Методическая статья

Выделение и проточной цитометрии анализ глиомы инфильтрирующие мононуклеарных клеток периферической крови

15.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/53676

⸱

28 ноября 2015 г.

 ,  , 
1Department of Neurosurgery, University of Michigan, 2Department of Cell and Developmental Biology, University of Michigan

В этой статье

Краткое содержание

Представленные здесь простой метод для изоляции и потока цитометрии анализа глиомы инфильтрирующие мононуклеарных клеток периферической крови, что дает время зависит от количественных данных о количестве и состоянии активации иммунных клеток, входящих в ранней микросреду опухоли головного мозга.

Аннотация

В нашей лаборатории недавно показали, что естественные киллеры (NK) клетки способны ликвидации ортотопически имплантированный GL26 мыши и крысы ЦНС 1 злокачественных глиом вскоре после внутричерепной приживления, если раковые клетки оказываются несовершенными в их экспрессии β-галактозид лектин галектина -1 (Gal-1). Более поздние работы в настоящее время показывает, что население Gr-1 + / CD11b + миелоидных клеток имеет решающее значение для этой цели. Чтобы лучше понять механизмы, с помощью которых НК и миелоидных клеток сотрудничать, чтобы придать гал-1-дефицитных отторжение опухоли мы разработали комплексную протокол для выделения и анализа глиомы инфильтрирующие мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС). Метод демонстрируется здесь, сравнивая МКПК проникновение в опухолевую микросреду Гал-1-экспрессирующих GL26 глиомы с тех, кто оказался Гал-1-дефицитных помощью shRNA нокдаун. Протокол начинается с описания того, как к культуре и подготовить GL26 CEзаполняет для прививки в сингенной C57BL / 6J мозга мыши. Затем объясняет этапы в изоляции и потока цитометрии анализа глиомы инфильтрирующие МНПК от раннего микросреды опухоли головного мозга. Метод адаптируется к ряду в естественных экспериментальных конструкций, в которых требуется временные данные по иммунной инфильтрации в головном мозге. Метод чувствителен и высокой воспроизводимостью, а глиомы-проникновения РВМС могут быть выделены из внутричерепными опухолями, как только 24 ч после приживления опухоли с аналогичными количество клеток, наблюдаемых из точечных соответствует опухолей времени на протяжении независимых экспериментов. Один экспериментатор может выполнять способ лесозаготовок мозга течь цитометрический анализ глиомы инфильтрирующие МНПК в примерно 4-6 часов в зависимости от количества анализируемых образцов. Альтернативные модели глиомы и / или клеточно-специфические антитела обнаружения также могут быть использованы по усмотрению экспериментаторов "для оценки инфильтрации нескольких других ImmunТипы электронной клеток, представляющих интерес, без необходимости изменения в общей процедуре.

Введение

Глиомы представляют собой класс нейроэпителиальных рака головного мозга, вытекающих из трансформированной глии в центральной нервной системе (ЦНС). Из всех глиом, Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) класса IV глиомы, глиобластомы или (GBM), является наиболее распространенным и смертельный 1. GBM является весьма резистентны к текущей стандарт оказания медицинской помощи, которая состоит из удаления опухоли в максимально возможной степени с последующим излучением плюс сопутствующей и адъювантной химиотерапии темозоломидом 2. Эти смертоносные раки нести мрачный прогноз только 15-18 месяцев выживания с момента установления диагноза с только 5% больных, перенесших заболевание после 5 лет 3.

Наличие гематоэнцефалического барьера (ГЭБ), отсутствие профессиональных антиген-представляющих клеток (БТР), и ранее неизвестный наличие добросовестных лимфатических структур в мозге 4 привели к понятию GBM, как иммунной привилегированных. Тем не менее, многочисленные исследования в настоящее время шож, что эти рака мозга действительно порождают набор периферийных иммунных клеток, которые преимущественно миелоидной происхождения, которые включают моноциты, макрофаги, и миелоидных полученных клеток-супрессоров (MDSCs) 5. GBM также влияет на деятельность головного мозга резидентом микроглии стать про-онкогенные 6,7. Лимфоидных клеток, такие как CD8 + Т-клеток 8 и CD56 + натуральных киллеров 9 также присутствуют в опухоли микроокружения, но в гораздо меньшем количестве, факт считается, в связи с иммуносупрессивной функции спровоцированного глиомы, полученных факторов на ассоциированных с опухолью макрофаги ( ТАМ) 10. CD4 + T-клетки также присутствуют в GBM, но многое из этого населения также выражает CD25 и FoxP3, производители иммуносупрессивной T нормативной (T) клеток обл 11. Общая иммуносупрессивной состояние GBM завершается в продвижении иммунологической побега и опухолевой прогрессии 12.

Более глубокое понимание механизмов иммуносупрессии GBM имеет решающее значение для разработки эффективных иммунотерапевтических стратегий, направленных на стимулирование иммунной системы против опухоли. За последние 15 лет наша лаборатория работала, чтобы преодолеть механизмы мозга опухоли immunosuppresson в целях развития эффективных новых анти-GBM Immunotherapeutics 13-19. Кульминацией этой работы в настоящее время привело к клиническому испытанию, предназначенный для оценки комбинированного цитотоксические и иммунной стимулирующее терапевтическое для пациентов с впервые выявленным GBM (ClinicalTrials.gov Identifier: NCT01811992).

Наша последняя работа показывает, что GL26 мыши и крысы ЦНС 1 GBM клетки блокируют противоопухолевую НК клеток иммунного надзора по производству больших количеств β-галактозид лектина галектин-1 (Gal-1) 20. Это было продемонстрировано путем подавления экспрессии Gal-1 в клетках глиомы, используя shRNA-опосредованной генной нокдаун. В пробирке экспериментальTS показали, что Гал-1-дефицитных клеток глиомы распространение как правило, в культуре, но подверглись быстрому отказ вскоре после внутричерепного приживления сингенным C57BL / 6J или RAG1 - / - мышей, таким образом, установление независимости Т- или В- клеток на этом виде отказ опухоли. НК клеток immunodepletion с анти-асиало GM 1 анти-сыворотки или моноклональных антител NK1.1 привели к полному восстановлению внутричерепного Гал-1-дефицитных роста глиомы, устанавливающих роль NK-клеток в Гал-1-дефицитных отказа глиомы. Покажем теперь, что immunodepletion ГР-1 + / CD11b + миелоидной клетки достаточно, чтобы предотвратить гал-1-дефицитных отказ глиомы, несмотря на наличие NK клеток, таким образом, открывая незаменимым вспомогательную роль для миелоидных клеток в пособничестве в НК-опосредованной гал -1-дефицитных лизиса опухоли (неопубликованные данные). Этот неожиданный результат привел нас к разработке комплексной протокол для выделения и анализа мононуклеарных клеток периферической крови (МНПК), чтопроникнуть в микросреду опухоли мозга вскоре после внутричерепного приживления, чтобы мы могли лучше характеризуют иммунную инфильтрации события, которые предикатов гал-1-дефицитных отказ глиомы.

