Моделирование резистентностью к химиотерапии лейкоз In Vitro

Краткое содержание

В настоящем отчете обобщен протокол, который может быть использован для моделирования влияния ниши микроокружения костного мозга на лейкозные клетки с акцентом на обогащение наиболее химиорезистентной субпопуляции.

Аннотация

Хорошо известно, что микроокружение костного мозга является уникальным местом убежища для заболеваний кроветворения, которые как начинаются, так и прогрессируют в этом месте. Модель, представленная в настоящем отчете, использует первичные стромальные клетки костного мозга человека и остеобласты в качестве двух репрезентативных типов клеток из ниши костного мозга, которые влияют на фенотип опухолевых клеток. Условия совместного культивирования in vitro, описанные для лейкозных клеток человека с этими первичными нишевыми компонентами, поддерживают создание химиорезистентной субпопуляции опухолевых клеток, которые могут быть эффективно извлечены из культуры для анализа с помощью различных методов. Строгий график кормления для предотвращения потоков питательных веществ с последующим восстановлением популяции опухолевых клеток (G10) с помощью гелевых частиц сшитого декстрана (G10) популяции опухолевых клеток, которые мигрировали под адгезивные стромальные клетки костного мозга (BMSC) или остеобласты (OB), генерируя популяцию опухолевых клеток «фазового дима» (PD), обеспечивает постоянный источник очищенных резистентных к терапии лейкозных клеток. Эта клинически значимая популяция опухолевых клеток может быть оценена с помощью стандартных методов для исследования апоптотических, метаболических и регуляторных путей клеточного цикла, а также для обеспечения более строгой мишени для тестирования новых терапевтических стратегий до доклинических исследований, направленных на минимальное остаточное заболевание.

Введение

Общая цель описанного метода - обеспечить эффективный, экономически эффективный подход in vitro, который поддерживает исследование механизмов, лежащих в основе выживаемости лейкозных клеток с поддержкой костного мозга во время воздействия химиотерапии. Хорошо известно, что выжившие остаточные опухолевые клетки, сохраняющиеся после лечения, способствуют рецидиву заболевания, который часто протекает более агрессивно, чем при постановке диагноза, и часто лечится менее эффективно^1-8. Модели, включающие лейкозные клетки изолированно, например, ограниченные культивированием клеток только в средах, для тестирования терапевтических подходов не учитывают эти критические сигналы или гетерогенность заболевания, возникающую в ответ на наличие узкопрофильных сигналов, в которых субпопуляции опухолевых клеток с очень специфическими взаимодействиями с нишевыми клетками получают усиленную защиту. Стандартные 2D-модели ко-культуры, которые совместно культивируют стромальные клетки, полученные из костного мозга, и лейкозные клетки, в некоторой степени учитывают вклад ниши костного мозга и показали, что взаимодействие с клетками микроокружения костного мозга повышает их устойчивость к химиотерапии и изменяет их характеристики роста^9-14. Эти модели, однако, часто не позволяют обобщить долгосрочную выживаемость опухолевых клеток и не дают точной информации о результатах, связанных с наиболее устойчивыми популяциями лейкозных клеток, которые вносят свой вклад в MRD. Модели in vivo остаются критически важными и определяют «золотой стандарт» для исследования инновационных методов лечения до клинических испытаний, но они часто сталкиваются с проблемой времени и стоимости, необходимых для проверки гипотез, связанных с резистентными опухолями и рецидивами заболевания. Таким образом, разработка более информативных 2D-моделей будет полезна для пилотных исследований, чтобы лучше информировать о дизайне последующего доклинического дизайна на мышах.

