В настоящем отчете обобщен протокол, который может быть использован для моделирования влияния ниши микроокружения костного мозга на лейкозные клетки с акцентом на обогащение наиболее химиорезистентной субпопуляции.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Моделирование резистентностью к химиотерапии лейкоз
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Хорошо известно, что микроокружение костного мозга является уникальным местом убежища для заболеваний кроветворения, которые как начинаются, так и прогрессируют в этом месте. Модель, представленная в настоящем отчете, использует первичные стромальные клетки костного мозга человека и остеобласты в качестве двух репрезентативных типов клеток из ниши костного мозга, которые влияют на фенотип опухолевых клеток. Условия совместного культивирования in vitro, описанные для лейкозных клеток человека с этими первичными нишевыми компонентами, поддерживают создание химиорезистентной субпопуляции опухолевых клеток, которые могут быть эффективно извлечены из культуры для анализа с помощью различных методов. Строгий график кормления для предотвращения потоков питательных веществ с последующим восстановлением популяции опухолевых клеток (G10) с помощью гелевых частиц сшитого декстрана (G10) популяции опухолевых клеток, которые мигрировали под адгезивные стромальные клетки костного мозга (BMSC) или остеобласты (OB), генерируя популяцию опухолевых клеток «фазового дима» (PD), обеспечивает постоянный источник очищенных резистентных к терапии лейкозных клеток. Эта клинически значимая популяция опухолевых клеток может быть оценена с помощью стандартных методов для исследования апоптотических, метаболических и регуляторных путей клеточного цикла, а также для обеспечения более строгой мишени для тестирования новых терапевтических стратегий до доклинических исследований, направленных на минимальное остаточное заболевание.
Введение
Общая цель описанного метода - обеспечить эффективный, экономически эффективный подход in vitro, который поддерживает исследование механизмов, лежащих в основе выживаемости лейкозных клеток с поддержкой костного мозга во время воздействия химиотерапии. Хорошо известно, что выжившие остаточные опухолевые клетки, сохраняющиеся после лечения, способствуют рецидиву заболевания, который часто протекает более агрессивно, чем при постановке диагноза, и часто лечится менее эффективно1-8. Модели, включающие лейкозные клетки изолированно, например, ограниченные культивированием клеток только в средах, для тестирования терапевтических подходов не учитывают эт....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Расширенный Получение
- Подготовка декстран частицы G10.
- Подготовьте G10 суспензии путем добавления 50 мл 1x PBS 10 частиц г G10. Смешайте инверсией и позволяют G10 оседать из фосфатно (PBS) при 4 ° CO / N.
- День разделения колонок G10, аспирата PBS из осажденных частиц G10 и добавить 50 мл свежего PBS. Смешайте обращением. Повторите дважды, добавляя 50 мл свежего PBS в осажденных частиц G10 и хранить при температуре 4 ° С до готовности к использованию.
- Культивирование СККМ и OB.
- Поддержание как BMSC или OB при 37 ° С в 6% CO 2 и выращенной на 10 см культуральных планшетах до 90% слияния пока не бу....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Успешное настройка и культура этой совместным культивированием модели приведет к созданию 3 субпопуляции лейкозных клеток по отношению к клейкой СККМ или OB монослоя. Рис 1 показано, как все клетки высевали в монослой СККМ изначально появляются как только один население приостановлено лейкозных клеток. В течение 4-х дней лейкозных клеток взаимодействуют с BMSC с образованием 3 пространственные субпопуляций лейкозных клеток (приостановлено (S), фаза яркий (ПБ), и фазовые .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Минимальной остаточной болезни (МОБ), который способствует рецидиву заболевания продолжает оставаться основной клинической проблемой при лечении агрессивной огнеупоров ALL, а также, множество других гематологических опухолей. Микросреда костного мозга является наиболее частой локализацией рецидива во всех 3,8. Таким образом, модели, моделирующие микросреду костного мозга являются жизненно важными инструментами для проверки гипотез, связанных с выживанием лейкозных клеток опухоли и поддержания МОБ при воздейст.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
У авторов нет конкурирующих финансовых интересов.
Благодарности
При поддержке Национальных институтов здравоохранения (NHLBI) R01 HL056888 (LFG), Национального института рака (NCI) RO1 CA134573NIH (LFG), P30 GM103488 (LFG), WV CTR-IDEA NIH 1U54 GM104942, Программы Александра Б. Осборна по гемопоэтическим злокачественным новообразованиям и трансплантации и Исследовательскому трастовому фонду WV. Мы благодарны за поддержку доктору Кэти Брэндедж и Центру проточной цитометрии Университета Западной Вирджинии, при поддержке NIH S10-OD016165 и премии за институциональное развитие (IDeA) от Института общих медицинских наук NIH Национальных институтов здравоохранения (CoBRE P30GM103488 и INBRE P20GM103434).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Бусины сефадекса G10 | Sigma | G10120 | Упоминаются в рукописи как гель типа 10 сшитые частицы декстрана |
| 10 мл стерильный шприц | BD | 309604 | |
| Стекловата | Pyrex | 3950 | |
| 1-way запорные краны | World Precision Instruments, Inc. | 14054-10 | |
| Конические центрифужные пробирки 50 мл | World Wide Medical Products | 41021039 | Используются в качестве пробирок для сбора |
| 15 мл конические центрифужные пробирки | World Wide Medical Products | 41021037 | Используются для сбора клеток |
| Фетальная бычья сыворотка | Sigma | F6178 | |
| 0,05% трипсин | Медиатек, Инк. | 25-053-CI | |
| 100 x 20 мм Чашки для клеточных культур | Greiner Bio-One | 664160 | |
| Питательные среды | |||
| Osteoblast питательные среды | PromoCell | C-27001 | Для сред остеобластов человека |
| RPMI 1640 медиа | Mediatech, Inc. | 15-040 | Для подготовки опухолевой среды |
| Cell lines | |||
| адгезивные клетки: | |||
| Human Osteoblasts | PromoCell | C-12720 | Человеческие остеобласты были культивированы в соответствии с поставщиком . |
| Костные костные клетки Морроу | WVU Biospecimen Core | Деидентифицированные первичные клетки лейкемии человека и стромальные клетки костного мозга (BMSC) были предоставлены Центром обработки биообразцов Онкологического центра Мэри Бэбб Рэндольф (MBRCC) и Банком тканей Департамента патологии Университета Западной Вирджинии. Культуры BMSC были созданы как описано ранее (*) | |
| Leukemic Cells: клетки REH | |||
| REH | ATCC ATCC-CRL-8286 | культивировали в соответствии с данными поставщика' s и рекомендуемые СМИ. | |
| SD-1 | DSMZ | ACC 366 | SD-1 культивировали в соответствии с требованиями поставщика' s и рекомендуемые СМИ. |
| (*) Gibson LF, Fortney J, Landreth KS, Piktel D, Ericson SG, Lynch JP. Нарушение функции стромальных клеток костного мозга под действием этопозида. Трансплантация костного мозга Biol J Am Soc Трансплантация костного мозга. 1997 Август; 3(3):122–32. |
Ссылки
- Ayala, F., Dewar, R., Kieran, M., Kalluri, R. Contribution of bone microenvironment to leukemogenesis and leukemia progression. Leukemia. 23 (12), 2233-2241 (2009).
- Coustan-Smith, E., Sancho, J., et al. Clinical importance of minimal residual disease....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
