Методическая статья

Быстрый и эффективный метод для очистки эндодермы клеток, полученных из эмбриональных стволовых клеток человека

8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/53655

⸱

3 марта 2016 г.

 ,  , 
1Institute of Clinical Biochemistry, Hannover Medical School

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы опишем метод очистки дифференцированных эмбриональных стволовых клеток человека, которые совершаются по отношению к окончательному энтодермы для улучшения последующих применений и дальнейших дифференцировок.

Аннотация

Возможности дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток, таких как эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) позволяют потенциальное терапевтическое применение для клеточной заместительной терапии. Терминально дифференцированных типов клеток могут быть использованы для лечения различных дегенеративных заболеваний. В пробирке дифференцировки этих клеток по отношению к тканям легких, печени и поджелудочной железы требует в качестве первого шага генерации окончательных эндодермы клеток. Этот шаг является ограничивающим скорость для дальнейшей дифференциации по отношению к неизлечимо созревших типов клеток, таких как инсулин-продуцирующих бета-клеток, гепатоцитов или других эндодермы типов клеток. Клетки, которые совершаются в направлении энтодермы линии высоко выражают множество транскрипционных факторов, таких как Foxa2, SOX17, HNF1B, члены семьи GATA, и поверхностный рецептор CXCR4. Тем не менее, протоколы дифференциации редко эффективны на 100%. Здесь мы опишем метод для очистки популяции CXCR4 + клеток после дифференцировкив ДЭ с использованием магнитных микрогранул. Эта очистка дополнительно удаляет клетки нежелательных линий. Метод нежной очистки является простым и надежным и может быть использовано для улучшения вниз по течению приложений и дифференциацию.

Введение

Плюрипотентные стволовые клетки, такие как эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) обладают способностью дифференцироваться в практически любой тип клеток человеческого организма. Таким образом, экстракорпоральное протоколы дифференцировки могут быть использованы для создания многочисленных типов зрелых клеток , таких как кардиомиоциты 1, гепатоциты 2, бета - клетки, эпителиальные 3 легких 4 или 5 нейрональных клеток. Это делает ESCS ценным инструментом для потенциального лечения различных дегенеративных заболеваний 3.

Дифференциация в пробирке ЭСК в сторону взрослых тканей легких, печени и поджелудочной железы требует псевдо-гаструляции в клетки , напоминающие окончательное энтодермы (DE) 6. Так как ниже по течению дифференциации по отношению к вышеупомянутым типов соматических клеток значительно менее эффективно, оптимальная дифференциация эндодермы рассматривается как ограничивающий скорость 7. Клетки, которые совершаются в направлении энтодермы линии подвергаются тяracteristic изменения в их профиля экспрессии генов. Гены мастер Плюрипотентность регулятора вниз регулируется, тогда как экспрессия других факторов транскрипции , таких как Foxa2, SOX17, HNF1B, членов семейства GATA и поверхностного рецептора CXCR4 высоко активируемых 6, 8, 9. CXCR4 , как известно, трансактивируется по SMAD2 / 3, ниже по потоку Узловое сигнализации / TGF-бета и SOX17 из - за специфических участков связывания в его промоторной области 10. Таким образом , это очень подходит маркер , используемый в ряде докладов 6, 8, 11-13. Эти изменения экспрессии отражает событие псевдо-гаструляции, в которой ЭСК сначала приобрести характеристики первичной полоски типа клеточной популяции , а затем совершить в энтодермы зародышевого слоя 6.

Тем не менее, протоколы дифференциации редко 100% эффективны , как несколько клеток могут сопротивляться процессу дифференциации или дифференциации по отношению к другим непредвиденным родословных 14. Эти клетки могут отрицательно influeсть дальнейшая дифференциация. Кроме того, остаточные недифференцированные клетки питают большие риски для последующих экспериментов по трансплантации и может привести к тератомы 15-17.