Двумерная модель in vitro, представленная в этом отчете, лишена сложности истинного микроокружения in vivo, но предоставляет экономически эффективные и воспроизводимые средства для исследования взаимодействия опухоли с микроокружением, которое специально подходит для обогащения химиорезистентной субпопуляции опухолевых клеток. Это различие ценно, поскольку оценка всей популяции опухолевых клеток может маскировать фенотип меньшей группы резистентных к терапии опухолевых клеток, которые составляют наиболее важную мишень. Дополнительным преимуществом является масштабируемость модели в соответствии с интересующим анализом. Объемные культуры могут быть созданы для тех анализов, которые требуют значительного восстановления опухолевых клеток, в то время как небольшие кокультуры в многолуночных планшетах могут быть использованы для анализа на основе ПЦР или оценки на основе микроскопии.

Исходя из этой потребности, мы разработали модель in vitro для рассмотрения гетерогенности заболевания, характерной для острого лимфобластного лейкоза (ОЛЛ) B-линии. Мы показываем, что ВСЕ клетки, которые имеют много общих характеристик со своими здоровыми аналогами, локализуются в различных компартментах совместной культуры BMSC или OB. Генерируются три популяции опухолевых клеток, которые имеют различные фенотипы, представляющие ценность для исследования терапевтического ответа. В частности, мы демонстрируем, что клетки (ОЛЛ), выделенные из популяции «фазового затухания» (PD) ко-культуры, неизменно рефрактерны к терапии с выживаемостью, которая приближается к опухолевым клеткам, не подвергавшимся воздействию цитотоксических агентов. Эти ОЛЛ-клетки, взятые либо из установленных клеточных линий, либо из первичных образцов пациентов, мигрируют под адгезивные стромальные клетки или слои остеобластов, но могут быть захвачены после трипсинизации культур и разделения типов клеток с использованием столбцов с гелевым сшитым декстраном (G10) типа^{10 15}.

Здесь мы представляем установку двумерной кокультуры, которая может быть использована для моделирования взаимодействий между стромальными клетками микроокружения костного мозга (BMSC/OB) и лейкозными клетками. Особое значение имеет наблюдение о том, что лейкозные клетки образуют три пространственные субпопуляции относительно монослоя стромальных клеток и что популяция БП представляет собой резистентную к химиотерапии популяцию опухолей из-за ее взаимодействия с BMSC или OB. Кроме того, мы демонстрируем, как эффективно изолировать популяции лейкозных клеток с помощью столбцов G10. Следует отметить, что мы обнаружили, что выделение этих субпопуляций позволяет проводить последующий анализ наиболее резистентной популяции БП для определения потенциальных режимов резистентности, которые придаются этим клеткам из-за их взаимодействия со стромальными клетками микроокружения костного мозга или остеобластами. Методы, которые мы использовали после этой модели совместного культивирования и выделения, включают проточную цитометрическую оценку, протеомный анализ и целевую оценку экспрессии белка, а также недавно разработанные лазерная абляция, электроспреи, ионизация (LAESI) и анализ морских коньков для оценки метаболических профилей. Используя эту модель в сочетании с описанными выше методами, мы обнаружили, что популяция лейкозных клеток БП имеет фенотип, устойчивый к химиотерапии, который уникален по сравнению с лейкозными клетками, культивируемыми только в средах или восстановленными из других субпопуляций в той же кокультуре. Таким образом, эта модель позволяет проводить более тщательную оценку для тестирования стратегий, нацеленных на наиболее устойчивые к химиотерапии лейкозные клетки, которые получают свой устойчивый фенотип за счет взаимодействия с микроокружением костного мозга.

Протокол

1. Расширенный Получение

1. Подготовка декстран частицы G10.
   1. Подготовьте G10 суспензии путем добавления 50 мл 1x PBS 10 частиц г G10. Смешайте инверсией и позволяют G10 оседать из фосфатно (PBS) при 4 ° CO / N.
   2. День разделения колонок G10, аспирата PBS из осажденных частиц G10 и добавить 50 мл свежего PBS. Смешайте обращением. Повторите дважды, добавляя 50 мл свежего PBS в осажденных частиц G10 и хранить при температуре 4 ° С до готовности к использованию.
2. Культивирование СККМ и OB.
   1. Поддержание как BMSC или OB при 37 ° С в 6% CO ₂ и выращенной на 10 см культуральных планшетах до 90% слияния пока не будет достигнута.
   2. Trypsinize СККМ или OB клетки и разделить 1: 2 на новые 10 см пластинах. Клетки выращивают до этих стандартов пока нет необходимости для лейкозных совместного культивирования.

