите поршень; использовать пипетку, чтобы загрузить шприц с альгината и клеток раствором. Аккуратно вставьте поршень в шприц и тщательно дозировать раствор альгината-клеток капельный в стеклянном стакане, содержащем около 30 мл на богатых кальцием раствором. Поместите иглу шприца примерно 5 см до раствора CaCl 2. Альгинат-Суспензию клеток гели при контакте с CaCl 2 с образованием сферических шариков. Хранить альгинатные гранулы в растворе кальция в течение 5 мин. Примечание: Перемешать стеклянную мензурку, в которой удаляются гранулы. Переместить его медленно с рукой круговыми движениями, чтобы предотвратить их от прилипания к друг другу. Осторожно снимите решение кальция с пипетки Пастера, и мыть бисером дважды с 3-5 мл M199 обогащенных 20% FBS. Перенесите альгинатные гранулы в обычный культуры T25 тканиКолба с использованием стерильного шпателя, добавить 4-5 мл M199 обогащенный 20% FBS и инкубировали при 37 ° C в увлажненном инкубаторе с 5% CO 2. Изменение культуральной среды каждый третий день. 4. Освободить клетки из альгината Примечание: Перед освобождения клетки от альгинатные гранулы, покровные мм диаметр пальто 13 с поли-D-лизина. ВНИМАНИЕ: Серная кислота весьма едкую кислоту, и APTS МОЖЕТ ПРИВЕСТИ раздражение глаз и кожи. ИСПОЛЬЗОВАТЬ латексные перчатки для обработки этих реагентов. В вытяжном шкафу, с точки пинцета погружают покровные в стакане чашку Петри, содержащую 20% водной серной кислотой в течение 1 ч при комнатной температуре. Декантируйте серную кислоту, и мыть покровные пять раз дистиллированной водой в течение 5 мин каждый. Использование точка пинцет место чистые покровные в чашке Петри, содержащей 0,1 М NaOH в течение 5 мин при комнатной температуре 15. Слейте NaOH и мыть один раз DistilСветодиодные воды, аспирация воды и высушить покровные. Используйте микропипетки, чтобы покрыть покровные с APTS (аминопропил-триэтоксисилана) в течение 4 мин (используйте 500 мкл на 6 покровные) залить чашку Петри с дистиллированной водой. Быстро аспирации воды и продолжают мыть дистиллированной водой, двигаясь покровные с точкой пинцетом, чтобы позволить воде проникать под. Аспирируйте воду и высушить покровные, используя точку пинцет поместить покровные в чистую чашку Петри и стерилизовать их внутри микроволновой печи в течение 3 раза, 45 секунд каждый. Добавить 1,000 мкл стерильной воды до 100 мкг поли-D-лизином (0,1 мг / мл). Инкубируйте покровные с приблизительно 50 мкл поли-D-лизином в течение 5 мин при комнатной температуре. Аспирируйте поли-D-лизина полностью. Примечание: Это важно, поскольку растворимые поли-D-лизина в культуральной среде могут ингибировать пролиферацию клеток. Промыть покровные пять раз стерильной водой в течение 5 мин каждый. Аспирируйте улerile водой и дать высохнуть покровные внутри шкафа ламинарного потока. Для анализа актинового цитоскелета, освободить клеток гипофиза из альгината. Возьмите некоторые из альгинатные гранулы из колбы культуры с использованием пипетки 1 мл и поместите их в 15 мл трубки. Добавьте 5 мл 55 мМ цитрата натрия (растворить 323,6 мг Na 3 C 6 H 5 O 7, 2 H 2 O в 20 мл HEPES раствор) и центрифуги при 68 мкг в течение 10 минут при комнатной температуре. Аспирируйте супернатант и отбросить. Повторное приостановить осадок в 1 мл теплого M199 обогащенных 20% ФСБ; осторожно перемешать клеточной суспензии с помощью пипетки Пастера. ВНИМАНИЕ: фаллоидином И DAPI токсичны. Используйте перчатки для обработки этих реагентов. Для подсчета клеток, передавать 125 мкл 0,4% -ным раствором трипанового синего до 1,5 мл трубки. Добавить 75 мкл M199 и 50 мкл полученной клеточной суспензии на последнем этапе (коэффициент разбавления = 5). Тщательно перемешать. Используйте наконечник микропипетки для PLACе примерно 10 мкл суспензии клеток сине-Трипановый в гемоцитометра камере. Граф клеток в счетчике гемоцитометра использованием инвертированного микроскопа с фазово-контрастным освещением. Подсчет всех клеток в центре площади 1 мм и четырех 1 мм угловых квадратов. Получение клеточной плотности на миллилитр путем умножения среднее значение в квадрате на коэффициент разбавления -. 10 4 Например, если средние отсчетов на площади 45 клетки х 5 х 104 = 2,25 х 106 клеток / мл. Примечание: Граф клеток в десять квадратов гемоцитометра камере. Не рассчитывайте клетки затрагивающие среднюю линию на нижней и правой сторон. Семенной 35000 клеток на 13 мм стеклянные диаметром покровные покрытые поли-D-лизина. 5. цитоскелета Композиция После 48 ч в культуре, удалить культуральной среды с помощью пипетки Пастера и быстро добавить 500 мкл на покровное ЗФР, немедленно удалить PBS. Фикс и проницаемыми тон клетки с 500 мкл на покровное фиксации буфера (0,1 М PIPES, рН 6,75, 4% ПЭГ-6000, 1 мМ EGTA, 1 мМ MgSO 4, 0,5% Тритон Х-100 и 2% формальдегида) в течение 10 мин при 37 ° С Удалить буфер фиксации и добавить 500 мкл на покровное 3,5% параформальдегидом в PBS в течение 30 минут при комнатной температуре. Удалить решение параформальдегида. Промыть покровные три раза, добавляя 500 мкл на покровное ЗФР в течение 5 мин каждый. Промыть покровные при комнатной температуре, в постоянном перемешивании. Инкубируйте клетки с 50 мМ хлорида аммония в течение 10 мин, аспирации раствор хлорида аммония и повторить шаг 5,4. Инкубируйте клетки с 1% BSA (IgG-фри, протеазы бесплатно) в PBS в течение 30 мин, удаления раствора BSA и повторите шаг 5,4. Инкубируйте клетки с 50 мкМ родамина-сопряженных фаллоидином в течение 7 минут при комнатной температуре, повторите шаг 5,4. Инкубируйте клетки с 255 мкМ DAPI, разбавленным PBS в течение 5 мин при комнатной температуре, повторите шаг 5,4. Наконец смонтировать тон покровные с монтажной среды и запечатать их с лаком для ногтей. Получение изображений из механизмов актина цитоскелета с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии с целью 63x, при 541 нм возбуждения.