Метод демонстрируется здесь с помощью мыши GL26 глиомы клетки, которые конструктивно экспресс mCitrine флуоресцентный белок, называемый GL26-CIT, которые позволяют прямой визуализации опухолевых клеток с помощью флуоресцентной микроскопии 21. Эти клетки стереотаксически привиты в мозг сингенных C57BL / 6J и давали расти в течение 24, 48 или 72 ч до мыши эвтаназии. Глиомы инфильтрирующие РВМС затем выделяют и immunolabeled с использованием анти -CD45, -GR-1, -CD11b и -NK1.1 клеточной поверхности антитела вместе с внутриклеточной иммунноокрашивания для гранзима (GzmB). Это специфическое сочетание антител позволяет идентифицировать опухолевых инфильтрующих GR-1 + / CD11b-миелоидных клеток и NK1.1 +, NK клеток, клеточных типов имеем Вееп вовлечен в гал-1-дефицитных отторжение опухоли. Иммунная профиль инфильтрация гал-1-дефицитных GL26-чит глиомы, называемый здесь GL26-чит-gal1i, затем по сравнению с глиом, выражающих нормальные уровни Гал-1 под названием GL26-чит-НТ, которые содержат не- ориентации управления shRNA шпильку. Протокол начинается с описания о том, как культура GL26-Соч клеток глиомы в пробирке, которая сопровождается объяснением о том, как привить ортотопически эти клетки в стриатуме сингенным C57BL / 6J. Затем переходит перечислить этапы выделения и иммунноокрашивания глиомы инфильтрирующие МНПК для анализа потока цитометрии. Протокол заключает с объяснением стандартного анализа и графического представления.

Демонстрация показывает, что оба Гр-1 + / CD11b + миелоидных клеток и NK NK1.1 + клетки преимущественно накапливаются в гал-1-дефицитных опухолей головного мозга микросреды в 48ч имплантации опухоли, в результате которых помогает объяснить, почему эти опухоли быстро пройти полный лизис опухоли примерно 1 неделю после приживления опухоли 20. Способ может быть легко адаптирован к ряду различных естественных экспериментальных в конструкции, в которых требуется временные данные по иммунной инфильтрации в головном мозге. Один экспериментатор может выполнить протокол от уборки мозга течь цитометрический анализ глиомы инфильтрирующие МНПК примерно 4-6 часа в зависимости от количества анализируемых образцов. Способ также может быть объединена с экспериментов, направленных охарактеризовать профиль циркулирующего РВМС в мышей, несущих опухоли для сравнения с тем, что проникают в головной мозг, так, чтобы идентифицировать иммуносупрессии фенотипы частности, вызванные опухоли микроокружения. Применение этой и подобных методов должно способствовать лучшему пониманию факторов, участвующих в торговле периферийных иммунных клеток в опухоли микроокружения головного мозга.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Примечание: Пожалуйста, пересмотреть всю протокол до проведения экспериментов. Разрешение на использование позвоночных животных от соответствующей институциональной комитета по использованию и благосостояния животных должны быть получены до судебного разбирательства.

1. Подготовка опухолевых клеток для внутричерепных приживления

  1. Работа в класс II кабинете биологической безопасности следует начинать с подготовки GL26-чит-NT / gal1i культуры клеток путем дополнения 500 мл бутылку Игла в модификации Дульбекко (DMEM) с 10% стерильной фильтрацией тепла инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки (FBS ), 2 мМ L-глутамина, 100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина, 600 мкг / мл G418 сульфат (по выбору вектора экспрессии mCitrine) и 3 мкг / мл пуромицин дигидрохлорида (по выбору не- ориентации или гал-1-специфические shRNAs).
  2. Культура GL26-чит-НТ и / или GL26-чит-gal1i клетки (рис 1А и 1В ) В культуре ткани Шкафчик на 37 ° С и 5% СО 2 в течение 1-2 дней до процедуры приживления опухоли или до колбы достигают 50-80% слияния.
  3. В день операции, удалить среды для культивирования клеток из клеток глиомы с использованием 10 мл серологической пипеткой и пипетки пистолет и выбросить носитель в химическом стакане с отходами.
    1. Обратить колбу сверху стороной вниз и добавить 10 мл DPBS в надводной части колбы с помощью 10 мл серологические пипетки. Медленно переверните флягу, чтобы покрыть клетки в DPBS, то чаевые колбу вертикально и снимите и выбросьте DPBS в стакан с отходами.
  4. Добавить 3-4 мл немлекопитающих трипсина альтернативы в DPBS с ЭДТА (см список материалов для деталей) к каждому T75 тканевой культуральной колбы и поместить обратно в ткани культуры шкафу в течение 2-5 мин. Использование ярко-поле микроскопа, проверьте, что все клетки, отделившиеся от нижней поверхности до судебного разбирательства.
  5. Запрет furtheR ферментативную активность путем разбавления трипсина альтернативу с 6 мл DPBS. Пипетка вверх и вниз с помощью 10 мл пипетки серологические для полоскания нижнюю поверхность колбы и механически отделить клеточные агрегаты любых. Аспирируйте клетки и поместить в соответственно меченных 15 мл центрифужные пробирки. Спин клетки вниз на 550 мкг (макс RCF) в течение 5 мин при 4 ° С (рис 1c).
  6. Удалить супернатант и осторожно ресуспендируют клеток с 1 мл без карнозина DMEM. Убедитесь, что пипетки клетки вверх и вниз полностью с P-1000 микропипетки достичь суспензии отдельных клеток.
  7. Делают разбавление полученной суспензии клеток в 1,6 генерируемого 1:10, помещая 18 мкл без карнозина DMEM в 0,6 мл коническую полипропиленовую микропробирок с последующим добавлением 2 мкл суспензии клеток опухоли. Внесите вверх и вниз с помощью П-10 микропипетки для гомогенизации клетки тщательно.
  8. Добавить 10 мкл &# 160; разбавления 1:10 опухолевых клеток, генерируемого в 1,7 к 0,6 мл отдельных конической полипропиленовой микропробирку, а затем добавить 10 мкл трипанового синевы к трубе. Тщательно перемешайте с Р-10 микропипетки и добавить 10 мкл результате клетки опухоли / трипанового синего раствора под покровным стеклом расположен на вершине гемоцитометре будьте осторожны, чтобы не вводить пузырьков воздуха (рис 1D).
    1. Граф клеток с ярко-поле микроскопа с использованием цели 10X в зависимости от конкретного протокола, связанного с данной гемоцитометре. Обязательно фактором в 20-кратного разведения исходного суспензии опухолевых клеток, сделанные в ходе подготовки клеток для точной оценки клеток в исходной 1 мл аликвоты. Используйте следующую формулу для расчета общее количество клеток: клетки всего / мл = [((Σcells насчитал за квадрат) / # квадратов подсчитанных) х 20 (т.е. коэффициент разбавления) х 10000 клеток / мл].
  9. После Determining общее количество клеток для каждой клеточной линии, используемой в данном эксперименте, спина их вниз на 550 мкг (макс RCF) в течение 5 мин при 4 ° С. Удалить супернатант (ы) и ресуспендирования клеток с соответствующим объемом без карнозина DMEM с целью достижения целевой концентрации 3 х 10 4 клеток на 1 мкл для каждой клеточной линии в соответствии со следующей формулой: (Общее количество клеток / 30000).
  10. Поместите эквивалентный объем каждой клеточной линии в соответственно меченных 0,6 мл конических пробирках и полипропиленовых месте на льду (рис 1E). Будьте уверены, чтобы сохранить некоторые клетки, чтобы продолжить распространения каждой клеточной линии, если отдельные T75s ранее не заполняется.