2. Установление и поддержание совместно культуры

1. Добавить 5-20 ^{× 10 6} лейкозных клеток яп 10 мл опухоли конкретного питательных сред на 80% -90% сливной СККМ или OB пластины.
   Примечание: В нашей лаборатории поддерживает совместное культивирование при 37 ° С в 5% _{O 2,} чтобы лучше перепросматривать микросреду костного мозга, которые, как было показано в диапазоне от 1% до 7% ^16-18. Однако поддержание совместное культивирование при этом напряжения кислорода не является критическим для создания трех лейкозных субпопуляций и по усмотрению лаборатории.
2. Каждый ^{4-й день} удалить все, кроме 1 мл СМИ (в том числе лейкозных клеток в суспензии) и заменить 9 мл свежего лейкозных культуральной среде. При удалении 9 мл среды из пластины, будьте осторожны, чтобы не нарушить клейкий слой СККМ или OB.
   1. Удалить СМИ, наклоняя тарелку в сторону и аспирации СМИ в углу пластины. Кроме того, при добавлении свежей среды, обязательно добавьте по каплям в углу пластины против боковине, чтобы обеспечить минимальное нарушение липкий слой СККМ или OB.
3. После ^{12-й день} совместного культивирования, промыть лейкозных клеток из СККМ или OB слоя с помощью пипетки культуральной среды от блюдо вверх и вниз мягко по блюду приблизительно от 5 до 10 раз, а затем собрать в 15 мл коническую трубку. Reseed на новом 80% -90% сливной СККМ или OB пластины, как описано в шаге 2.1.
   Примечание: нежный полоскание совместного культивирования, как описано в шаге 2.3 снимет S и PB лейкозных клеток, не нарушая СККМ или OB монослой. Это позволяет только опухолевые клетки должны быть переданы к следующему совместно культурального планшета. Это 12-дневный цикл можно повторять столько раз, сколько необходимо на основе потребностей пользователей.

3. Подготовка Колонны G10 бисера

Примечание: Если стерильной анализ ниже или культивирование требуется после G10 разделения колонок следующие шаги должны быть выполнены с использованием стерильной техники и G10 колонки должны быть установлены в стерильной биологической капотом.

1. Предварительно ваRM среды для культивирования клеток до 37 ° С в водяной бане (~ 30 мл на колонке). Использование 10 мл одноразовый шприц, снимите и выбросьте поршень. Добавить стекловату для шприца.
2. С помощью пинцета растащить стекловату на тонкие оголенные жилы. Добавить несколько слоев слегка упакованном стекловаты со шприцем до 2/3 шприца наполнен стекловатой.
   Примечание: Стекловолокно имеет решающее значение для предотвращения свободные G10 частицы от загрязняющих коллекцию лейкозных клеток. Убедитесь стекловата упакован достаточно, чтобы поддержать частицы G10, но не слишком плотно упакованы, чтобы блокировать поток носителя через колонку.
3. Приложить 1-ходовой кран с наконечником шприца в закрытом положении.
4. Зажим Шприц столбец кольца стоят достаточно высоко так 50 мл коническую трубку (сбор трубки) могут быть размещены под краном. Поместите пробирку в колонке шприца.
5. Использование 10 мл пипетки добавить по каплям, частицы G10 ресуспендировали в PBS в колонну сверхустекловата. Продолжайте добавлять частицы G10 пока мл гранул ~ 2 (как измерено градаций на шприце) из G10 частиц форм на верхней части стекловаты.
6. Равновесие колонку G10 с подогретого СМИ.
   1. Добавить 2 мл подогретого СМИ в колонну. Открыть кран клапан медленно, так что среда проходит из колонны по каплям.
   2. Повторите шаг 3.6.1 до в общей сложности 10 мл подогретого СМИ были натыкался колонны.
      Примечание: Если частицы G10 видны в потоке через в пробирку, либо 1) добавить больше частиц G10 для поддержания ~ 2 мл гранул убедившись никаких дополнительных частицы G10 не выйдут из колонки или 2) заменить колонну с неиспользуемом одном и повторение шаги 3.4-3.6.1.
   3. После канализацию подогретого СМИ из колонны, закрыть водопроводный кран и выбросить пробирку для сбора с потоком через. Добавить новую коллекцию трубку под колонку. Колонка готова к загрузке с носителя + клеток смеси.
      Примечание: Столбцыследует использовать немедленно и не дают высохнуть.

