Методическая статья

Поток-модель Руководствуясь Изготовление высокой плотности штрих-кода антител Microarray

DOI:

10.3791/53644

⸱

6 января 2016 г.

 , 
1Department of Chemistry, University at Albany, State University of New York, 2Multiplex Biotechnology Laboratory, Cancer Research Center

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает изготовление больших масштабах, мультиплексированных двумерный ДНК или антител массив, с потенциальными приложений в сигнальных исследований клеток и выявления биомаркеров.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Микрочип антител, как хорошо разработанная технология, в настоящее время бросает вызов нескольким другим устоявшимся или появляющимся высокопроизводительным технологиям. В этом отчете мы обновляем технологию микрочипов антител, используя новый подход к производству и внедряя новые функции. Изготовление нашего микрочипа антител высокой плотности осуществляется путем перпендикулярно ориентированного структурирования одноцепочечных ДНК и последующей конверсии, опосредованной конъюгатами ДНК-антитела. В этом протоколе описываются важнейшие этапы формирования потоковой ДНК, производства и очистки конъюгатов ДНК-антител, а также оценки качества изготовленного микрочипа. Однородность и чувствительность сравнимы с обычными микрочипами, в то время как наше производство микрочипов не требует помощи матричного принтера и может быть выполнено в большинстве исследовательских лабораторий. Другим важным преимуществом является то, что размер наших микрочипов в 10 раз меньше, чем у печатных матриц, что обеспечивает уникальную возможность анализа функциональных белков из отдельных клеток при взаимодействии с типовыми микрочипами. Эта технология штрихкодов может широко использоваться в обнаружении биомаркеров, исследованиях клеточной сигнализации, тканевой инженерии и различных клинических приложениях.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Антитела микрочипов были широко использованы в протеомическим исследований в течение многих десятилетий, чтобы исследовать присутствие целевых протеинов, в том числе белковых биомаркеров 1-3. Хотя это поле в настоящее время сталкивается с серьезными проблемами из других технологий высокой пропускной такие как масс-спектрометрии (МС), есть еще много места для утилиты микрочипов антител, в основном потому, что эти устройства позволить себе простую интерпретацию данных и удобный интерфейс с другими анализами. В последние годы, интеграция микрочипов в микрочип лесов предоставил антитело микрочипов новую возможность процветать 4-7. Например, штрих-код микрочипов интегрированы в одноклеточного микрочипа был использован в исследованиях 8,9 сотовой связи. Эта технология имеет свои отличительные преимущества перед другими доступными технологиями микрочипов. К услугам гостей элементы массива в 10-100 мкм, намного меньше, чем типичный 150 мкм размер, используемый в обычных микрочипов ElemenTS. Строительство небольших элементов массива достигается с помощью систематических подходов потока паттерна, и это приводит к компактных микрочипов, которые могут обнаружить одноклеточного секретируемые белки и внутриклеточные белки. Еще одним преимуществом является использование простого прибора, свободной установки. Это особенно важно, потому что большинство лабораторий и небольшие компании не могут иметь доступ к микрочипов основные средства. Такой штрих-микрочипов антител функция расширенного анализа пропускной способности и может быть использован для выполнения чрезвычайно мультиплексированных анализов на отдельные клетки при достижении высокой чувствительностью и специфичностью, сравнимой с обычной сэндвич иммуноферментного анализа (ELISA) 8. Эта технология нашла широкое применение в выявлении белков из глиобластомы 9-11 Т-клетки 12 и циркулирующих опухолевых клеток 13. Кроме того, ДНК-чипы штрих одна были использованы в точного позиционирования нейронов и астроцитов для подражатьING сборку в естественных условиях ткани головного мозга 14.