Чтобы удалить эти нежелательные клетки на ранней на поверхности маркера CXCR4 может быть использован для очистки клеток, которые совершаются в направлении DE 18. Здесь мы опишем метод позитивного отбора CXCR4 + клеток от дифференциации культур DE. Для этого поверхность маркер CXCR4 связывается с антителом, которое затем, в свою очередь связывается с магнитными микрогранул. В отличие от жестких условий во время FACS сортировки, Магнитно меченых DE-подобные клетки могут затем легко быть очищены в формате стендовых, используя щадящий метод очистки. Этот протокол обеспечивает простой способ удаления клеточных популяций, противоставших процесса дифференцировки DE.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Дифференциация человека ESC к Definitive энтодермы

  1. Выращивают человеческих эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) в термостате при температуре 37 ° С и 5% CO 2.
  2. Coat новый 6-луночный культуральный планшет с 1 мл матрицы базальной мембраны и инкубировать культуры стеклотару в течение по крайней мере 30 минут при комнатной температуре. Для конкретных деталей просьба обращаться к инструкции соответствующего изготовителя.
  3. Убедитесь , что культивированные человеческие стволовые клетки достигли 80% -90% слитности под микроскопом с использованием низкой кратности (например, 4X). Аспирируйте среды из полостей путем отсасывания среды с стерильную стеклянную пипетку Пастера. Промывают клетки один раз фосфатным буферным раствором солевого раствора (PBS). Для этого, добавьте 2 мл PBS в каждую лунку мягко встряхните тарелку и отсасывать раствора для удаления мертвых клеток и клеточных обломков.
  4. Добавьте 1 мл реагента пассажи раствора фермента бесплатно для бережной диссоциации клеточных кластеров. Инкубируйте клетки при 37 ° С А.Н.d 5% CO 2 до тех пор , пока клетки не показывают явные признаки разрушения на мелкие кластеры.
    Примечание: в зависимости от используемого реагента Время инкубации. Для ферментного раствора без пассирования, указанного в разделе Материалы, время инкубации составляет примерно 7 мин.
  5. Добавляют 1 мл DMEM / F-12 среду и разрушают оставшиеся клеточных агрегатов на отдельные клетки пипетированием вверх и вниз с помощью пипетки 1 мл. Используйте это, чтобы промыть клетки с поверхности и перенести клетки в центрифужную пробирку. Чтобы получить все клетки, промойте каждую лунку с 1 мл DMEM / F-12 среды и добавить среду в центрифужную пробирку.
  6. Центрифуга клетки в течение 5 мин при 300 х г. Аспирируйте супернатант и клетки вновь суспендируют в 5 мл ES клеточной культуральной среде, содержащей 10 мкМ Rho-киназы (ROCK) ингибитор.
  7. Подсчитайте клетки под микроскопом использованием гемоцитометра и семян 150000 - 400000 клеток на 6-луночных или в другой компоновщик пластины, в зависимости от клеточной линии ES, используемой. Использование кульTURE среде , содержащей ингибитор ROCK 10 мкМ , чтобы избежать апоптоза и культивирования клеток в инкубаторе при температуре 37 ° С и 5% CO 2.
  8. Примерно 24 ч после посева аспирата среду с помощью стерильной стеклянной Пастера пипетку и добавьте 2 мл первичной полоски индукционной среде.
    Примечание: Эта среда содержит конечные концентрации 1% глутамина, 0,2% FCS, 5 мкМ Чир-99021 и 50 нг / мл активина А в Advanced RPMI-1640. Как правило, используют в 2 мл среды для культивирования в 6-луночных планшетах.
  9. 48 ч после посева, замените носитель на энтодермы индукционную среду. Культивировать клетки в этой среде в течение еще 48 часов с ежедневной сменой среды.
    Примечание: Эта среда содержит 1% глутамина, 0,2% FCS и 50 нг / мл активин А в Advanced RPMI-1640 среде. Клетки, которые совершаются по отношению к окончательному энтодермы выразить поверхностный маркер CXCR4. Окрашивание CXCR4 может быть использован для количественного определения количества ДЕ-совершенных клеток.
2. Окрашивание CXCR4 + Definitive эндодермы клеток для анализа потока цитометрии