2. Порядок стереотаксической приживления клеток глиомы в стриатуме C57BL / 6J

  1. Подготовка рабочих растворов хирургической анестезии, обезболивания, и анестезии разворота до операции следующим образом:
    1. Для кетамина / дексмедетомидина сurgical анестезии: удалить 1,4 мл из 10 мл флакон стерильного 0,9% инъекции NaCl и заменить 600 мкл 100 мг / мл маточного раствора гидрохлорида кетамина и 800 мкл 0,5 мг / мл маточного раствора гидрохлорида дексмедетомидина с получением смешанный рабочий раствор кетамина гидрохлорида из (6 мг / мл) и гидрохлорида (дексмедетомидина 0,04 мг / мл).
    2. Бупренорфина обезболивания: удалить 1 мл из 10 мл флакон стерильного 0,9% NaCl инъекции и заменить весь объем 1 мл одного 0,3 мг / мл гидрохлорида сток бупренорфин ампуле с получением 0,03 мг / мл рабочего раствора.
    3. Для Атипамезол разворота хирургической анестезии: удалить 1 мл из 10 мл флакон стерильного 0,9% NaCl инъекции и заменить 1 мл 5 мг / мл исходного раствора гидрохлорида Атипамезол с получением 0,5 мг / мл рабочего раствора.
  2. Работа в утвержденной место для выживания мыши сurgery, начинают путем установки в автоклаве или шарик стерилизовать хирургические инструменты и другие реагенты, как показано на (фиг.2А), то получить достаточное 8-10 недельных самок мышей C57BL / 6J (сингенных с GL26 глиомы), необходимое для исследования; обеспечения их постоянного доступа к пище и воде.
  3. Обезболить первую мышь с одной внутрибрюшинного (ф) инъекции рабочего раствора анестезии, предоставляя дозе 75 мг / кг кетамина и 0,5 мг / кг (примерно дексомедетомидина 250 мкл для 20 г мыши). Далее, дать 5 мг / кг подкожно (SC) инъекции карпрофена (примерно 100 мкл для 20 г мыши). Убедитесь, что мышь не реагируют на носок и хвост щепотки до перехода.
  4. Использование хирургических ножницы, брить шерсть от черепа. Применить повидон-йода антисептический раствор для бритой области, скраб с 70% изопропиловый спирт подготовительной площадки, а затем вновь применить повидон йод антисептическим раствором. Далее, нанесите небольшое количество Steriле вазелин глазной мази для каждого глаза, чтобы предотвратить высыхание.
  5. Безопасный череп в стереотаксической рамы по следующему протоколу:
    1. Осторожно откройте рот, достигнув с парой изогнутых щипцов рассечения мягко вытащить язык и двигаться в сторону рта, чтобы предотвратить удушье. Разрешить щипцы, чтобы убрать то время как в рот, чтобы распространить челюсть открыта и направлять две верхние резцы в замочную скважину баре зуба на стереотаксической рамы. Закрепите планку зуба от поворота по горизонтали или вертикали, регулируя соответствующие винты. Убедитесь, что череп мыши на одном уровне с рабочей поверхностью.
    2. Поместите ухо баров надежно против заглазничными костей черепа будьте осторожны, чтобы не применять слишком много давления на внутреннюю черепа для того, чтобы предотвратить дробление.
    3. Поместите бар нос по языку и не закрутите до упора. Убедитесь, что нет вертикали / боковое движение в голову, слегка надавливаяс большим и указательным пальцами. Мышь помещают в правильной стереотаксической рамки, показан на фиг.2В ().
    4. Использование лезвие скальпеля, сделать 1 см разрез над срединной черепа из лобной кости к затылочной кости. Уберите кожу в разрез с помощью Colibri преднатяжителями.
    5. Опустить мкл шприца, снабженного 33 G иглой в вертикальном плече стереотаксической раме непосредственно над позицией темени (фиг.2с). Оттуда, отрегулируйте положение мм AP иглы +0,5 +2,5 мм, ML, чтобы достичь целевой сайт для имплантации опухоли. Используйте 1 мл туберкулиновые шприцы, оснащенный 26 G иглы, чтобы отметить это место, осторожно раздражающие надкостницы.
    6. Не Просверлите отверстие в черепе в целевом сайте до достижения основной твердой мозговой оболочки с помощью Аккумуляторные дрели Precision Power, оснащенный "(0,8 мм) немного 1/32. При бурении, применяют прерывистый давлении с последующим удалением DRILL немного от поверхности черепа, чтобы избежать перегрева и силы, которые могут привести к иным сверла прокалывания основной ткани мозга.
  6. Флеш мкл шприц с 0,9% NaCl в 1,7 мл коническую полипропиленовую микропробирок чтобы гарантировать, что игла не забит. Аккуратно вылить 0,6 мл коническую полипропиленовую микропробирку, содержащий опухолевые клетки несколько раз для ресуспендирования клеток.
  7. Составьте 2 мкл клеток в микролитр шприца гарантируя, что пузырьки воздуха не будут введены в шприц. Разлить по 1 мкл клеток на 70% изопропилового спирта препаративной площадку, оставляя ровно 1 мкл опухолевых клеток, остающихся в шприце.
  8. Принесите иглу вниз, пока она не коснется твердую мозговую оболочку, то ввести иглу в мозг -3.5 мм вентрально и сжимаются +0,5 мм. Медленно и плавно доставить клетки путем нажатия шприца в течение 1-2 мин.
  9. Разрешить клетки посе в месте инъекции в течение 5 мин перед медленно извлечение иглы. Вытрите свернувшейся крови или мозговое вещество из кончика иглы с чистым 70% -ным изопропиловым спиртом препаративной площадку. Промыть иглу шприца и тщательно с 0,9% NaCl с шага 2.6, чтобы гарантировать, что игла не засорен для следующей инъекции.
  10. Снимите втягивающие Colibri и шов кожи головы, используя три 3-0 нейлон мононити швов. Удалить мышь от стереотаксической рамы и управлять 0,1 мг / кг бупренорфина гидрохлорида подкожно (п) (приблизительно 67 мкл 0,03 мг / мл рабочего раствора на 20 г мыши), а затем 2,5 мг / кг атипамезола гидрохлорид внутримышечно (IM) (примерно 100 мкл 0,5 мг / мл рабочего раствора для 20 г мыши) для послеоперационного обезболивания и анестезии разворота. Поместите послеоперационных мышей обратно в их клетках под нагревательным лампы, чтобы оправиться.