Этот протокол фокусируется только на экспериментальных шагов и наращивание блоков двумерного (2-D) штрих-кодов микрочипов антитела, который имеет потенциальные приложения в обнаружении биомаркеров в жидкостных образцов и в одиночных камерах. Технология основана на адресуемой одноцепочечной, одномерных (1-D) микрочипов ДНК, сконструированной с использованием ортогональных олигонуклеотиды, которые узорчатые пространственно на стеклянных подложках. 1-D структура сформирована при параллельных проточных каналов используются на этапе потока узора, и такая картина выглядит как дискретные полосы визуально похожими на 1-D универсальный код продукта (UPC) штрих-кодов. Строительство массива антител в 2-D (п х м) - напоминает 2-D Быстрый ответ (QR-код) матрицы - нуждается в более сложные стратегии паттерна, но позволяет для иммобилизации антител при высокой плотности 8,15. Изготовлениетребует двух шагов паттерна ДНК, с первого рисунка перпендикулярно второму. Точки пересечения этих двух моделей представляют собой н х м элементы массива. Эффективно выбора последовательности одноцепочечной ДНК (оцДНК), используемого в проточной паттерна, каждый элемент данного массива присваивается определенный адрес. Это пространственная привязка необходима различения сигналов флуоресценции на микрочипов слайда. Массив оцДНК преобразуется в массив антител путем включения дополнительных ДНК-конъюгаты антител, образуя платформу под названием библиотеку ДНК закодированный антитела (ДЕЛО 16).

Этот протокол ролик описывает основные шаги в создании NxM массивы антител, которые включают подготовку полидиметилсилоксана (PDMS) штрих-кодов формы, поток-паттерна оцДНК в двух направлениях, подготовка антитело-олигонуклеотидных конъюгатов сделки, и преобразования массив 3 х 3 ДНК в 3х 3 массива антитела.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Внимание: многие химические вещества, используемые в настоящем протоколе являются раздражителями и являются опасными в случае контакта с кожей. Обратитесь Паспорта безопасности (MSDS) и носить соответствующие средства индивидуальной защиты, прежде чем выполнять этот протокол. Пиранья раствор, используемый на стадии (1.1.1) является весьма агрессивной и должны быть готовы, добавив перекись медленно кислоты при перемешивании. Ручка это решение с особой осторожностью в вытяжном шкафу. Используйте соответствующую защиту для глаз и кислотоупорные перчатки. Триметилхлорсилан (ТМЦ) является коррозию, легковоспламеняющиеся химических веществ, используемых в необязательной стадии после (1.1.6). Ручка этого химического вещества в вытяжном шкафу.

Примечание: Выполните изготовление штрих-кодов слайд и критические процедуры потока паттерна в чистой комнате, чтобы свести к минимуму загрязнение твердыми частицами. Частицы пыли могут блокировать порты и микроканалов PDMS формы и мешать потока-паттерна.

