Выделение и проточной цитометрии анализ иммунных клеток из мозга ишемического Mouse

Краткое содержание

Воспаление играет центральную роль в патогенезе ишемического инсульта. Все больше данных свидетельствуют о том, что он действует как обоюдоострый меч, который усугубляет раннюю травму мозга, но также способствует последующему восстановлению. Этот протокол описывает выделение иммунных клеток из ишемизированного мозга и их последующее проточное цитометрическое фенотипирование.

Аннотация

Ишемический инсульт может инициировать надежную воспалительную реакцию, которая начинается в внутрисосудистого отсека и включает быструю активацию резидентных клеток мозга. Ключевой механизм этого воспалительного ответа является миграция циркулирующих иммунных клеток к ишемии мозга при посредничестве выпуска хемокинов и повышенной экспрессии молекул эндотелиальной адгезии. Мозговые-вторжение лейкоциты известный вклад в ранней стадии вторичного ишемического повреждения, но их значение для прекращения воспаления и последующего ремонта мозга лишь недавно было замечено.

Здесь, простой протокол для эффективного выделения клеток иммунной от ишемической мозга мыши предусмотрен. После transcardial перфузии, полушарий мозга расчленены и механически диссоциированных. Переваривание ферментом с Liberase следуют градиента плотности (например, перколлом) центрифугирования для удаления миелина и клеточного дебриса. Одно из главных преимуществ этой протокола IS процедура градиент плотности однослойного который не требует больших затрат времени подготовку градиентов и может быть надежно выполнена. Подход дает высокую воспроизводимость подсчитанных клеток на полушарии головного мозга и позволяет для измерения несколько проточной цитометрии панелей в одной биологической репликации. Фенотипическая характеристика и количественное определение мозговых вторжения лейкоцитов после экспериментального инсульта может способствовать лучшему пониманию их многогранных ролей в ишемическом повреждении и ремонта.

Введение

Церебральный инсульт вызывает устойчивый воспалительную реакцию, которая начинается быстро после прекращения местного кровотока и включает практически все части иммунной системы. Один важный признак этой воспалительной реакции является приурочен приток иммунных клеток в мозг, который приводится в действие активации эндотелиальных клеток головного мозга, существенной секреции хемокинов и повышенных симпатической нервной ^1-3. Инфильтрация воспалительных клеток Ранее считалось вредным при ишемическом инсульте, однако, несколько клинических наблюдений, предназначенные для разбора блокировать лейкоцитов EGRESS в мозг не способны индуцировать измеримую клиническую пользу ^4. Совсем недавно, стало очевидно, что из моноцитов клетки изначально вовлеченные в прогрессирования ишемического повреждения ⁵ также может играть ключевую роль для разрешения воспаления и последующего восстановления тканей ^6.

Благодаря идентификации фенотипических и functiнальных неоднородность моноцитов и макрофагов, знание о роли мононуклеарных фагоцитов в развитии и разрешении воспаления значительно расширен. У мышей, циркулирующие моноциты могут быть классифицированы на по меньшей мере двух функционально различных подмножеств в зависимости от их поверхностной экспрессии лимфоцитов антиген 6 комплекса (Ly-6C) ^7. В то время как Ly-6C ^{высокие'inflammatory} monocytes' были четко показано, что важно для контроля бактериальных инфекций ^8, их роль в стерильной травмы является более спорным. В ишемического инсульта, селективный абляция CCR2 + Ly-6С ^{высоких} моноцитов в результате геморрагического инфаркта трансформации ^6. Тем не менее, тот же экспериментальный подход улучшилось острый инвалидность после внутримозгового кровоизлияния ^9. Кроме того, различные подмножества Т-клеток, как полагают, оказывают либо вредным ¹⁰ или защитных действий ^{11 в} ишемической мозговой травмой, однако, данные controversiаль ^12,13 и требует дальнейшего исследования. Учитывая эту возрастающую сложность, становится ясно, что глубокое знание о роли разнообразных иммунных клеток в ишемическом повреждении и ремонта имеет решающее значение для перевода экспериментальные данные в терапии, направленных воспаление после инсульта.