  1. Для последнего 24 ч, но не менее 1 ч до сбора клеток добавляют ингибитор ROCK 10 мкМ в культуральную среду.
  2. Покрыть клеточной культуры посуда , которая будет использоваться для повторного сева с матрицей базальной мембраны, то есть, 12-луночные планшеты для анализа или камеры слайдов КПЦР для иммунофлуоресцентного окрашивания. Инкубируйте пластин или слайды в течение по крайней мере 30 минут при комнатной температуре.
  3. Аспирируйте среду со стерильной стеклянной пастеровской пипеткой из скважин дифференцированных клеток, используемых для окрашивания и / или сортировки.
  4. Добавьте 1 мл реагента пассажи раствора фермента бесплатно для бережной диссоциации клеточных кластеров. Инкубируйте клетки при 37 ° С и 5% CO 2 до тех пор , пока клетки не показывают явные признаки разрушения в небольшие кластеры.
    Примечание: в зависимости от используемого реагента Время инкубации. Для ферментного раствора без пассирования упомянутого в материаALS раздел, время инкубации составляет примерно 7 мин.
  5. Добавляют 1 мл DMEM / F-12 среду и разрушают оставшиеся клеточные агрегаты на отдельные клетки пипетированием вверх и вниз с помощью 1 мл кончик. Используйте это, чтобы промыть клетки с поверхности и перенести клетки в центрифужную пробирку. Для того, чтобы получить все клетки, промойте каждую лунку с 1 мл DMEM / F-12 среды без FCS и добавить среду в центрифужную пробирку.
  6. Граф клеток под микроскопом с использованием гемоцитометра. Клетки из трех лунках 6-луночного планшета должно привести к 10-15 х 10 6 клеток после трех суток дифференцировки. Центрифуга клетки в течение 5 мин при 300 х г.
    Примечание: Точное количество полученных клеток будет зависеть от линии плюрипотентных клеток , используемых для дифференциации.
  7. Аспирируйте супернатант и клетки вновь суспендируют в буфере, содержащем ПЭБ ингибитор ROCK 10 мкМ. Используйте 100 мкл этого буфера до 10 7 клеток. Добавить ингибитор раскачивать 10 мкМ в день stainiнг. Используйте этот буфер для всех последующих применений (называемый ПЭБ буфер + RI).
    Примечание: ПЭБ буфер содержит 0,5% бычьего сывороточного альбумина и 2 мМ ЭДТА в PBS. Если больше клетки должны быть окрашены, регулировать громкость буфера соответственно.
  8. Добавьте 10 мкл антитела CXCR4-АРС на 10 7 клеток в 100 мкл, это примерно представляет собой разведение 1:10.
    Примечание: Использование БТР-связанного антитела не является обязательным. Вместо того, чтобы его можно заменить в зависимости от используемых микрошариков. Если все большее число клеток окрашиваться регулировать громкость антител соответственно.
  9. Смешать, осторожно переворачивая трубку с пальцами и инкубировать при температуре 4 ° С в холодильнике в течение 15 мин. Ресуспендируют клеток с 1-2 мл буфера ПЭБ. Центрифуга клетки в течение 5 мин при 300 х г.
  10. Аспирируйте супернатант со стерильным стеклянным Пастера пипетку и ресуспендируют осадок клеток в 80 мкл PEB на 10 7 клеток и добавляют 20 мкл анти-APC микрогранулы.
    ЗАМЕТКА: Если больше клетки должны быть окрашены, отрегулировать громкость микро-шарик соответственно.
  11. Смешать, осторожно переворачивая трубку с пальцами и инкубировать при температуре 4 ° С в холодильнике в течение 15 мин. Ресуспендируют клеток с 1-2 мл буфера ПЭБ + RI. Центрифуга клетки в течение 5 мин при 300 х г. Аспирируйте буфер. Ресуспендируют в 500 мкл буфера ПЭБ + RI.