1. Строительство One-dimensionaл ДНК Штрих Презентация

  1. Подготовка СУ-8 хозяина для моделей потока штрих-кодов
    Примечание: Рисунки для перпендикулярных картины течения (1А-B) создаются с помощью программного обеспечения автоматизированного проектирования (САПР). Эти модели оказываются на хромированной фотошаблона. Прозрачные области маски соответствуют особенностям СУ-8 хозяина.
    1. Очистить кремниевой пластины (диаметр 100 мм) тщательно в смеси 3 H 2 SO 4: 1 30% Н 2 О 2 (пираньи раствор), нагретого до 96 ° С. Промыть пластины деионизированной воды и изопропилового спирта с последующим высушиванием с продувать азотом пистолета.
    2. Налейте около 4 мл SU-8 2025 фоторезиста на пластине. Использование программируемого отжима нанесения покрытий, чтобы равномерно распределить фоторезиста на пластине в течение 10 сек при 500 оборотах в минуту, то 30 сек при 3000 оборотов в минуту. Это создает слой фоторезиста толщиной ~ 25 мкм. Постепенно позволяют спиннинг, чтобы замедлить до остановки - это в МАИntain равномерного покрытия на поверхности пластины в.
    3. Печь с покрытием пластины на плите в течение 1 мин при 65 ° С, затем в течение 5 мин при 95 ° С. Этот шаг позволяет покрытию затвердеть. Охлаждают до комнатной температуры в течение 5 мин.
    4. Поместите хром маску (рис 1С) на фоторезиста пальто. Выявить особенности маски в ближнем УФ-света (350-400 нм, энергетической экспозиции 150-160 мДж / см 2) в течение 20 сек.
      Примечание: Конструкция на хромированной маской содержит 20 каналов, каждый из которых шириной 50 мкм с шагом 20 мкм. Каналы обмотки от одного конца образца к противоположному концу. В целом, 20 каналов покрывают прямоугольную область с длиной ~ 40 мм и шириной ~ 20 мм. Каждый канал между двух круговых функций, которые соответствуют входным отверстием и выходным отверстием. Входы и выходы являются взаимозаменяемыми.
    5. Выпекать подвергается пластины на плите в течение 5 мин при 95 ° С. Охлаждают до комнатной температуры в постепенно.
    6. Погрузитесь пластины в СУ-8 разработчика при перемешиваниив течение 5 мин. Промыть пластины с небольшим количеством свежего СУ-8 разработчика, а затем изопропиловым спиртом. Высушите пластины, используя удар азота пистолет. Жесткий-печь пластины на 200 ° C плитке в течение 30 мин, и позволяют пластины постепенно остыть до комнатной температуры.
      Примечание: Разработка может осуществляться в течение более длительного времени, если белый налет наблюдается после промывки на этом этапе.
      Дополнительно: Silanize Су-8 мастер подвергая его триметилхлорсилана пар в закрытой посуде Петри в течение 10 мин.
  2. Подготовка штрих-кода форму PDMS
    1. Смешайте 40,0 г силиконового эластомера с базой 4,0 г отвердителя. Перемешать смесь форполимерный энергично в течение 10 мин. Дега в течение 20 мин в вакууме.
      Примечание: Как правило, использовать 10: 1 (база: отвердитель) отношения масс.
    2. Налейте форполимера в чашку Петри, содержащую кремниевой пластины с СУ-8 хозяина рисунка штрих-кода. Высота смеси PDMS должно быть около 7,5 мм или выше. Дегазации смеси в Petrя блюдо для второй раз, чтобы удалить оставшиеся пузырьки любые, то испеките смеси в течение 1 ч при 75 ° С, чтобы вылечить PDMS.
      Примечание: Важно, чтобы поддерживать достаточную толщину плиты PDMS при ~ 7,5 мм или выше, чтобы избежать добавления слишком много напряжение в PDMS-стекла связи при введении выводов / трубки через отверстия в пресс-форме PDMS на стадии (1.3.3.1)
    3. Использование скальпеля, осторожно обвести области плиты PDMS, который содержит элементы пресс-форм штрих-кодов и очистить плиту от пластины.