На сегодняшний день наиболее мощным инструментом для анализа клеточных иммунных ответов является полихроматическая проточной цитометрии. Это позволяет выявлять и количественно различных подмножеств иммунных клеток в месте воспаления без необходимости смещения системы путем маркировки в естественных или генетических манипуляций ^14. Одновременное окрашивание маркеров клеточной поверхности с антителами против внутриклеточных цитокинов ¹⁵ или транскрипционных факторов ¹⁶ дополнительно содержит информацию о функциональном состоянии отдельных, фенотипически выявленных клеток. Как один большой недостаток, одноклеточные суспензии требуются для проточной цитометрии анализах и, таким образом информация о локомотивзация из клеточных инфильтратов теряется. Тем не менее, в то время как гистологическое идеально, чтобы получить пространственную информацию, оно ограничено количеством антител, которые могут быть использованы за один раз, чтобы охарактеризовать подтипы иммунные клетки в определенной ткани. Сегодня комбинация присутствии и в отсутствие различных поверхностных маркеров необходим для однозначной идентификации редких подмножества иммунных клеток, особенно отчетливые клеточные популяции моноцитов во время воспаления ^17.

Здесь мы описываем эффективный протокол, чтобы изолировать большое число лейкоцитов из постишемический мозга мыши, используя простой однослойный градиент плотности. Полученные клеточные суспензии могут быть либо анализировали многомерного проточной цитометрии или дополнительно обогащен сортировки проточной цитометрии или иммуномагнитного отбора на выполнение сугубо специфические нижестоящие анализы. Способ детали transcardial перфузии, удаление полушарий головного мозга, диссоциация мозговой ткани в отдельных клеток SUSPensions, центрифугирования в градиенте плотности для удаления миелина, а также окрашивание антитела для проточной цитометрии анализа.

Протокол

Все эксперименты на животных должны соответствовать согласно стандартам для ухода за животными (например., Руководство по уходу и использованию лабораторных животных опубликованных Национальными Институтами Здоровья, публикации NIH No. 85-23, пересмотренная 1996) и должны быть одобрены соответствующим государственным органом.

1. Подготовка реагентов

1. Переваривание буфера (1 мл на полусфере): Растворить стандартизированный смесь очищенных пищеварительных ферментов, например, Liberase с низкой концентрацией термолизин (TL) до концентрации 2U / мл в Hanks Balanced Salt Solution (HBSS), содержащего кальций (Ca) и магния (Mg)
2. Промывочный буфер с ДНКазой: Растворить ДНКазы I до концентрации 666U / мл в HBSS (Са / Mg свободный), содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки (FCS)
3. Промывочным буфером без ДНКазы: HBSS (Са / Mg свободный), содержащий 10% FCS
4. Плотность градиент среда (5 мл на полушарии): подготовить фондовый изотонический градиент плотности0; средний (SIP; 100%) путем смешивания девяти частей градиента плотности среды с одной стороны 1,5 М хлорида натрия. Развести SIP к плотности 25% путем добавления (свободный Ca / Mg) соответствующий объем HBSS, содержащего 3% FCS
5. Проточной цитометрии (FC) буфер: Подготовка фосфатно-солевом буферном (PBS), содержащем 3% FCS

2. Переходный средней мозговой артерии Окклюзия

Примечание: Переходный окклюзия средней мозговой артерии (МСАО) с помощью внутрипросветного техники шовного проводили, как описано ранее ¹⁸ в 12-ти недельных самцов мышей C57BL / 6.

1. Вкратце, обезболить мышей с 2,0% изофлуран в 100% кислорода. Поддерживать температуру тела на 36,5 ° С ± 0,5 ° C с помощью нагревательного устройства обратной связи контролируемых.
2. После перевязки общей сонной артерии и наружной сонной артерии, ввести стандартизированную мононити покрытием кремния резиновый в общей сонной артерии и продвигать его в начало координат срединной Cerebral артерии.
3. Через 45 мин снять нить, чтобы позволить реперфузии. В ложнооперированными животных, немедленно вывести нить после окклюзии средней мозговой артерии, чтобы избежать ишемии.