4. Разделение 3 субпопуляции в совместной культуре

1. Коллекция подвеска (S) опухоли субпопуляции.
   1. Аспирируйте средств массовой информации из со-планшет для культивирования с пипеткой и осторожно повторно применить те же средства массовой информации, чтобы ополоснуть тарелку и собирать носители, содержащие лейкозных клеток в 15 мл коническую трубку. В лейкозных клеток, собранных являются S субпопуляции.
2. Коллекция Фаза Bright (PB) субпопуляции опухоли.
   1. Добавить 10 мл свежей среды обратно на совместное культурального планшета. Промыть энергично с помощью пипетки сообщили СМИ вверх и вниз примерно в 5 раз, чтобы удалить прилипшие лейкозных клеток, но не достаточно сильно, чтобы выбить клейкий СККМ / OB компонент.
   2. Аспирируйте с пипеткой и собирать СМИ в 15 мл коническую трубку. Собранные клетки ПБ субпопуляции.
3. Коллекция Фаза Dim (PD) субпопуляции опухоли.
   1. Промыть пластины с 1 мл PBS в бэрOve остальные СМИ. Trypsinize совместное культивирование пластина с 3 мл трипсина и место в 37 ° C инкубаторе в течение 5 мин.
   2. Удалить пластину из инкубатора и слегка постучите сторон пластины, чтобы сместить клейкий СККМ / OB.
   3. Добавить 1 мл эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) и пипетки вверх и вниз 3-5 раз, чтобы разбивайте большие клеточные агрегаты.
   4. Собирают носитель с клетками в конической трубе 15 мл. Эти клетки неочищенную PD субпопуляции с СККМ / OB, а также.
4. Центрифуга 3 изолированные субпопуляции при 400 мкг в течение 7 мин. Аспирируйте и отбросить супернатант затем по отдельности ресуспендируют гранул в 1 мл подогретого СМИ. Клетки готовы быть загружали на колонку G10.

5. Загрузка Сотрудничество культуры клеток на G10 колонке

Примечание: Убедитесь, кран полностью закрыт перед добавлением среды, содержащей клетки в колонну G10. Кроме того, каждый субпопуляции должны быть подбежал отдельной колонке G10, чтобы не Вве каких-либо предубеждений между населением в прямом анализа.

1. Использование 1000 мкл пипетки внести 1 мл каждой клеточной субпопуляции в подогретого СМИ в отдельную колонку G10 каплям. Убедитесь, что носитель, содержащий клетки остается на вершине или в G10 гранул. Разрешить клетки инкубировать на G10 гранулы в течение 20 мин при комнатной температуре.
   Примечание: Запорный остается закрытым для продолжительности инкубации.