    4. Обрезать края плиты, чтобы достичь желаемого форму штрих форму PDMS. Удар 20 отверстий (диаметр 1,0 мм), через форму с помощью биопсии удар с плунжером. Убедитесь, что отверстия были выровнены с круговой особенностей рисунка штрих-кода. Эти отверстия служат входов и выходов.
  3. Одномерный структурирование поли-L-лизин (PLL)
    1. Для удаления пыли на поверхности поли-L-лизин покрытием стекло с использованием продувать азотом пистолет. АТТАСч PDMS плесень чистой стекло. Убедитесь, что края кристаллизатора и ползуна выровнены.
    2. Выпекать в течение 1,5 ч при 75 ° С, чтобы усилить связь между формой и PDMS ползуна ФАПЧ покрытием. Между тем, подготовить 20 штук гибкой трубки из полиэтилена (3- 4-дюймовые части, с внутренним диаметром 0,5 мм и внешним диаметром 1,5 мм).
      Примечание: количество штук трубки соответствует количеству впускных отверстий в штрих-код пресс-формы PDMS. Трубка служит для соединения каналов на PDMS штрих плесени в резервуар азота, снабженной регулятором давления.
    3. К одному концу каждой части трубки, прикрепить нержавеющей стали полый штифт (диаметр 1 мм). Аспирируйте стерильно фильтруют поли-L-лизин решение через вывод, по крайней мере до 1 см трубки не заполнен раствором.
      1. Закрепите штифты (подключенные к решению заполненные трубки) на входы в PDMS штрих форму (рис 1E). Прикрепите другой конец трубы, чтобыбак азота давления регулируется настройки. Разрешить решение течь через форму, используя диапазон давления 0,5-1 атм из, по крайней мере 6 часов.
        Примечание: Обратитесь к шагу (1.3.3) для всех процедур потока паттерна.
  4. Одномерная паттерна одноцепочечной ДНК 14
    Примечание: фосфатно-солевой буфер (PBS), используемый в последующих стадий получали из 137 мМ NaCl, 10 мМ Na 2 HPO 4, и 2 мМ KH 2 PO 4 рН 7,4 буфер.
    1. Подготовьте 2 мМ бис (сульфосукцинимидил) суберат (БС3) решение в PBS. Подготовьте 300 мкМ решения A, B, C и одноцепочечной ДНК (5'-амин изменены, 80 нуклеотидов) в PBS или сверхчистой воды.
      Примечание: Используйте БС3 решение в течение примерно 30 минут после приготовления, так как -hydroxysuccinimide эфир N легко подвергается гидролизу.
    2. Смешайте 2,5 мкл 300 мкМ A, B, C или оцДНК с 2,5 мкл 2 мМ бис (sulfosuccinimидиллия) суберат в PBS для каждого канала. А, Б, В и С ДНК обозначены на каналы 1, 2 и 3, соответственно. Этот порядок также применяется к оставшимся наборов каналов 3 (фиг.2А).
    3. Выполните шаг (1.3.3). На этот раз, аспирации 5-мкл решения БС3 / ДНК через контакты из нержавеющей стали и труб в полиэтиленовой, то соедини PDMS плесень источника азота. Разрешить решение BS3 / ДНК проходить через штрих-кода пресс-формы в течение приблизительно 40 мин или до по крайней каналы заполнены.
    4. Остановка потока сразу все каналы заполнены, то инкубировать решение BS3 / ДНК в штрих-коде при КТ в течение 2 ч. Не позволяйте решение высохнуть. Печь пресс-формы PDMS с прикрепленной штрих слайд в течение 1 ч при 75 ° С.
      Примечание: Чтобы облегчить регулировку на последующих стадиях потока паттерна, края узора канала на штрих-слайд можно выделить. Это делается путем тщательного царапин на поверхности стекла, используя алмазную Scribе генерировать выравнивания маркеров на нижней части стекло. Выравнивание на более поздних стадиях протокола могут быть проверены под микроскопом.
    5. Удалить плесень PDMS от штрих-кода слайда. Промыть слайд осторожно 0,01% SDS один и три раза сверхчистой воды.
      1. Высушите штрих слайд, используя предметное стекло счетчик. Хранить штрих слайд в чистом центрифужную пробирку на 50 мл для последующего использования.