3. Мышь Transcardial Perfusионов и Заготовка мозга

  1. Подготовьте гепаринизированной решение Тирода соответствии со следующим протоколом:
    1. Поместите магнитной мешалкой в ​​завинчивающейся крышкой бутылки хранения 1 л стекла и заполнить до объема сверхчистой деионизированной воды. Поместите бутылку на пластины для перемешивания.
    2. Взвесьте и добавьте следующие химические вещества в стеклянной бутылке при перемешивании: 8 г хлорида натрия (NaCl) 0,264 г хлорида кальция (CaCl 2 • 2H 2 O), 0,05 г фосфата натрия одноосновной (NaH 2 PO 4 • 2H 2 O), 1,0 г D-глюкозы (C 6 H 12 O 6), 1,0 г бикарбоната натрия (NaHCO 3), 0,2 г хлорида калия (KCl). Разрешить соли растворить, а затем добавить 100 мкл 1,000U / мл маточного раствора гепарина натрия в растворе Тирода.
    3. Удалить контейнер из перемешивающей пластине и извлечь планку перемешивании с использованием магнитной палочки. Храните гепаринизированную решение Тирода на 4° С.
  2. Подготовка рабочего раствора для терминальных анестезии следующим образом:
    1. Для кетамин / ксилазина терминала анестезии: удалить 1360 мкл с 10 мл флакон стерильного 0,9% инъекции NaCl и заменить 1200 мкл 100 мг / мл маточного раствора гидрохлорида кетамина и 160 мкл 100 мг / мл маточного раствора ксилазина гидрохлорид с получением смешанного рабочего раствора кетамина гидрохлорида (12 мг / мл) и ксилазина гидрохлорида (1,6 мг / мл).
  3. Подготовка плотность раствора центрифугирования СМИ смеси путем размещения 90 мл 10x PBS в 264 мл сверхчистой деионизированной воды (3.93x) в стерильной пластиковой таре. Титрование до рН 7,0-7,2 с помощью НСl и фильтруют стерилизовать через фильтр 0,22 мкм. Хранить при 4 ° С.
  4. Подготовка 70% плотность центрифугирования СМИ путем объединения 18 мл плотности центрифугирования медиа-решение смешать с 30 мл плотность центрифугирования СМИ (см список материаловподробности) в 50 мл полипропиленовые трубки центрифуги. Хранить при 4 ° С, но довести до комнатной температуры перед использованием.
  5. Подготовка 37% центрифугирования в градиенте плотности носитель путем объединения 9,6 мл DPBS с 10,4 мл 70% центрифугирования в градиенте плотности сред в 50 мл центрифужную пробирку. Хранить при 4 ° С, но довести до комнатной температуры перед использованием.
  6. Получают буфер потока, помещая 500 мкл FBS в 50 мл DPBS (~ 1% FBS) в 50 мл центрифужную пробирку. Храните в магазине при 4 ° C
  7. Заполните 4.5 L полиуретан ведро льда, чтобы емкость с ледяной стружки.
  8. Сделать комбинированный раствор 1 мг / мл коллагеназы и 1 мг / мл ДНКазы I-в количестве, достаточном для 1 мл в образце мозга в исследовании разбавлением 10 мг / мл ДНКазы I-маточного раствора 1:10 и 50 мг / мл коллагеназы раствор 1:50 стерильными DPBS в одном 15 мл полипропиленовую центрифужную пробирку. Аккуратно перемешать раствор с помощью пипетки вверх и вниз с P-1000 микропипеткой. Храните на льду в polyurethане ведро с шага 3.7.
  9. Получить два 7 мл стеклянные Dounce ткани шлифовальные. Добавьте один "NT", а другой "gal1i". Поместите ткани шлифовальные в ведерке со льдом и добавить 1 мл DPBS друг.
  10. Получить достаточно 15 мл центрифужные пробирки для сбора мозгового вещества из каждой мыши в области исследования и место в ведерке со льдом.
  11. Место ~ 150 мл DPBS среди трех 50 мл центрифужные пробирки в ведерке со льдом.
  12. Получить достаточно полистирола шестиугольные весом блюда (верхний внутренний диаметр (ID) 115 мм, база ID 85 мм, 203 мл объем) для каждой мыши в исследовании. В комплект для вскрытия и растирания мозгов мыши показано на (3А)
  13. В выбранных точках времени, анестезию первую мышь, несущих опухоль в исследовании с использованием одного инъекцией 150 мг / кг кетамина гидрохлорида и 20 мг / кг ксилазина гидрохлорид (приблизительно 250 мкл объединенного 12 мг / мл кетамина / 1,6 мг / мл ксилазин рабочего раствора для 20 г мыши), чтобы вызвать глубокий наркоз. Убедитесь, что мышь не является ответом на носок и хвост щепотки до судебного разбирательства.
  14. Получить заранее подготовленный раствор Tyrode и поместить в ламинарном потоке, посвященном хирургических процедур терминал животных. Поместите газа непроницаемый полимерный шланг, прикрепленный к карбогена бака в растворе Тирода. Откройте вентиль баллона, чтобы 95% O 2/5% СО 2 карбогена постоянно пузырь в раствор.
  15. Приложить 20 г алюминиевого ступицы тупую иглу до конца дополнительного газонепроницаемого полимерной трубки, прикрепленной к перистальтического насоса. Поместите трубку на другом конце перистальтического насоса в раствор в Тирода и поверните насос на, чтобы трубка для заполнения раствором насыщенной кислородом и Гепаринизированные Тирода. Набор для мыши transcardial перфузии показано на (рис 3B).
  16. Используя четыре 26 г иглы, придавитьнаркозом мыши вентральной стороной вверх в передней и задних лап на экструдированного пенополистирола блока, покрытого полотенцем утилизации абсорбента в капюшоне ламинарного потока.
  17. Возьмитесь за кожей над брюшную полость, используя пару тупым пинцетом и, используя большой пара рассечение ножницами сделать "Y" разрез с проникновением в брюшную стенку, резка cephalically проколоть мембрану, то бифурцирующих на грудине, чтобы прекратить в левый и правый подмышечные впадины.
  18. Используйте кровоостанавливающего зажать грудины и отражают грудную клетку над левым плечом мыши. Удалить перикарда с парой тупым пинцетом.
  19. Включите перистальтического насоса, чтобы начать устойчивый капельного раствора насыщенной кислородом и гепаринизированной Тирода (примерно 2,3-2,5 мл / мин).
  20. Вставьте тупую иглу в левый желудочек сердца. Используйте маленькую пару рассечение ножницами, чтобы отрезать правое предсердие, чтобы позволить обескровливания (рис3C).
  21. Разрешить Решение Тирода тщательно заливать систему кровообращения мыши, пока печень и легкие не полностью бланшируют в связи с отсутствием крови. Убедитесь, что нет валовых количество крови не продолжать выхода из правого предсердия до удаления 20 г алюминия ступицы тупую иглу из левого желудочка.
  22. Открепить мышь от экструдированного пенополистирола блока и включите мыши вентральной стороной вниз. Использование большого пару рассечение ножницами, отделить голову от остальной части тела на уровне шеи.
  23. С помощью небольшой пару рассечение ножницами, вырезать головы по срединной линии, начиная с затылочной кости рабочей вперед к морде, чтобы разоблачить череп.
  24. Уберите кожу на обеих сторонах черепа, используя большой и указательный палец и надежно удерживать череп. Используйте пару Кость Рейнджерс прорваться черепа, начиная с затылочной кости и работать вперед, чтобы полностью раскрыть спинной и боковойПоверхности мозга. Будьте осторожны, чтобы свести к минимуму повреждение мозга.
  25. После того, как кости черепа были удалены, вскружить голову мыши вентральной стороной вверх и использовать небольшое пару рассечение ножницами, чтобы сократить черепных нервов в основании головного мозга для того, чтобы освободить его от черепа.