3. Магнитное разделение CXCR4 + клеток

  1. Место среднего размера магнитного колонки в магнитном поле в соответствии с инструкциями производства. Предварительно промыть колонку с 500 мкл буфера ПЭБ + RI. Нанести всю клеточную суспензию в колонку. Собирают поток через так как не все клетки связываются с колонкой. Убедитесь в том, чтобы не нарушить столбцы для оптимального извлечения CXCR4 + клеток.
  2. Промыть колонку три раза с 500 мкл буфера ПЭБ + RI. Возьмите первый поток через и объединить его с собранных клеток со стадии 3.1. Удалите магнитную колонку из магнитного поля и поместить его вподходящей коллекции трубки. Добавить 1 мл буфера PEB + RI на колонку. Для элюирования клетки плотно прижимать плунжер в колонну.
  3. Дополнительно: Собрать все поток через образцы отдельно и использовать 20 мкл каждого для анализа количество CXCR4 клеток + с помощью проточной цитометрии. Их число должно уменьшаться с каждым шагом промывки.
    Примечание: По крайней мере , 2 х 10 4 жизнеспособны, забор с воротами клетки должны быть подсчитаны для получения надежных результатов.
  4. Повторите шаги 3.1-3.3 с собранными потока через образец из шага 3.1 и первого потока через образец со стадии 3.2, используя новый столбец. Не повторно использовать предыдущий столбец. С помощью плунжера воздух нагнетается в колонну, которая блокирует его.
  5. Граф клеток под микроскопом с использованием гемоцитометра. В зависимости от эффективности дифференцировке до 6 х 10 6 клеток могут быть отсортированы сначала и еще 1 х 10 6 клеток с помощью второго столбца при использовании 10 7 клеток для процедуры.
  6. Центрифуга клетки при 300 мкг в течение 5 мин. Отберите супернатант и стерильной стеклянной Пастера пипетку и ресуспендирования клеток в 1 мл эндодермы индукции среды со стадии 1.9 с дополнительным ингибитором ROCK 10 мкМ.
  7. Граф клеток под микроскопом с использованием гемоцитометра. Семенной клетки при соответствующей плотности, т.е. ~ 4 × 10 5 клеток на лунку 12-луночного планшета (ок. 3,6 см 2 поверхности) или ~ 1,5 × 10 5 клеток на лунку 8-и камерного горкой.

4. Необязательно: Анализ Очищенный Definitive энтодермы населения

  1. Для окрашивания иммунофлюоресценции фиксируют очищенные клетки от стадии 3,7 примерно 24 ч после посева с 4% параформальдегидом и пятна для окончательного энтодермы (DE) и / или плюрипотентности маркерных белков.
    Примечание: Обычно используемые DE маркеры включают Foxa2 и SOX17, обычно используемые маркеры плюрипотентности включают Oct3 / 4, NANOG и SOX2 6, 8.
  2. FoАнализ г RT-КПЦР, собрать очищенные клетки непосредственно или 24 ч после посева, извлечения общей РНК и обратной транскрипции кДНК из извлеченных образцов общей РНК. Используйте 10 нг кДНК в качестве матрицы в реакции RT-КПЦР (трехкратном повторе) для анализа экспрессии DE и плюрипотентности маркеров генов 6, 8.
    Примечание: Обычно используемые маркерные гены упоминаются в шаге 4.1. Условия цикла 5 мин при 95 ° С и 40 циклов 15 с при 95 ° С и 1 мин при 60 ° С, с последующим расплавлением анализа кривых.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