2. Подтверждение одномерной узор на штрих Slide

Примечание: Этот протокол проверки также могут быть адаптированы для использования в оценке качества последующих шагов поток паттерна.

  1. Блокирование слайд
    1. Готовят 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA) в PBS. Фильтр на этот раствор через фильтр в шприце 0,45 мкм перед его использованием. Использование геля-наливного наконечника, применяются 50 мкл 1% раствора BSA, чтобы один край штрих слайда.
    2. Выдержите 1% BSA Solutион в течение 1 часа при комнатной температуре.
  2. Инкубация с цианиновых 3 (Cy3) -conjugated комплементарной ДНК
    1. Подготовка коктейль A ', B', и олигонуклеотиды C ', конъюгированный с Cy3 на одном конце. Последовательности А ', В' и С 'дополняют те A, B, и С, соответственно. Рабочий концентрация Cy-3 ДНК 0,05 мкм в 0,1% BSA.
    2. Удалить решение BSA от слайда с помощью пипетки, а затем применить 30 мкл ДНК раствора коктейль на той же краю слайда. Инкубируйте коктейль Cy-3 ДНК на слайде при комнатной температуре в течение 1 часа. Выполните эту инкубационный шаг в темноте, чтобы защитить группу от Cy3 фотообесцвечивания.
  3. Анализ интенсивности флуоресценции
    1. Пипетировать из коктейль Cy-3 ДНК и мыть стекло в 1% BSA, PBS, и, наконец, в разбавленном PBS (1 рИскусство PBS с 50 частями воды высшей степени очистки). Высушите слайд, используя счетчик.
    2. Соблюдайте флуоресценции (рис 2B), используя флуоресцентный микроскоп или микрочипов сканер. При использовании микрочипов сканер, установите длину волны излучения лазера на длине волны 532 нм, размер пиксела в 5 микрон, ФЭУ (ФЭУ) усиления на 450 и силы на 15%.

3. Изготовление массива 2-мерный (3x3) ДНК 14

  1. Подготовка штрих-кода форму PDMS
    1. Выполните процедуру (1.1) построить еще один СУ-8 хозяина, но на этот раз использовать хромированную маску с рисунком потока перпендикулярно, что первой конструкции. Выполните процедуру (1.2) построить новый PDMS плесень с перпендикулярной рисунком.
  2. Двумерная поток паттерна одноцепочечной ДНК
    1. Для массива 3 х 3, подготовить 150 мкМ исходные растворы Х-я, b'-II, III-c', Х-IV, V-В', Сх-VI, Х-VII, B"-viii и С'-IX ДНК в 3% БСА / ЗФР. Эти олигонуклеотиды служить «наведения последовательностей» (рис 2А). Объедините олигонуклеотидных решения (решения от 1 до 3) такие, что рабочая концентрация 50 мкМ для каждого олигонуклеотида. Используйте инструкцию, представленную в таблице 1.
    2. Поток 3% BSA / PBS блокирующего раствора во все 20 каналов в течение 1 ч при 0,5-1 МПа.
    3. Решения потока 1, 2, и 3 в каналы 1, 2, и 3, соответственно. Следуйте этот порядок для последующих наборов 3 каналов. Поток обычно заканчивают в 40 мин вокруг. Инкубируйте растворы ДНК при комнатной температуре в течение 2 часов, чтобы позволить ДНК для гибридизации.
    4. Поток 3% BSA / PBS блокирующего раствора во все 20 каналов в течение 1 ч при 0,5-1 МПа для удаления негибридизированным ДНК. Снимают плиты PDMS, и мыть полученную ДНК микрочипов слайд погружением предметного стекла в 3% БСА / ЗФР один раз и два раза PBS, а затем разбавленной PBS (1 часть PBS и 50 частей воды) сверхчистой. DРай на слайд, используя предметное стекло счетчик.
    5. Выполните второй шаг проверки (рис 2С), аналогичный в разделе 2. Использование олигонуклеотидов я ", чтобы IX ', которые являются Су3-сопряженными. Храните массива слайда в центрифужную пробирку на 50 мл для последующего использования 3 х 3.
      Примечание: микрочипов ДНК можно хранить при комнатной температуре в эксикаторе в течение нескольких месяцев.