4. Выделение глиомы инфильтрирующие МНПК

  1. Используя чистую одного краями лезвия бритвы, изолировать область мозга, содержащего опухоль, делая сагиттальный разрез по центру мозга пополам два полушария. Поверните той же стороне полушария медиальной вниз и сделать два корональных сокращений на уровне мозжечка и обонятельных луковиц, чтобы изолировать ткань-мишень, содержащий имплантат опухоли (рис 4а). Эквивалентный часть контралатеральной полушария могут быть также выделены и использованы в качестве отрицательного контроля.
  2. Поместите ткань-мишень в соответственно меченой стекла Даунса гомогенизатора тканей, содержащего 1 мл, из DPBS, толкать поршень полностью вниз и поворот 7 раз изначально нарушить ткани. Лифт плунжер, чтобы позволить жидкости возвращаться к нижней части гомогенизатора тканей. Повторите этот шаг трижды; Однако только крутить на поршень 4 раза в течение следующих двух повторов и 3 раза в течение последнего повторения, чтобы избежать чрезмерного растирания ткани.
  3. Использование P-1000 микропипетку, последовательно применяются три 1 мл объемы ледяной DPBS (подготовленной в 3.11) вдоль сторон поршня, чтобы ополоснуть в ткани мясорубку.
  4. Ресуспендируют растирают мозга дело с помощью пипетки вверх и вниз и поместить в маркированную 15 мл центрифужную пробирку на льду. Промыть стороны ткани мясорубку Dounce с 1 мл дополнительных ледяного DPBS и добавить к той же 15 мл центрифужную пробирку. Хранить все пробирки, содержащие растирают мозгового вещества на льду, пока все образцы не были обработаны.
  5. Повторите шаги 3,13-3,25 и 4,1-4,4 для каждой мыши в исследовании.
  6. После того как все образцы гаве были обработаны, спина вниз растирают мозгового вещества в центрифужные пробирки объемом 15 мл в 740 мкг (макс RCF) в течение 20 мин при 4 ° С.
  7. Удалить супернатант с 10 мл серологической пипеткой и пипетки пистолета и ресуспендируют гранулированный мозгового вещества в 1 мл предварительно приготовленного коллагеназы / ДНКазы I-пищеварительных ферментов с использованием P-1000. Поместите 15 мл центрифужные пробирки в стойку пробирку и в месте водяной бане при 37 ° С в течение 15 мин.
  8. Аккуратно агитировать образцы дважды в течение инкубационного периода, щелкая трубки для облегчения ткани разбивку.
  9. Добавить 6 мл охлажденного льдом ДЗФР помощью 10 мл пипетки серологические в каждую пробирку для разбавления пищеварительные ферменты. Пипетка вверх и вниз для ресуспендирования и фильтровать общие объемы через стерильные фильтры нейлоновое сито 70 мкм в новые меченых 15 мл центрифужные пробирки на льду.
  10. Спин мозга клеточной суспензии вниз на 740 мкг (макс RCF) в течение 20 мин при 4 ° С для достиженияодин осадок клеток (4В). После удаления 15 мл пробирки из центрифуги разместить их на лед и задания увеличения на центрифуге до примерно 21 ° С при подготовке к следующему шагу температуры.
  11. Полностью удалить супернатант из каждой пробирки, содержащей клетки мозга и первоначально ресуспендируют гранул в 1 мл 70% центрифугирования в градиенте плотности носителей, использующих P-1000 микропипетки. Затем добавить 4 дополнительных миллилитров 70% плотность центрифугирования СМИ в каждую пробирку с использованием 10 мл серологические пипетки. Винт крышки на надежно и гомогенизации суспензии клеток осторожно переворачивая, чтобы трубки несколько раз.
  12. Снимите центрифужные пробирки, содержащие 15 мл клетки мозга ресуспендировали в 70% плотность центрифугирования СМИ от льда, и место в стойке пробирки при комнатной температуре. По одному, тщательно накладывать 2 мл 37% центрифугирования в градиенте плотности носителей раствора на 5 мл 70% центрифугирования в градиенте плотности среды с P-1000 микропипетки с образованием переменногопостное интерфейс между двумя центрифугирования в градиенте плотности медиа слоев (фиг.4С).
    1. Использовать маркер с острым концом для указания положения интерфейса, так что можно легко определить после центрифугирования, когда различие становится менее заметным.
  13. Спин вниз центрифужные пробирки объемом 15 мл при 740 х г (макс RCF) в течение 20 мин при комнатной температуре без перерыва, чтобы избежать нарушения интерфейс.
  14. После центрифугирования собирают РВМС, которые накопились на поверхности раздела между двумя центрифугирования в градиенте плотности медиа слоев (рис 4D) путем введения Р-200 микропипетки в пробирку вдоль его стороны, тщательно обход липидный слой.
    1. После на уровне группы РВМС, медленно извлечь 200 мкл из поверхности 70% медиа слой центрифугирования в градиенте плотности и поместить в соответственно меченой полипропилена FACS трубы на льду. Повторить один раз при общем объеме 400 мкл на образец.
  15. Добавить 3 мл буфера потока к каждому FACS пробирку, содержащую 400 мкл РВМС в достаточной степени разбавления центрифугирования в градиенте плотности носитель, то вращаться клетки вниз на 660 мкг (макс RCF) в течение 20 мин при 4 ° С.

