Method Article

Быстрый и эффективный метод для очистки эндодермы клеток, полученных из эмбриональных стволовых клеток человека

DOI:

10.3791/53655

⸱

March 3rd, 2016

 ,  , 
1Institute of Clinical Biochemistry, Hannover Medical School

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы опишем метод очистки дифференцированных эмбриональных стволовых клеток человека, которые совершаются по отношению к окончательному энтодермы для улучшения последующих применений и дальнейших дифференцировок.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Возможности дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток, таких как эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) позволяют потенциальное терапевтическое применение для клеточной заместительной терапии. Терминально дифференцированных типов клеток могут быть использованы для лечения различных дегенеративных заболеваний. В пробирке дифференцировки этих клеток по отношению к тканям легких, печени и поджелудочной железы требует в качестве первого шага генерации окончательных эндодермы клеток. Этот шаг является ограничивающим скорость для дальнейшей дифференциации по отношению к неизлечимо созревших типов клеток, таких как инсулин-продуцирующих бета-клеток, гепатоцитов или других эндодермы типов клеток. Клетки, которые совершаются в направлении энтодермы линии высоко выражают множество транскрипционных факторов, таких как Foxa2, SOX17, HNF1B, члены семьи GATA, и поверхностный рецептор CXCR4. Тем не менее, протоколы дифференциации редко эффективны на 100%. Здесь мы опишем метод для очистки популяции CXCR4 + клеток после дифференцировкив ДЭ с использованием магнитных микрогранул. Эта очистка дополнительно удаляет клетки нежелательных линий. Метод нежной очистки является простым и надежным и может быть использовано для улучшения вниз по течению приложений и дифференциацию.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Плюрипотентные стволовые клетки, такие как эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) обладают способностью дифференцироваться в практически любой тип клеток человеческого организма. Таким образом, экстракорпоральное протоколы дифференцировки могут быть использованы для создания многочисленных типов зрелых клеток , таких как кардиомиоциты 1, гепатоциты 2, бета - клетки, эпителиальные 3 легких 4 или 5 нейрональных клеток. Это делает ESCS ценным инструментом для потенциального лечения различных дегенеративных заболеваний 3.

Дифференциация в пробирке ЭСК в сторону ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Дифференциация человека ESC к Definitive энтодермы

  1. Выращивают человеческих эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) в термостате при температуре 37 ° С и 5% CO 2.
  2. Coat новый 6-луночный культуральный планшет с 1 мл матрицы базальной мембраны и инкубировать культуры стеклотару в течение по крайней мере 30 минут при комнатной температуре. Для конкретных деталей просьба обращаться к инструкции соответствующего изготовителя.
  3. Убедитесь , что культивированные человеческие стволовые клетки достигли 80% -90% слитности под микроскопом с использованием низкой кратности (например, 4X). Аспирируйте среды из полостей путем отсасыва....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

При дифференциации Стволовые клетки претерпевают резкие изменения в гене и экспрессии белка. На рисунке 1 представлена ​​типичные гены - маркеры , которые могут быть использованы для проверки успешной дифференциации энтодермы. Prime цели для анализа экспрессии генов являются GSC, Foxa2 и SOX17. В относительном анализе экспрессии генов особенно Foxa2 и SOX17 увеличиваются> 2000 раз по сравнению с недиффере.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В настоящее время используются протоколы дифференциации редко приводят к 100% дифференцированных клеток. По причинам, которые еще должны быть решены некоторые клетки сопротивляются процесса дифференцировки. В зависимости от эффективности используемого протокола дифференцировки и Склонность ESC линии определенное количество остаточных плюрипотентных клеток, как правило, наблюдается даже после дифференцировки в окончательной энтодермы. Эти остаточные клетки могут ухудшить или вниз по течению дифференциацию дальнейшего ана.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Умелое техническая помощь Jasmin Kresse выражает искреннюю признательность.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Hues8 линия эмбриональных стволовых клеток человекаГарвардский факультет стволовых клеток и регенеративной биологииПодходящая клеточная линия для генерации энтодермы
Hes3 линия эмбриональных стволовых клеток человека ESCell InternationalПодходящая и надежная клеточная линия для генерации энтодермы
mTeSR1Stemcell Technologies5850ESC питательная среда
FCSBiowestS1860
Advanced RPMI 1640Life Technologies12633012
CD184 (CXCR4)-APC, человеческийMiltenyi Biotec130-098-357
анти-APC MicroBeadsMiltenyi Biotec130-090-855 
Сепаратор OctoMACSMiltenyi Biotec130-042-109магнитное поле
Y-27632Selleck ChemicalsS1049Ингибитор ROCK
CHIR-99021Tocris Bioscience4423
Активин АPeprotech120-14
Реагент для щадящей диссоциации клетокStemcell Technologies7174Без ферментов раствор для прохождения, альтернатива: Trypsin/EDTA
Matrigel*Corning354277матрицу базальной мембраны
* растворить и хранить в аликвотах при -80 °°; C, как указано в руководстве для поставщиков. После использования разморозьте на льду, разведите в 25 мл ледяного нокаута DMEM/F-12.
Добавьте по 1 мл в каждую лунку 6-луночного планшета и выдерживайте в течение 45 минут при комнатной температуре.
Извлеките матригель и используйте немедленно.
MS КолонкиMiltenyi Biotec30-042-201
MACS СепараторMiltenyi Biotec130-042-302
Human FOXA2 FW
gggagcggtgaagatgga		Life TechnologiesNA
Human FOXA2 REV
tcatgttgctcacggaggta		Life Technologies
Human GSC FW
gaggagaaagtggaggtctggtt		Life Технологии
Human GSC REV
ctctgatgaggaccgctctg		Life Technologies
SOX17 TaqMan анализApplied BiosystemsHs00751752_s1
человека SOX7 FW
gatgctgggaaagtcgtggaagg		Life Technologies
Human SOX7 REV
tgcgcggccggggtacttgtag		Life Technologies
Человек POU5F1 FW
cttgctgcagaagtgggtggagg		Life Technologies Человек
POU5F1 REV
ctgcagtgggtggttcgggca		Life Technologies
Человек Nanog FW
ccgagggcagacatcc		Life Technologies
Человек Nanog REV
ccatccactgccacatcttct		Life Technologies Человек
TBP FW
caa cag cct gcc acc tta cgc tc		Life Technologies
Human TBP REV
agg ctg tgg ggt cag tcc agt g		Life Technologies
Human TUBA1A FW
ggc agt gtt gtt tgt aga ctt gga acc c		Life Technologies
Human TUBA1A REV
tgt gat aag ttg ctc agg gtg gaa g		Life Technologies
Human G6PD FW
agg ccg tca cca aga aca ttc a		Life Technologies
Human G6PD REV
cga tga tga tgc ggt tcc agc cta t 		Life Technologies
Anti-SOX2Santa Cruz Biotechnologysc-17320
Anti-FOXA2MerckMillipore07-633
Anti-SOX17R& D СистемыAF1924

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sharma, A., Li, G., Rajarajan, K., Hamaguchi, R., Burridge, P. W., Wu, S. M. Derivation of Highly Purified Cardiomyocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Small Molecule-modulated Differentiation and Subsequent Glucose Starvation. J Vis Exp. (97), (2015).
  2. Sgodda, M., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Endoderm Cell PurificationHuman Embryonic Stem CellsCXCR4 Positive CellsMagnetic Bead SeparationDefinitive Endoderm DifferentiationFlow Cytometry AnalysisBasement Membrane CoatingROCK Inhibitor SupplementationCell Surface MarkerEndoderm Induction Medium

Related Articles