3. Transcardial перфузии и мозг Препарирование

1. Подготовьте перистальтического насоса перфузии путем погружения одного конца трубки в ледяную HBSS (Са / Mg свободный). Устранить тупой 23 г иглу к другому концу перфузии трубки и включите насос, чтобы полностью заполнить трубопровод с HBSS (Са / Mg свободный).
2. Глубоко обезболить мышь с 4% изофлуран и эвтаназии путем ингаляции _{СО 2.}
3. Поместите мыши дорсально на рассечение борту встроенные в пластиковый лоток. Распространение передних и задних лап как можно шире и исправить их на рассечение борту с 20 г хвои.
4. Захватите кожу с брюшка с прямым 1 Х 2 зубов щипцами и использовать острые диафрагмой ножницы сделать боковой надрез через покровы и брюшную стенку и подвергатьПечень.
5. Поднимите грудины и надрезать диафрагму с тупым лезвием острых / тупыми ириса ножницами. Продолжить, чтобы сократить боковой грудную клетку с обеих сторон в caudocranial направлении. Будьте осторожны, чтобы не повредить легкие, сердце и грудной артерии.
6. Поднимите кожный лоскут с тупым пинцетом и закрепить его на вскрытии борту. Используйте тупым концом щипцов и ножниц тщательно отделить сердце от соединительной ткани.
7. Удерживая сердца с тупым концом щипцов и вставьте кончик тупой 23 G иглы с прикрепленным перфузии трубки в верхушке левого желудочка. Примечание: Не вводить иглу слишком далеко в левый желудочек, чтобы избежать травм межжелудочковой перегородки. При необходимости, исправить канюли в месте с прямыми острыми щипцами.
8. Надрезать правое предсердие с острыми ножницами ириса и немедленно включить насос (скорость потока: 8 - 10 мл / мин).
9. Продолжить перфузии до печень не показан светлый цвет кофе (~ 30 мл HBSS). На протяженииперфузии, тщательно избегать любых образования пузырьков воздуха в трубки.
10. Обезглавьте мышь с прямыми хирургическими ножницами прямо за черепом. Используйте диафрагмы ножницы, чтобы сделать срединный разрез кожи головы, чтобы подвергать черепа.
11. Поместите один кончик острыми ножницами ириса в затылочного отверстия и нарезать в боковом направлении черепа. Повторите для другой стороны.
12. Используйте острые ножницы радужной оболочки, чтобы аккуратно вырезать из того же полости до средней линии к носу. Старайтесь, чтобы конец ножниц в поверхностных, насколько это возможно, чтобы избежать травм головного мозга.
13. Используйте тонкий пинцет, чтобы аккуратно очистить кости черепа от каждого полушария мозга. Примечание: инфарктом ткань может придерживаться мозговых оболочек или черепа; убедитесь, чтобы не потерять ткани мозга из неосторожном вскрытии
14. Поднимите мозг с помощью шпателя и используйте острые диафрагмой ножницы тщательно анализировать черепных нервных волокон, которые фиксируют его к черепу. Поместите мозг в 15 мл пробирку, наполненную 10 мл HBSS (+ Ca / Mg) и удерживать ее Shortly на льду.

4. Разобщенность мозговой ткани до одноклеточных суспензий

1. Осторожно снимите ствол мозга и мозжечок с чистой бритвой. Используйте чистую лезвие, чтобы hemisect мозг и разрезать каждую полушарие вдоль фронтальной плоскости в трех частей примерно одинакового размера.
2. Фарш рассеченные ткани каждом полушарии через клеточный фильтр 100 мкм с использованием конец плунжера 5 мл шприца. Непрерывно промыть фильтр клеток с ледяной HBSS (+ Ca / Mg). Хранить гомогенизированных образцов на льду.
3. Центрифуга при 286 мкг в и 4 ° С в течение 5 мин, тщательно отбросить супернатант. Ресуспендируют осадок в 1 мл буфера пищеварения и передавать суспензии в 2 мл пробирку. Инкубируйте суспензии при медленном непрерывном вращении при 37 ° С в течение 1 ч.
4. Сито клеточную суспензию через клеточный фильтр 70 мкм и тщательно промыть 3 мл промывочного буфера, содержащего ДНКазу затем 15 мл ДНКазы, свободной промывочного буфера, Центрифуга при 286 мкг в и 18 ° С в течение 5 мин и отбросить супернатант. Примечание: Примечание: Использование ДНКазы устраняет слизь ДНК, вызванное лизиса клеток, которые могли бы привести к агрегации клеток ущерба выживаемость клеток.