5. иммунноокрашивания глиомы инфильтрирующие МНПК

  1. До анализа никаких экспериментальных образцов РВМС, выполнить один, независимо, на поверхности клетки контрольный эксперимент изотип определить исходные ворота, которые будут связаны с набором фиксированных напряжений PMT в шаблоне анализа данных проточной цитометрии, посвященном оценке глиомы-проникновения РВМС согласно со следующим протоколом:
    1. Привить одной C57BL / 6J мышь с GL26-чит-gal1i, а другой с GL26-чит-NT в соответствии с процедурой, описанной в разделе 2. После 72 ч роста опухоли, усыпить мышей и изолировать опухоль проникает МНПК в соответствии с процедурами изложил всей разделах 3 и 4.
    2. Объедините две пробы PBMC (NTй gal1i) в одном объеме (т.е. 100 мкл), затем дополнительно разделить образец равномерно среди трех FACS труб (то есть, 33,3 мкл на пробирку) с маркировкой "CD45 изотипа", "GR-1 / CD11b изотипа" и "NK1. 1 изотипу ". Добавьте следующие антитела (каждый по 1: 100 разбавлении и разбавляют до общего объема 200 мкл в буфере потока) на соответственно обозначенных FACS труб: «CD45 изотипа": Alexa Fluor 700-конъюгированного крысы IgG2b, К (клон: RTK4530 ); "GR-1 / CD11b изотип": Alexa Fluor 700, конъюгированных крысы против мышиного CD45 (клон: 30-F11), ПЭ-конъюгированного крысы IgG2b, κ (клон: eB149 / 10H5) и PerCP / Cy5.5 -conjugated крысы IgG2b, κ (клон: RTK4530); "NK1.1 изотип": Alexa Fluor 700, конъюгированных крысы против мышиного CD45 (клон: 30-F11), ПЭ-конъюгированного крысы против мышиного GR-1 (клон: RB6-8C5), PerCP / Cy5.5-конъюгированные анти-мышиных CD11b (клон: М1 / 70), и АРС-Conjugated мыши IgG2a, κ (клон: eBM2a).
    3. Разрешить МНПК к immunolabel на льду в темноте в течение 20 мин. Флик трубки раз на полпути через инкубационного периода, чтобы мягко смешать. Промыть 1 мл буфера потока, спин вниз при 660 х г (макс RCF) в течение 10 мин при 4 ° С и ресуспендируют каждый FACS трубки, содержащей РВМС с 200 мкл буфера потока.
    4. Использование потока цитометр, оснащенный встроенным соплом 85 мкм, анализировать "CD45 изотипа" трубку первым установить базовые CD45 интервал ворота. Далее, запустите "Гр-1 / CD11b изотипный" трубку, чтобы установить базовый Гр-1 / CD11b квадрант ворота, используя только истинные CD45 + клеток в качестве входных. Наконец, запустите "NK1.1 изотипный" трубу установить базовый NK1.1 интервал ворота, используя только истинное CD45 + / GR-1 низкая / CD11b +/- клетки как вход.
  2. Используйте следующую процедуру для всех будущего экспериментального апalysis:
    1. Сделать достаточное количество 1: 100 разбавлении клеточной поверхности антитела в буфере потока для достижения объема 200 мкл на образце (плюс 1 для изотипа GzmB): Alexa Fluor 700, конъюгированных крысы против мышиного CD45 (клон: 30-F11 ), ПЭ-конъюгированного крысы против мышиного GR-1 (клон: RB6-8C5), PerCP / Cy5.5-конъюгированные анти-мышиных CD11b (клон: М1 / 70), APC-сопряженных мыши против мышиного NK1.1 (клон: PK136).
    2. Осторожно удалите супернатант из центрифугировали МНПК от 4,15 до мениск не только выше нижней части каждой трубы FACS (~ 50 мкл), чтобы избежать потери клеток. Ресуспендируют МНПК в каждом FACS трубы, используя буфер остаточного потока с П-200 микропипеткой и удалить (1 / # образцов) на сумму объема от каждого FACS трубы и объединить в новую пробирку FACS "объединили изотипу".
    3. Добавить 200 мкл коктейля антител на клеточной поверхности, полученной в 5.2.1 к каждому образцу РВМС. Разрешить МНПК к immunolabel на льду в темноте в течение 20 мин. Флик тон трубок раз на полпути через инкубационного периода, чтобы аккуратно перемешать.
    4. Промыть 1 мл буфера потока; спин вниз при 660 х г (макс RCF) х 10 мин при 4 ° С.
    5. Ресуспендируют все трубы FACS, содержащих МНПК в 200 мкл коммерчески доступного формалина на основе фиксатора (см список материалов для деталей) в течение 15 мин на льду в темноте. Флик трубки раз на полпути через инкубационного периода, чтобы мягко смешать.
    6. Промыть 1 мл коммерчески доступного буфера 1x пермеабилизации / стирки (см список материалов для деталей) и спин вниз в 660 мкг (макс RCF) в течение 10 мин при 4 ° С.
    7. В то время как РВМС вращаются вниз, подготовить достаточное количество 1: 100 разбавлении Pacific Blue-конъюгированные мыши против мышиного GzmB (Клон: GB11) внутриклеточных антител в 1X пермеабилизации / промывочного буфера для достижения объема 200 мкл на образце.
    8. В отдельную пробирку, подготовить единый объем 200 мкл 1: 100 разбавлении Pacific Blue-Conjugated мыши IgG1, κ (клон: МОРС-21) контроль изотипа антитела.
    9. Ресуспендируют каждый из образцов РВМС экспериментальных с 200 мкл 1: 100 разбавления анти-мышиного антитела GzmB и ресуспендируют одного FACS пробирку "объединили изотип" с объемом 200 мкл 1: 100 разбавлении изотипа антител.
    10. Разрешить все образцы РВМС, чтобы immunolabel на льду в темноте в течение 20 мин. Флик трубки раз на полпути через инкубационного периода, чтобы мягко смешать.
    11. Промыть 1 мл буфера потока; спин вниз при 660 х г (макс RCF) в течение 10 мин при 4 ° С и ресуспендируют РВМС с 200 мкл буфера для анализа потока.
    12. Поток cytometrically проанализировать глиомы инфильтрирующие МНПК, используя интегрированную насадку 85 мкм и ворота и PMT напряжения, установленные ранее в разделе 5.1 22. Будьте уверены, чтобы запустить весь объем каждого образца на проточном цитометре для обеспечения справедливого сравнения общего числа глиомы-infiltРейтинг МНПК в каждом образце.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Следующую стратегию стробирования для типичного эксперимента: FSC-A по сравнению с SSC-A → SSC-H по сравнению с ССК-W → FSC-H по сравнению с ЛПС-W → CD45 против граф → Gr-1 по сравнению с CD11b → NK1.1 против графа. Гейтс размещены на Gr-1 + / CD11b + миелоидной клетки и NK1.1 + NK клетки затем стратифицированных на основе GzmB выражения (5А). Backgating эти клетки, идентифицированные как NK1.1 + NK-клеток и GR-1 + / CD11b + миелоидных кл...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Этот протокол описывает надежный и воспроизводимый метод для изоляции и проточной цитометрии анализа МНПК, которые проникли в начале мыши опухоли мозга микросреду. Глиомы клеточные суспензии генерируются в концентрации, указанной экспериментатора, которые привиты стереотаксически в полосатом теле мозга мыши. Затем мышей умерщвляли заданных точках времени, указанного эксперимента и их мозг собирают и обрабатывается, чтобы изолировать глиомы-проникновения РВМС, которые immunolabeled с комбинациями, конъюгированное с флуор...