Representative Results

Этот протокол был успешно применен в культуре и поддержания клеток гипофиза аденомы в альгинатные гранулы для различных периодов времени рисунке 1 показана внедренные клетки в альгинатные гранулы после трех месяцев. эти клетки обладают би-рефракционной окр…

Discussion

Этот протокол имеет несколько важных шагов. Первый шарик размером однородности, который необходим для поддержания те же условия диффузии питательных веществ и газов в каждом из клеточной культуры. По нашему опыту, использование 21 G иглы, чтобы сделать альгинатные гранулы позволяет для…

Materials

Reagent
199 culture medium	Invitrogen	31100-027	For culture, warm in a 37 °C water bath before use
Fetal bovine serum	PAA	A15-751
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Merck	106329
N-(2-Hydroxyethyl) piperazine-N´-2ethanesulfonic acid (HEPES)	Sigma	H-4034
Penicillin/Streptomycin	PAA	P11-010
PBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline)	Invitrogen	21600-044
Collagenase type I	Worthington	4176
Trypsin	Invitrogen	27250-018
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Research Organics	3002E
Sorbean trypsin inhibitor	Invitrogen	17075-029
DNAse	Worthington	2139
Alginic acid, From Macrocystis Pyrifera (Kelp)	Sigma	A-2158
Calcium chloride (CaCl2)	J.T. Baker	1332
Sodium citrate (Na3C6H5O7)	J.T. Baker	3646
Piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES)	Research Organics	9624P
Polyethylene Glycol 6000 (PEG 6000)	Calbiochem	528877
Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA)	Research Organics	9574E
Magnesium Sulfate (MgSO4)	J.T. Baker	2500
Triton-X 100	Sigma	X100
Formaldehyde	J.T. Baker	2106
Paraformaldehyde	Sigma	P6148
Ammonium chloride (NH4Cl)	J.T. Baker	660
BSA Bovine Serum Albumin IgG-Free	Jackson Immuno Research	001-000-161
Phalloidin–Tetramethylrhodamine B isothiocyanate	Sigma	P1951	Toxic. Use gloves to handle this reagent
4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI)	Invitrogen	D1306	Toxic. Use gloves to handle this reagent
Sulfuric acid (H2SO4)	J.T. Baker	9681	Highly corrosive. Use gloves to handle this reagent
Sodium hydroxide (NAOH)	Merck	1.06498	Can cause eye and skin irritation.Use gloves to handle this reagent
(3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTS)	Sigma	A-3648
Poly-D-lysine hydrobromide	Sigma	P7280
Trypan blue solution	Sigma	T8154
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment			Toxic: May cause cancer. Use gloves to handle this reagent
Rotator	Boekel Scientific	Model 230300
Centrifuge	DuPont Corporation	Model sorvall TC6
shaker	Lab-line Instruments	Model 314-820