4. Преобразование в массив ДНК 3 х 3 в массив антитела

  1. Подготовка антитело-олигонуклеотидных (АКЦИЯ) конъюгатов
    1. Готовят растворы 200 мМ сукцинимидил-4-формилбензойной кислоты (S-4FB) и 40 мМ сукцинимидил-6-hydrazinonicotinamide (S-ГНА) в безводном N, N-диметилформамиде (ДМФ).
    2. Подготовка до 7 отдельных растворов захвата антител (1 мг / мл) в PBS.
      Примечание: Если антитела растворы содержат азид натрия бактериостат, выполните буфера обмена с помощью PBS спин обессоливающей Columns с 7 кДа молекулярной массы отсечки (MWCO).
    3. Подготовьте отдельные 400 мкм решений я ', II', III ', IV', V, VI ', и ДНК VII. Связать каждый захват антитела к одной последовательности олигонуклеотидов. Комбинат 40 мкл 400 мкм ДНК с 12.25 мкл ДМФ в микропробирок и спин вниз тщательно перемешать.
      1. Для каждого решения ДНК / DMF, добавить 2,3 мкл 200 мМ S-4FB в DMF. Для каждого 100 мкг захвата антитела, добавить 2,25 мкл 40 мМ S-ГНА в DMF.
    4. Инкубируйте антитело / решения S-ГНА и ДНК / S-4FB в течение 4 ч при комнатной температуре.
    5. В рамках подготовки к реакции антитело-ДНК связи, подготовить новые спина обессоливания колонн (по одному для каждого раствора ДНК и один для каждого антитела), вымойте их с цитрат буфер при рН 6.
    6. Через 4 часа инкубации выполнения замены буфера для каждого антитела / S-ГНА и раствор ДНК / S-4FB. Объедините S-4FB-сопряженных я ', II', III ', IV', v ', VI' и олигонуклеотиды VII 'с конъюгатов антитело-S-ГНА. Инкубируйте смеси в течение 2 ч при комнатной температуре.
    7. Инкубируйте реакции O / N при 4 ° C.
  2. Очистка антитела олигонуклеотидных (АКЦИЯ) конъюгатов
    Примечание: для очистки антител конъюгатов олигонуклеотид, выполнить быстрой жидкостной хроматографии протеинов (FPLC) на стандартной системе FPLC, снабженной GL колонке Superose 6 10/300.
    1. Установка длины волны УФ-детектора системы FPLC до 280 нм. Использование изократического поток PBS (рН 7,4) при 0,3 мл / мин, чтобы отделить конъюгатов антитело-олигонуклеотид от избыточного S-4FB-ДНК.
    2. Объединяют фракции, содержащие конъюгат и концентрат фракции до объема 150 мкл с использованием спиновых фильтров с 10 кДа MWCO.
  3. Двумерная рисунка антител
    1. Подготовьте другой PDMS плесень с микрокамеры или микро-скважин насING процедуры изготовления на этапе (1.2). PDMS плесень может содержать микролитр в нанолитровых скважин для иммунологических.
      Примечание: Для общего обнаружения биомаркеров в жидкостных образцов, плесень PDMS с несколькими скважинами в паре с массива слайда. Особенности формы PDMS зависит от изучаемой системы. Например, обнаружение белков из экспериментов одной клетки может быть выполнена с плесенью PDMS, содержащего микрокамеры с 0,15-NL объемов.
    2. (Необязательно) Тема на PDMS плесень на плазме уборка (18 Вт) в течение 1,5 мин, чтобы сделать его узорчатую поверхность гидрофильной. До плазменной очистки, используют клейкую ленту, чтобы блокировать все другие поверхности, которые будут непосредственно связан с массива слайда 3 х 3.
      Примечание: Шаг (4.3.2) не является обязательным, но обычно выполняется, когда форма ПДМС предназначен для использования в экспериментах одну ячейку.
    3. Mate форму PDMS с массивом слайд 3 х 3, то блок слайд с 1% BSA в PBS. Инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре. Meanwhiле, подготовить коктейль (200 мкл конечный объем) антитела-олигонуклеотид конъюгатов. Рабочая концентрация каждого конъюгата составляет 10 мкг / мл в 1% BSA / PBS.
    4. Добавьте антитело-олигонуклеотид коктейль, то инкубировать в течение 1 часа при 37 ° С, чтобы позволить олигонуклеотид фрагмент конъюгатов для гибридизации с конкретным пятен на 3 х 3 массивов, тем самым преобразуя массив ДНК в массив антител.