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была выполнена при поддержке Национального института здоровья / Национальный институт неврологических расстройств & Stroke (NIH / NINDS) предоставляет R01-R01, NS074387-NS057711 и R21-NS091555 к MGC; NIH / NINDS предоставляет R01-R01, NS061107-NS076991, R01-R21 и NS082311-NS084275 к ПРЛ; гранты от Лии Счастливые сердца, Мичиганский университет всеобъемлющем онкологического центра присуждена MGC и ПРЛ; Департамент нейрохирургии университета Мичигана в Школе медицины; Мичиган Институт клинической и исследования в области здравоохранения, при поддержке гранта NIH 2UL1-TR000433; Мичиганский университет биологии рака Обучение Грант поддерживается NIH / NCI (Национальный институт рака) гранта T32-CA009676; Мичиганского университета Обучение в клинических и фундаментальных Neuroscience поддерживается NIH / NINDS предоставить T32-NS007222; и Мичиганского университета Медицинской Программы подготовки Scientist поддерживается NIH / NIGMS (Национальный институт наук Общая медицина) предоставлять T32-GM007863. АвторыRe благодарны за академического руководства и поддержки, полученной от доктора Карин Muraszko и отделение нейрохирургии; М. Дальгрен, Д. TOMFORD, С. наполитан для превосходным административной поддержки; М. Dzaman за выдающиеся технической помощи; и Фил Дженкинс Ф. для щедрой поддержке к покупке Zeiss 3D Сканирующий электронный микроскоп. Мы также признаем, лаборатории Kuchroo в Гарвардской медицинской школе, из которой составлялся модифицированная версия медиа-опосредованной стратегии плотность центрифугирования для выделения мозга мононуклеарных клеток.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Дульбекко s Модификация Eagles MediumGibco12430-054с 4,5 г/л D-глюкозы, L-глутамина, 25 мМ HEPES и фенола ред 
Дульбекко s Фосфатно-солевой буфер Gibco14190-144 без хлорида кальция или хлорида магния
Фетальная бычья сывороткаOmega Scientific Inc.FB-11
Пенициллин стрептомицин Gibco15140-12210 000 ед/мл пенициллина; 10 000 г/мл Стрептомицин 
L-глутаминGibco25030-081200 мМ
G418 сульфат Омега Сайентиал Инк.GN-04
Пуромицина дигидрохлорид   Sigma-AldrichP8833из Streptomyces alboniger
HyClone HyQTase альтернатива трипсину у млекопитающих Thermo ScientificSV30030.01в DPBS с EDTA 
Фазово-контрастный гемоцитометрSigma-AldrichZ359629глубиной 0,1 мм
Трипановый синий красительGibco15250-061
Стерильный 0,9% NaCl инъекционный, USPHospiraNDC: 0409-4888флаконы 10 мл конические
полипропиленемические микропробирки 0,6 млGenesee Scientific22-272
Атипамезола гидрохлорид для инъекцийOrion PharmaNDC: 52483-62985 мг/мл раствор
Кетамина гидрохлорид для инъекцийFort DodgeNDC: 0409-2051100 мг/мл раствор
Дексмедетомидина гидрохлорид для инъекцийZoetisNDC: 54771-28050,5 мг/мл раствор
Ксилазина гидрохлорид для инъекцийLloydNDC: 61311-481100 мг/мл раствор
Карпрофен для инъекцийPfizerNDC: 61106-850150 мг/мл раствор
бупренорфина гидрохлорид для инъекцийReckitt BenckiserNDC: 12496-07570,3 мг/мл ампулы
1 мл туберкулиновые шприцы Covidien8881501400
26G x ½ (0,45 мм x 13 мм) иглы для шприцев BD305111
Хирургические машинки для стрижки3M9661
Провидон-йод растворAplicare82-217NDC: 52380-1905
Стерильная петролатумная офтальмологическая мазь DechraNDC: 17033-211
70% изопропиловый спирт прокладкидля подготовки Kendall6818
Стерильная марляCovidien8044нетканый, 4" x 4", 4-слойный 
1,7 мл конические полипропиленовые микротрубкиGenesee Scientific22-281
Мышь стереотаксическая рамкаStoelting51730
Хирургическая лампаPhilips BurtonCS316WCoolspot II Переменный прожектор
Изогнутые рассекающие щипцыTed Pella Inc.5431
Втягивающие устройства Colibri FST17000-03
Аккумуляторная прецизионная дрельDremel 1100-01Модель стилуса; 7,2-вольтовый литий-ионный с док-станцией
Гравировальный резакDremel1051/32" или 0,8 мм диаметр бита
Микролитровый шприцHamilton75Микролитровые шприцы Hamilton 700 серии; 5 μ l
объем Микролитровые иглы для шприцаHamilton7762-0633 G, маленькая втулка RN NDL, 1,5 дюйма, точка стиля 3, 6/PK
Ethilon 3-0 черная мононить нейлоновые швы Ethicon1663
Магнитная мешалкаVWR74950-2967,9 мм диаметр x 50 мм длина (5/16 дюйма диаметр x 2 дюйма длина)
л стеклянная бутылка с завинчивающейся крышкойCorning1395Тип 1, класс А боросиликатное стекло
Гепарин натрияSagentNDC: 25021-4001,000 Ед/мл раствор
Перистальтический насосCole Parmer Instruments Group77200-60Master Flex Easy Load II консольный привод
сжатый карбоген (95% O2 / 5% CO2)у местного поставщикаN/AA-type, большой цилиндр;
20 Г x 1 ½ " алюминиевая ступица тупые иглыKendall88812023630,9 мм x 38,1 мм
Полиуретановое ведро для льдаFisherbrand02-591-45Емкость: 0,152 унции (4,5 л)
Коллагеназа (тип I-S)Sigma AldrichC1639из Clostridium histolyticum 
Дезоксирибонуклеаза IWorthington Biochemical Corp.LS002007>2,000 единиц Куница на мг сухого веса
Антистатическая полистирольная гексагональная посуда для взвешиванияTed Pella Inc.20157-3верхний внутренний диаметр 115 мм, внутренний диаметр основания 85 мм, объем 203 мл 
Лезвия бритвы из нержавеющей стали с одним лезвием Garvey40475
Костяные ронжерыFST16001-15
ГемостатFST13014-14
Большие ножницы для препарированияTed Pella Inc.1316
Малые ножницы для рассеченияFST14094-11
Щипцы с тупым концомTed Pella Inc.13250
стеклянный измельчитель тканей Dounce 7 млKontesKT885300-0007
Percoll Density Centrifugation Media GE HealthcareGE17-0891-01
Серологические пипетки 10 млGenesee Scientific12-104одноразового использования; стерильные
70 μ m стерильные нейлоновые сетчатые ситечки Fisherbrand22363548
Alexa Fluor 700-конъюгированный крысиный антимышиный CD45 (клон: 30-F11)Biolegend103128
APC-конъюгированный мышиный антимышиный NK1.1 (клон: PK136)eBiosciences 17-5941-82
PE-конъюгированная крыса антимышиный Gr-1 (клон: RB6-8C5)BD Pharmigen553128
PerCP/Cy5.5-конъюгированный крысиный антимышиный CD11b (клон: M1/70) Biolegend101228
Alexa Fluor 700-конъюгированная крыса IgG2b, κ (клон: RTK4530) контроль изотипа Biolegend400628
APC-конъюгированная мышь IgG2a, κ (клон: eBM2a) контроль изотипа eBioscience17-4724
PE-конъюгированная крыса IgG2b, κ (клон: eB149/10H5) контроль изотипа eBioscience12-4031-82
PerCP/Cy5.5-конъюгированная крыса IgG2b, κ (клон: RTK4530) контроль изотипаBiolegend400632
Pacific Blue-конъюгированная мышь антимышиный гранзим B (клон: GB11) Biolegend515403
Тихоокеанская синяя конъюгированная мышь IgG1, κ (Клон: MOPC-21) управление изотипом Biolegend400151
Cytofix/CytopermBD554714
15 мл полипропиленовые центрифужные пробиркиGenesee Scientific21-103коническое дно 
50 мл полипропиленовые центрифужные пробиркиGenesee Scientific21-108коническое дно
12 мм x 75 мм круглое дно полипропиленовые тубы FACS Fisherbrand14-956-1B
FACSAria Специальный заказ Исследование Проточный цитометр/сортировщик клетокBD 
Класс II Шкаф биологической безопасностиThe Baker CompanySG603модель: SterilGARD III Advance
1 650033