5. центрифугирования в градиенте плотности для удаления миелина и остатков клеток

1. Осадок клеток Ресуспендируют в 5 мл 25% градиенте плотности среды и пипеткой суспензию до 15 мл пробирку. Тщательно перемешать путем многократного и осторожно пипеткой избегая образования пузырьков. Примечание: в градиенте плотности среду следует использовать при КТ, чтобы предотвратить слипание клеток.
2. Центрифуга при 521 мкг в и 18 ° С в течение 20 мин. Используйте низкую профиль ускорения ротора и позволяют ротор, чтобы остановить без тормоза. Аккуратно снимите трубки из центрифуги без встряхивания. Тщательно аспирата миелина пальто и супернатант при сохранении клеточный осадок на дне пробирки. Примечание: Убедитесь, чтобы удалить весь миелина пальто, как любые остатки будут impaiг анализа методом проточной цитометрии.
3. Ресуспендируют осадок в 10 мл ДНКазы буфера для промывки и пипеткой суспензию до нового 15 мл пробирку. Примечание: Эта стадия промывки имеет решающее значение, так как достаточное удаление градиентной среде плотности значительно способствует увеличению количества и качества конечного клеточного образца.
4. Центрифуга снова при 286 х г и 10 ° С в течение 5 мин и отбросить супернатант. Ресуспендируют клеток в 100 мкл холодного буфера для промывки и определить количество клеток и жизнеспособность путем трипанового синего в гемоцитометра. Образцы хранят при температуре 4 ° С и дальнейший процесс их быстро.

6. Антитела Окрашивание для анализа проточной цитометрии

1. До маркировки антител, инкубировать клеточную суспензию при 4 ° С в течение 10 мин с анти-мышиным CD16 / CD32 блокирующего реагента FC-рецептор (конечной концентрации 2,5 мкг / мл, коэффициент разбавления 1: 200), чтобы предотвратить неспецифическое связывание.
2. Добавить флуорофором-конъюгированные первичных антител в аppropriate концентрация (как указано в таблице 1) к клеточной суспензии и инкубировать при температуре 4 ° С в течение 20 мин в темноте. Примечание: Контрольные образцы не окрашивали с первичными антителами, но не подвергнутые дальнейшей обработке тем же самым.
3. Промыть клетки с 2 мл FC буфера и центрифуге при 350 мкг в 10 ° С в течение 7 min.Carefully аспирации осадок клеток супернатант и ресуспендируют в 200 мкл буфера FC. Образцы магазин временно на 4 ° С в темноте до анализа методом проточной цитометрии.

7. Абсолютная Количественное путем подсчета шариков

1. И наоборот пипетки 40 мкл буфера FC и 10 мкл клеточной суспензии в счетной трубке, содержащей известное количество флуоресцентных шариков. Примечание: Обратите внимание, что пипетки откалиброван для доставки ровно 10 мкл образца, последующим расчетом количества лейкоцитов относится к этому объему.
2. Инкубируйте клеточной суспензии с FITC-меченного CD45 антитела (конечная концентрация5 мкг / мл, коэффициент разбавления 1: 100) при 4 ° С в течение 20 мин в темноте.
3. И наоборот заполнить подсчета трубку с 200 мкл буфера FC без стадии промывки и непосредственно записывать CD45 + клеток в проточном цитометре.

8. проточной цитометрии Приобретение

Примечание: Для анализа предлагаемого панель антител, соответствующая цитометр быть оснащен синим (488 нм), красный (635 нм) и фиалки (405 нм) лазера и фильтров для FITC, PE, PerCP Cy5.5, PECy7, APC-Cy7 и AmCyan.