При дифференциации Стволовые клетки претерпевают резкие изменения в гене и экспрессии белка. На рисунке 1 представлена ​​типичные гены - маркеры , которые могут быть использованы для проверки успешной дифференциации энтодермы. Prime цели для анализа экспрессии генов являются GSC, Foxa2 и SOX17. В относительном анализе экспрессии генов особенно Foxa2 и SOX17 увеличиваются> 2000 раз по сравнению с недиффере...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В настоящее время используются протоколы дифференциации редко приводят к 100% дифференцированных клеток. По причинам, которые еще должны быть решены некоторые клетки сопротивляются процесса дифференцировки. В зависимости от эффективности используемого протокола дифференцировки и Склонность ESC линии определенное количество остаточных плюрипотентных клеток, как правило, наблюдается даже после дифференцировки в окончательной энтодермы. Эти остаточные клетки могут ухудшить или вниз по течению дифференциацию дальнейшего ана...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Умелое техническая помощь Jasmin Kresse выражает искреннюю признательность.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Hues8 линия эмбриональных стволовых клеток человекаГарвардский факультет стволовых клеток и регенеративной биологииПодходящая клеточная линия для генерации энтодермы
Hes3 линия эмбриональных стволовых клеток человека ESCell InternationalПодходящая и надежная клеточная линия для генерации энтодермы
mTeSR1Stemcell Technologies5850ESC питательная среда
FCSBiowestS1860
Advanced RPMI 1640Life Technologies12633012
CD184 (CXCR4)-APC, человеческийMiltenyi Biotec130-098-357
анти-APC MicroBeadsMiltenyi Biotec130-090-855 
Сепаратор OctoMACSMiltenyi Biotec130-042-109магнитное поле
Y-27632Selleck ChemicalsS1049Ингибитор ROCK
CHIR-99021Tocris Bioscience4423
Активин АPeprotech120-14
Реагент для щадящей диссоциации клетокStemcell Technologies7174Без ферментов раствор для прохождения, альтернатива: Trypsin/EDTA
Matrigel*Corning354277матрицу базальной мембраны
* растворить и хранить в аликвотах при -80 °°; C, как указано в руководстве для поставщиков. После использования разморозьте на льду, разведите в 25 мл ледяного нокаута DMEM/F-12.
Добавьте по 1 мл в каждую лунку 6-луночного планшета и выдерживайте в течение 45 минут при комнатной температуре.
Извлеките матригель и используйте немедленно.
MS КолонкиMiltenyi Biotec30-042-201
MACS СепараторMiltenyi Biotec130-042-302
Human FOXA2 FW
gggagcggtgaagatgga		Life TechnologiesNA
Human FOXA2 REV
tcatgttgctcacggaggta		Life Technologies
Human GSC FW
gaggagaaagtggaggtctggtt		Life Технологии
Human GSC REV
ctctgatgaggaccgctctg		Life Technologies
SOX17 TaqMan анализApplied BiosystemsHs00751752_s1
человека SOX7 FW
gatgctgggaaagtcgtggaagg		Life Technologies
Human SOX7 REV
tgcgcggccggggtacttgtag		Life Technologies
Человек POU5F1 FW
cttgctgcagaagtgggtggagg		Life Technologies Человек
POU5F1 REV
ctgcagtgggtggttcgggca		Life Technologies
Человек Nanog FW
ccgagggcagacatcc		Life Technologies
Человек Nanog REV
ccatccactgccacatcttct		Life Technologies Человек
TBP FW
caa cag cct gcc acc tta cgc tc		Life Technologies
Human TBP REV
agg ctg tgg ggt cag tcc agt g		Life Technologies
Human TUBA1A FW
ggc agt gtt gtt tgt aga ctt gga acc c		Life Technologies
Human TUBA1A REV
tgt gat aag ttg ctc agg gtg gaa g		Life Technologies
Human G6PD FW
agg ccg tca cca aga aca ttc a		Life Technologies
Human G6PD REV
cga tga tga tgc ggt tcc agc cta t 		Life Technologies
Anti-SOX2Santa Cruz Biotechnologysc-17320
Anti-FOXA2MerckMillipore07-633
Anti-SOX17R& D СистемыAF1924