    5. Повторите шаг (3.2.4), чтобы очистить и высушить слайд. Максимальное значение может быть достигнуто, если массив антитела использовали немедленно. Длительное хранение может привести к потере чувствительности.
  4. Обнаружение белков
    1. Восстановить рекомбинантные белки или приготовить фильтрованную образец клеток.
    2. Mate микрочипов с специально разработанный чип, и блокируют поверхность с 3% БСА в PBS в течение 1 часа. Затем удалить раствор BSA, и применять образцы и инкубируют в течение 2 ч.
    3. Смыть образцы, используя 3% BSA в PBS в три раза, А.Н.D затем добавить антитела обнаружения в концентрации, представленной спецификации продукта. Инкубируют в течение 2 часов.
    4. Смыть антитела обнаружения от 3% BSA в PBS в три раза, а затем добавить цианиновых 5 (Cy5) -streptavidin на 1 мкг / мл, а затем инкубировали в течение 1 часа.
    5. Повторите шаг (3.2.4), чтобы очистить и высушить слайд для сканирования.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Проекты для PDMS формы (1А-1B) были сделаны с помощью программы CAD (AutoCAD). Две конструкции, показанные художественные каналы для потока паттерна, один горизонтальный и один вертикальный. Левые и правые части каждой конструкции являются симметричными; либо из них может быть входа или выхода. Каждый из 20 каналов обмотки от одного конца до упора до другого конца. Каждый дизайн печатается на хромированной фотошаблона (рис 1в). Сфабрикованный СУ-8 мастер...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Шаблон потока является первым важным шагом в изготовлении 2-D микрочипов. Для генерации два перекрывающихся образцы ДНК на стеклянную подложку, особенности канале первой конструкции должны быть перпендикулярны к тем второго (фиг.1А-В). Проекты также рассмотреть вниз по течению приложений на микрочипе. В случае анализа клеточной одного года микрочипов используется для обнаружения белков из одиночных клеток, заключенных в микрокамеры, поэтому размеры канала выполнены совместимы с микрокамеры, кот...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют конкурирующих интересов для раскрытия информации.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы хотели бы выразить признательность за стартовый фонд от SUNY Albany и доступ к объектам в Центре исследования рака Университета Олбани.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Силгард 184 силиконовый эластомер основаDow Corning3097366-1004
Силгард 184 силиконовый эластомер отверждающий агентDow Corning3097358-1004
SU-8 2025 фоторезистMicroChemY111069
кремниевые пластины University Wafers452
Стеклянные горки с покрытием из поли-L-лизинаThermo ScientificC40-5257-M20
ОлигонуклеотидыIntegrated DNA Technologies* Заказано по индивидуальному заказу у Integrated DNA Technologies, см. Таблица 2.
Поли-L-лизиновый адгезивный растворNewcomer Supply1339
Bis (сульфосукцинимидил) suberate  (БС3)Thermo Scientific21585
1x Фосфатный буферный раствор, pH 7,4Качество Биологический114-058-101
Ä kta Explorer 100 Система быстрой белковой жидкостной хроматографии (FPLC)GE (Amersham Pharmacia) 18-1112-41
Superose 6 10/300 GL колонкаGE Здравоохранение Медико-биологические науки17-5172-01
Захват антителразличныеразличные* Выбор антител зависит от применения
Сукцинимидил-6-гидразино-никотинамид (S-HyNic)SolulinkS-1002
Сукцинимидил-4-формилбензамид (S-4FB)SolulinkS-1004
N,N-диметилформамидSigma-Aldrich227056
Лимонная кислота, безводныйAcros42356
Гидроксид натрияFisher ScientificS318
Amicon Ultra спиновой фильтр 10 кДа MWCOEMD MilliporeUFC201024
Spin coaterLaurell TechnologiesWS-650-MZ
Пуансон для биопсии с поршнем (диаметр 1,0 мм)Ted Pella, Inc.15110-10
Алмазный писец (Стиль 60)SPI поставляет6004
ТриметилхлорсиланSigma Aldrich92361