1. Регулировка вперед (FSC) и в сторону (SSC) разброс помощью неокрашенных клеток из ишемической полушарии. Различают дублеты из одиночных клеток в дот график, показывающий площадь и высоту FSC.
2. Показать все отдельные клетки в одной параметров гистограмм для каждого канала флуоресценции, используемой и регулировать ФЭУ (ФЭУ) напряжения, чтобы отдельные клетки выводятся в левой части гистограммы.
3. Используйте CD45-FITC одногоокрашенных образец для проверки разброса и PMT параметры клеток, представляющих интерес с backgating ^{высокие} иммунные клетки CD45 в каждой гистограммы и диаграммы рассеяния. Примечание: Адаптация PMT напряжений FITC, так что CD45 отрицательными, промежуточное соединение (INT) и высокие экспрессирующие клетки могут быть дифференцированы друг от друга.
4. Используйте антител захватили компенсации бусы выполнять компенсацию многоцветной. Установить ворота для микроглии (CD45 ^INT) и лейкоцитов (CD45 ^{высокий),} а затем определить субпопуляций лейкоцитов в соответствии со стратегией литниковой, изображенного на рисунке 1.

Результаты

Церебральной ишемии была инициирована в 12-недель самцов мышей C57BL / 6 с помощью временной окклюзии нитей левой средней мозговой артерии (МСАО). Для мнимого операции нить была вставлена ​​в закупоривать левой средней мозговой артерии и извлекают сразу, чтобы позволить мгновенную реперфузии. Важно отметить, что сотовая нейровоспаления существенно отличается среди широко применяемых моделей инсульта ^19. Это должно иметь в виду, особенно при экстраполяции результатов исследований на животных к гетерогенной патофизиологии человека инсульта.

Мышей умерщвляли через 24 ч после МСАО анализировать ранний вторжение иммунных клеток к ишемическому мозга. Количество клеток, полученных из ишемической полушарии (MCAO IPSI; 0,95 ± 0,25 х 10E6) после центрифугирования в градиенте плотности были сопоставимы с таковыми из контралатерального полушария (МСАО противопоказания; 1,09 ± 0,30 х 10E6) и ипсилатеральнаяполушарие ложнооперированными мышей (мнимого IPSI; 1,12 ± 0,18 х 10E6, односторонний ANOVA, р = 0,524). Жизнеспособность изолированных клеток, измеренных трипанового синего был высоким и существенно не отличалась между группами (фиктивных 96.85 ± 0.60%, МСАО против 97,12 ± 1,18%, МСАО Ипси 95.68 ± 2.04%, с односторонним ANOVA, р = 0,253 ).

Состав мозга проникнуть через 24 ч после МСАО определяли методом проточной цитометрии. Рисунок 1 иллюстрирует стратегию стробирования схематически (а) и в представительном инсульта животного (B). Мозговые-Лейкоциты проникают были определены как CD45 ^{высоких} клеток, которые могут быть дифференцированы от CD45 ^INT микроглии. В ^{большой} популяции CD45, полиморфно нейтрофилы (ПМН) были определены выражением Ly-6G, в то время как Т-лимфоциты были обозначены, как CD45 ^{высокой} CD3 + клеток. Остальные CD45 ^{высокие} Затем клетки различаютред CD19 (В-лимфоциты) и выражения CD11b. CD11b + фракция далее подразделена на Ли-6C ^{высокой} `воспалительного monocytes` и ^низкой населения Ly-6C, который охватывает моноциты, дендритные клетки (ДК) и макрофаги.

В острой стадии инсульта, миелоидной иммунные клетки доминируют мозг проникнуть ^3,20. Нейтрофилы проникают в мозг быстро после окклюзии сосуда и способствовать экстравазации воспалительных моноцитов ^21. 2А показывает процентное увеличение Ly6-G + нейтрофилов в ишемической полушарие 24 ч после МСАО по сравнению с контралатеральной полушарии и мнимого хирургии. В отличие от этого, доля CD3 + Т-клеток в ишемической полушарии (относительно) ниже, чем в здоровом мозге. В популяции CD11b +, ишемия головного мозга смещает баланс в сторону сильного перевеса Ly-6С ^{высоких} воспалительных моноцитов (рис2B).