Ссылки

  1. Sharma, A., Li, G., Rajarajan, K., Hamaguchi, R., Burridge, P. W., Wu, S. M. Derivation of Highly Purified Cardiomyocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Small Molecule-modulated Differentiation and Subsequent Glucose Starvation. J Vis Exp. (97), (2015).
  2. Sgodda, M., et al. Improved hepatic differentiation strategies for human induced pluripotent stem cells. Curr Mol Med. 13 (5), 842-855 (2013).
  3. Naujok, O., Burns, C., Jones, P. M., Lenzen, S. Insulin-producing surrogate beta-cells from embryonic stem cells: are we there yet. Mol Ther. 19 (10), 1759-1768 (2011).
  4. Katsirntaki, K., et al. Bronchoalveolar sublineage specification of pluripotent stem cells: effect of dexamethasone plus cAMP-elevating agents and keratinocyte growth factor. Tissue Eng Part A. 21 (3-4), 669-682 (2015).
  5. Abranches, E., et al. Neural differentiation of embryonic stem cells in vitro: a road map to neurogenesis in the embryo. PLoS One. 4 (7), e6286(2009).
  6. Naujok, O., Diekmann, U., Lenzen, S. The generation of definitive endoderm from human embryonic stem cells is initially independent from activin A but requires canonical Wnt-signaling. Stem Cell Rev. 10 (4), 480-493 (2014).
  7. D'Amour, K. A., et al. Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 24 (11), 1392-1401 (2006).
  8. Diekmann, U., Lenzen, S., Naujok, O. A reliable and efficient protocol for human pluripotent stem cell differentiation into the definitive endoderm based on dispersed single cells. Stem Cells Dev. 24 (2), 190-204 (2015).
  9. Kim, P. T., Ong, C. J. Differentiation of definitive endoderm from mouse embryonic stem cells. Results Probl Cell Differ. 55, 303-319 (2012).
  10. Katoh, M., Katoh, M. Integrative genomic analyses of CXCR4: transcriptional regulation of CXCR4 based on TGFbeta, Nodal, Activin signaling and POU5F1, FOXA2, FOXC2, FOXH1, SOX17, and GFI1 transcription factors. Int J Oncol. 36 (2), 415-420 (2010).
  11. Nostro, M. C., et al. Stage-specific signaling through TGFbeta family members and WNT regulates patterning and pancreatic specification of human pluripotent stem cells. Development. 138 (5), 861-871 (2011).
  12. Rezania, A., et al. Maturation of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors into functional islets capable of treating pre-existing diabetes in mice. Diabetes. 61 (8), 2016-2029 (2012).
  13. Bruin, J. E., et al. Maturation and function of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors in macroencapsulation devices following transplant into mice. Diabetologia. 56 (9), 1987-1998 (2013).
  14. Fu, W., Wang, S. J., Zhou, G. D., Liu, W., Cao, Y., Zhang, W. J. Residual undifferentiated cells during differentiation of induced pluripotent stem cells in vitro and in vivo. Stem Cells Dev. 21 (4), 521-529 (2012).
  15. Hentze, H., Soong, P. L., Wang, S. T., Phillips, B. W., Putti, T. C., Dunn, N. R. Teratoma formation by human embryonic stem cells: evaluation of essential parameters for future safety studies. Stem Cell Res. 2 (3), 198-210 (2009).
  16. Herberts, C. A., Kwa, M. S., Hermsen, H. P. Risk factors in the development of stem cell therapy. J Transl Med. 9, 29(2011).
  17. Naujok, O., Kaldrack, J., Taivankhuu, T., Jörns, A., Lenzen, S. Selective removal of undifferentiated embryonic stem cells from differentiation cultures through HSV1 thymidine kinase and ganciclovir treatment. Stem Cell Rev. 6 (3), 450-461 (2010).
  18. Pan, Y., Ouyang, Z., Wong, W. H., Baker, J. C. A new FACS approach isolates hESC derived endoderm using transcription factors. PLoS One. 6 (3), 17536(2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

CXCR4ROCK

Похожие статьи