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alhamdani, M. S. S., Schroder, C., Hoheisel, J. D. Oncoproteomic profiling with antibody microarrays. Genome Med. 1 (7), (2009).
  2. Angenendt, P. Progress in protein and antibody microarray technology. Drug Discov Today. 10 (7), 503-511 (2005).
  3. Sun, H. Y., Chen, G. Y. J., Yao, S. Q. Recent advances in microarray technologies for proteomics. Chem Biol. 20 (5), 685-699 (2013).
  4. Fan, R., et al. Integrated barcode chips for rapid, multiplexed analysis of proteins in microliter quantities of blood. Nat Biotechnol. 26 (12), 1373-1378 (2008).
  5. Chattopadhyay, P. K., Gierahn, T. M., Roederer, M., Love, J. C. Single-cell technologies for monitoring immune systems. Nat Immunol. 15 (2), 128-135 (2014).
  6. Varadarajan, N., et al. Rapid, efficient functional characterization and recovery of HIV-specific human CD8(+) T cells using microengraving. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (10), 3885-3890 (2012).
  7. Ma, S., et al. Electroporation-based delivery of cell-penetrating peptide conjugates of peptide nucleic acids for antisense inhibition of intracellular bacteria. Integr Biol-Uk. 6 (10), 973-978 (2014).
  8. Wang, J., et al. Quantitating cell-cell interaction functions with applications to glioblastoma multiforme cancer cells. Nano Lett. 12 (12), 6101-6106 (2012).
  9. Kravchenko-Balasha, N., Wang, J., Remacle, F., Levine, R. D., Heath, J. R. Glioblastoma cellular architectures are predicted through the characterization of two-cell interactions. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (17), 6521-6526 (2014).
  10. Xue, M., et al. Chemical methods for the simultaneous quantitation of metabolites and proteins from single cells. J Am Chem Soc. 137 (12), 4066-4069 (2015).
  11. Shi, Q. H., et al. Single-cell proteomic chip for profiling intracellular signaling pathways in single tumor cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (2), 419-424 (2012).
  12. Ma, C., et al. A clinical microchip for evaluation of single immune cells reveals high functional heterogeneity in phenotypically similar T cells. Nat Med. 17 (6), 738-743 (2011).
  13. Deng, Y., et al. An integrated microfluidic chip system for single-cell secretion profiling of rare circulating tumor cells. Sci Rep. 4, 7499(2014).
  14. Vermesh, U., et al. High-density, multiplexed patterning of cells at single-cell resolution for tissue engineering and other applications. Angew Chem Int Ed. 50 (32), 7378-7380 (2011).
  15. Yu, J., et al. Microfluidics-based single-cell functional proteomics for fundamental and applied biomedical applications. Annu Rev Anal Chem. 7, 275-295 (2014).
  16. Bailey, R. C., Kwong, G. A., Radu, C. G., Witte, O. N., Heath, J. R. DNA-encoded antibody libraries: A unified platform for multiplexed cell sorting and detection of genes and proteins. J Am Chem Soc. 129, 1959-1967 (2007).
  17. Alegria-Schaffer, A. General protein-protein cross-linking. Methods Enzymol. 539, 81-87 (2014).
  18. Ahmad, H., et al. A robotics platform for automated batch fabrication of high density, microfluidics-based DNA microarrays, with applications to single cell, multiplex assays of secreted proteins. Rev Sci Instrum. 82, 094301(2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Flow PatterningAntibody MicroarrayDNA Antibody ConjugatesPDMS Mold FabricationSingle Cell AnalysisSU 8 MasterPerpendicular Flow PatternMicroarray ValidationBiomarker DetectionCell Signaling Studies

Похожие статьи