В дополнение к относительной распределений, считая трубки были использованы для определения абсолютного числа подмножеств иммунных клеток в образцах на основе CD45 позитивных событий (рисунок 3). Подсчет пробки содержат лиофилизированную лепешку, который высвобождает известное число флуоресцентных шариков. Абсолютное количество положительных клеток в образце может быть определена путем соотнесения клеточных событий, чтобы шарик события. Чтобы рассчитать количество CD45 ^{высоких} лейкоцитов в полушарии была использована следующая формула: CD45 ^{высокие} клеток на полушарии = (CD45 ^{высокие} события х общее подсчета бисер / образец шарик события) х (объем всего подвеска (100 мкл) / объем пробы (10 мкл )). 24 ч после МСАО, всего лейкоциты в инфаркт полушарии были значительно увеличены по сравнению с контралатеральной полушарии и мнимого хирургии (рис 3D, односторонний ANOVA, р = 0,0004). Графы ди stinct подмножества иммунных клеток (ПМН, Т-клетки, В-клетки, Ly-6C ^{высокого} и Ly-6C ^низкие моноциты) может быть легко вычислена путем умножения их относительную частоту, с общей CD45 ^{высокой} лейкоцитов числа соответствующего образца.

Рисунок 1. Память Стратегия проточной цитометрии. (А) Схематическое изображение стратегии селекции. (Б) показывает проточной цитометрии анализ лейкоцитов, выделенных из репрезентативной мозга мыши 24 ч после окклюзии средней мозговой артерии. FSC вперед разброс, ПМН полиморфоядерные нейтрофилы, CDC классические дендритные клетки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.

ftp_upload / 53658 / 53658fig2.jpg "/>
Рисунок 2. Дифференцирование иммунных клеток подмножеств. Относительное распределение LY-6G + -neutrophils (A), CD3 + Т-клеток (A) и моноцитов подмножества идентифицированные с помощью дифференциальной экспрессии LY-6C (б) в ипсилатеральной (IPSI) и контралатеральной ( противопоказания) полушарие 24 ч после окклюзии средней мозговой артерии (MCAO) или соответствующего мнимого хирургии. Процент каждой популяции указывается в воротах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.

Рисунок 3. Количественная оценка мозга лейкоцитов путем подсчета бисер. (А) показывает высокую дважды положительный шарик ворота. В популяции одной клетки (Б) CD45 ^INT микроглии может быть дифференцирована от CD45 ^{высоких} лейкоцитов (С). Для количественного, количество закрытых ^{высоких} событий CD45 нормализовалось к подсчитанных бортов событий. Отметим, что общее лейкоцитов (CD45 ^{высокий)} рассчитывает значительно увеличены в ипсилатеральной (ипси-) полушарии по сравнению с контралатеральной (контр) полушарие и обман хирургии 24 ч после окклюзии средней мозговой артерии (MCAO). ** Р <0,01, *** р <0,001 односторонним ANOVA и Tukey`s постфактум тест множественных сравнений. п = 4 - 6 в группе. FSC вперед разброс. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.

флюорохром	FITC	ЧП	PerCP	PC7		V500
			(Cy5.5)
антиген	CD45.2	CD3	Ly-6G	CD19	Ly-6C	CD11b
Конечная концентрация [мкг / мл]	5	1	0,2	0,2	1	1
коэффициент разрежения	1/100	1/200	1/1 000	1/1 000	1/200	1/200
клон	104	145-2С11	1A8	6D5	AL-21	М1 / 70

Таблица 1. Основные антитела Коктейль для иммунных клеток идентификации в ишемической мозга.

Обсуждение

Здесь мы описываем простой и эффективный способ выделения лейкоцитов из мышиного мозга после экспериментального инсульта. Подход надежно дает высокую воспроизводимость подсчитанных клеток на мозговой полушарии, позволяющей измерять различные панели потоков в одной биологической репликации.

По-видимому, неполное удаление крови, включая иммунные клетки приведет к искаженному представлению о фактическом количестве воспалительных клеток, которые вошли в ишемический мозг. Таким образом, при использовании этого протокола обратить особое внимание на тщательное transcardial перфузии, чтобы предотвратить загрязнение проникли иммунных клеток с невоспалительными циркулирующих лейкоцитов. Из опыта, использование тупых игл для левой пункции желудочков снижает риск травмы межжелудочковой перегородки, которые в обход перфузии кровообращения. Появление перфузионной жидкости из ноздрей является признаком того, что перфузии pressureis слишком высока, таким образом,недействительными дебиты> 10 мл / мин. Бледно к белому цвету ткани мозга указывает на хорошую перфузии во время розоватого цвета является признаком недостаточной перфузии.