6. Сбор лейкозных клеток из G10 колонке

1. Добавить 1-3 мл подогретого СМИ, чтобы каждый столбец G10. Открыть кран клапан и позволяют СМИ медленно выйти каплям колонна.
   Примечание: Очень важно, чтобы поддерживать скорость медленного потока из колонки или G10 осадок, содержащий СККМ / OB можно мыть из колонки и загрязнять изолированные лейкозных клеток.
2. Продолжайте добавлять подогретого СМИ небольшими порциями (1-2 мл) на колонке G10 пока в общей сложности от 15 до 20 мл пробежала колонку и была собрана. Закрыть кран ваLVE и колпачок коллекция трубки.
   Примечание: Если осадок G10 частиц видно на дне пробирку, осторожно удалить носитель из трубки, оставляя G10 осадок частиц в покое и передача новую пробирку.
3. Центрифуга собраны носители при 400 мкг в течение 7 минут при комнатной температуре. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок клеток в буфере соответствующей для нисходящего применения.
4. Клетки теперь чистый население лейкозных клеток, свободных от СККМ или загрязнения OB и готовы быть применены для последующих применений при усмотрению пользователя.
   Примечание: лейкозных жизнеспособность клеток должна оставаться неизменной при прохождении клетки через G10 столбцов.

Результаты

Успешное настройка и культура этой совместным культивированием модели приведет к созданию 3 субпопуляции лейкозных клеток по отношению к клейкой СККМ или OB монослоя. Рис 1 показано, как все клетки высевали в монослой СККМ изначально появляются как только один население приостановлено лейкозных клеток. В течение 4-х дней лейкозных клеток взаимодействуют с BMSC с образованием 3 пространственные субпопуляций лейкозных клеток (приостановлено (S), фаза яркий (ПБ), и фазовые ...

Обсуждение

Минимальной остаточной болезни (МОБ), который способствует рецидиву заболевания продолжает оставаться основной клинической проблемой при лечении агрессивной огнеупоров ALL, а также, множество других гематологических опухолей. Микросреда костного мозга является наиболее частой локализацией рецидива во всех ^3,8. Таким образом, модели, моделирующие микросреду костного мозга являются жизненно важными инструментами для проверки гипотез, связанных с выживанием лейкозных клеток опухоли и поддержания МОБ при воздейст...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Бусины сефадекса G10	Sigma	G10120	Упоминаются в рукописи как гель типа 10 сшитые частицы декстрана
10 мл стерильный шприц	BD	309604
Стекловата	Pyrex	3950
1-way запорные краны	World Precision Instruments, Inc.	14054-10
Конические центрифужные пробирки 50 мл	World Wide Medical Products	41021039	Используются в качестве пробирок для сбора
15 мл конические центрифужные пробирки	World Wide Medical Products	41021037	Используются для сбора клеток
Фетальная бычья сыворотка	Sigma	F6178
0,05% трипсин	Медиатек, Инк.	25-053-CI
100 x 20 мм Чашки для клеточных культур	Greiner Bio-One	664160
Питательные среды
Osteoblast питательные среды	PromoCell	C-27001	Для сред остеобластов человека
RPMI 1640 медиа	Mediatech, Inc.	15-040	Для подготовки опухолевой среды
Cell lines
адгезивные клетки:
Human Osteoblasts	PromoCell	C-12720	Человеческие остеобласты были культивированы в соответствии с поставщиком .
Костные костные клетки Морроу	WVU Biospecimen Core		Деидентифицированные первичные клетки лейкемии человека и стромальные клетки костного мозга (BMSC) были предоставлены Центром обработки биообразцов Онкологического центра Мэри Бэбб Рэндольф (MBRCC) и Банком тканей Департамента патологии Университета Западной Вирджинии. Культуры BMSC были созданы как описано ранее (*)
Leukemic Cells: клетки REH
REH		ATCC ATCC-CRL-8286	культивировали в соответствии с данными поставщика' s и рекомендуемые СМИ.
SD-1	DSMZ	ACC 366	SD-1 культивировали в соответствии с требованиями поставщика' s и рекомендуемые СМИ.
(*) Gibson LF, Fortney J, Landreth KS, Piktel D, Ericson SG, Lynch JP. Нарушение функции стромальных клеток костного мозга под действием этопозида. Трансплантация костного мозга Biol J Am Soc Трансплантация костного мозга. 1997 Август; 3(3):122–32.