Другим важным шагом этого протокола является эффективным диссоциация ткани мозга, который включает механическую фрагментацию, а также ферментативного расщепления. Мясорубки ткани через ячейки фильтра является критическим, чтобы обеспечить улучшенную эффективность протеаз. Однако, когда гомогенизацией ткани, во избежание чрезмерного давления в мононуклеарных фагоцитов очень восприимчивы к автолиза ^22. Для ферментативного расщепления Liberase TL рекомендуется которых представляет собой смесь высокоочищенной коллагеназы I и II, который содержит низкие концентрации нейтрального термолизина протеазы. Прямое сравнение с ранее описанными протоколов изоляции ^14,22,23 выявленных значительно более высокое извлечение жизнеспособных клеток путем обработки Liberase TL (км неопубликованные данные). По сравнению с коллагеназы, которые часто используютд для выделения иммунных клеток из мозга, Liberase TL содержит незначительные уровни эндотоксина. Это имеет особое значение, если клетки сортируются по ходу анализа, поскольку высокие уровни эндотоксина может изменить состояние активации иммунных клеток ²⁴ и серьезно ухудшить клеточной культуры результатов ^25. Другим недостатком традиционной коллагеназы это существенные различия от партии к партии в активности ферментов, которые ставят под угрозу воспроизводимости результатов и требует определения рабочей концентрации для каждой партии ^26.

Во взрослом мозге, удаление миелина путем центрифугирования в градиенте плотности является необходимым шагом для последующих приложений, таких как проточной цитометрии или дальнейших исследований по гена или экспрессии белка. Одно из главных преимуществ протокола является процедура плотность однослойного который не требует больших затрат времени подготовку градиентов. Кроме того, протокол разделения производит надежный результатS, даже если выполняется довольно неопытных экспериментаторов. Это лишено слоистых градиентов с плотностью близких друг к другу, что трудно пипетки, не нарушая интерфейс между ними.

На основе экспрессии поверхностного маркера CD45, протокол дает три основных категории клеток в ишемизированной мозга. Подавляющее большинство клеток принадлежат к отрицательному населения CD45, который состоит из нервных клеток, астроглию, эпендимные и эндотелиальных клеток. Их присутствие большого приписывается градиента плотности однослойного которые в первую очередь направлена ​​на эффективное миелина и вывоза мусора. Кроме того, CD45 ^INT населения, представляющая резидента микроглии ²⁷ могут быть дифференцированы от ^{высокой} населения CD45 которое в основном состоит проникновения Гематогенное лейкоциты. Тем не менее, следует отметить, что активированные микроглии может принять фенотип и функцию миелоидных клеток крови новорожденного. Таким образом, только применение усложняемметоды, такие как D парабиозе ^28, костный мозг химеры ^{29 или} анализ отображение судьба ³⁰ позволяют четкое различие между этими двумя популяциями при воспалении.

Анализ данных в проточной цитометрии часто ограничивается процентное распределение конкретных клеточных популяций. Тем не менее, при сравнении инфаркт полушарие не-инфарктом ткани головного мозга эта информация может ввести в заблуждение, потому что оно не считает общее рассчитывает мозга лейкоцитов, которые изменены ишемического повреждения. Таким образом, чтобы нарисовать полную картину о величине и фенотипа воспалительных инфильтратов после инсульта относительное распределение подмножеств иммунных клеток должны быть дополнены абсолютное количество клеток. При использовании микрошариков, как описано в данном протоколе, пипетки из точного объема пробы абсолютно обязательным для получения достоверных результатов. Кроме того, обратная пипетки настоятельно рекомендуется, чтобы избежать образования пены в счетной трубки. Возникающие воздушные пузыриснизит ожидаемый объем микросфер и, следовательно, привести к переоценке абсолютного количества лейкоцитов ^{высокой} CD45 в образце.

Таким образом, этот протокол обеспечивает простой и надежный подход, чтобы изолировать иммунные клетки из мозга. Это может служить ценным инструментом рассекать сложность воспалительной реакции на ишемический инсульт. Будущие приложения включают исследования по нестационарной роли моноцитов подмножеств в распространении и разрешением ишемической воспаления мозга. Аналогичным образом, роль адаптивной иммунной системы после инсульта мало изучен. Проточной цитометрии анализ субпопуляций Т-клеток, идентифицированных по выражению подмножества конкретных факторов транскрипции или цитокинов в месте может помочь прояснить их влияние на долгосрочное восстановление после инсульта и тем самым открыть перспективных направлений для развития новых подходов к лечению.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Перистальтический насос Peri-Star Pro, 4-канальный	прецизионный прибор	World PERIPRO-4LS
Heracell 240i CO2-инкубатор	Thermo Scientific
MACSmix Tube Rotator	Miltenyi Biotec GmbH
Heraeus Multifuge 3SR+	Thermo Scientific
FACS Canto II	Becton Dickinson
Isoflurane	Abbott	4831850
буферизованный раствор соли Хэнка (HBSS)	Gibco/Life Technologies GmbH	14175-129
HBSS с кальцием/магнием	Gibco/Life Technologies GmbH	24020-091
Liberase TL	Roche Diagnostics GmbH	5401020001
Percoll Plus	GE Healthcare Europe GmbH	17-5445-01
Фетальная бычья сыворотка	PAN Biotech	3302-P101003
Trypan blue	Gibco/Life Technologies GmbH	15250-061
Trucount	BD Biosciences	340334
Фосфатный буферный раствор	Biochrom AG	L 182-10
DNAse I	Roche Diagnostics GmbH	11284932001
CD11b Horizon V500	BD Biosciences	562128
CD16/CD32	eBioscience	14-0161
CD45.2 FITC	eBioscience	11-0454
CD3 PE	Biolegend	100307
CD19 PE-Cy7	Biolegend	115519
Ly6C APC-Cy7	BD Biosciences	560596
Ly6G PerCP-Cy5.5	BD Biosciences	560602
Силиконовая трубка, 1 м	Мировые прецизионные инструменты	503022
Тонкие ножницы для радужной оболочки острые	Тонкие научные инструменты	14094-11
Хирургические ножницы	Тонкие научные инструменты	14130-17
Тонкие ножницы для радужной оболочки острые/тупые	Тонкие научные инструменты	14028-10
Прямые щипцы 1 x 2 зуба	Тонкие научные инструменты	11021-14
Тупые щипцы	Fine Science Tools	11008-13
5 мл поршень шприца	Carl Roth GmbH (Braun)	EP96.1
Клеточный фильтр, 100 &; m	Д-р И. Шуберт, BD	2360-00
Omnican Fine дозировочный шприц 1 мл	Braun	TBD
Cell site, 70 &; m	Greiner Bio-One GmbH	542 070
FACS Tubes	BD Bioscience GmbH	352052
серологические пипетки, 10 мл	Greiner Bio-One GmbH	607180
серологические пипетки, 10 мл	Sarstedt AG& Серологические	861,254,025
Greiner Bio-One GmbH	760180		25 мл
, серологические	Greiner Bio-One GmbH	606180
, серологические пипетки 25 мл	Sarstedt AG& Co	861,685,020
серологические пипетки, 5 мл	Sarstedt AG& co	861 253 025
чаевых, 0,1 - 10 & микро; l	Corning B.V.Life Sciences	4840
Советы, 100 - 1,000 &микро; l	Greiner Bio-One GmbH	740290
Наконечники, 10 - 200 & микро; l	Greiner Bio-One GmbH	739296
Реакционные пробирки 1,5 мл	Greiner Bio-One GmbH	616201
Реакционные пробирки 2 мл	Greiner Bio-One GmbH	623201
Бактериологическая чашка Петри, 94 x 16 мм	Greiner Bio-One GmbH	633180
Falcon 15 мл	Greiner Bio-One GmbH	188271
Falcon 50 мл	VWR International GmbH (BD)	734-0448
Гемоцитометр Neubauer	Biochrom AG	PDHC-N01
лезвие бритвы	Carl Roth GmbH	CK07.1