Ссылки

  1. Bleeker, F. E., Molenaar, R. J., Leenstra, S. Recent advances in the molecular understanding of glioblastoma. J Neurooncol. 108, 11-27 (2012).
  2. Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. N Engl J Med. 352, 987-996 (2005).
  3. Ostrom, Q. T., et al. CBTRUS statistical report: primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2007-2011. Neuro Oncol. 16, Suppl 4. iv1-63 (2014).
  4. Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523, 337-341 (2015).
  5. Kennedy, B. C., et al. Tumor-associated macrophages in glioma: friend or foe? J Oncol.. 2013, 486912(2013).
  6. Markovic, D. S., Glass, R., Synowitz, M., Rooijen, N., Kettenmann, H. Microglia stimulate the invasiveness of glioma cells by increasing the activity of metalloprotease-2. J Neuropathol Exp Neurol. 64, 754-762 (2005).
  7. Zhai, H., Heppner, F. L., Tsirka, S. E. Microglia/macrophages promote glioma progression. Glia. 59, 472-485 (2011).
  8. Kmiecik, J., et al. Elevated CD3+ and CD8+ tumor-infiltrating immune cells correlate with prolonged survival in glioblastoma patients despite integrated immunosuppressive mechanisms in the tumor microenvironment and at the systemic level. J Neuroimmunol. 264, 71-83 (2013).
  9. Yang, I., Han, S. J., Sughrue, M. E., Tihan, T., Parsa, A. T. Immune cell infiltrate differences in pilocytic astrocytoma and glioblastoma: evidence of distinct immunological microenvironments that reflect tumor biology. J Neurosurg. 115, 505-511 (2011).
  10. Wagner, S., et al. Microglial/macrophage expression of interleukin 10 in human glioblastomas. Int J Cancer. 82, 12-16 (1999).
  11. El Andaloussi, A., Lesniak, M. S. An increase in CD4+CD25+FOXP3+ regulatory T cells in tumor-infiltrating lymphocytes of human glioblastoma multiforme. Neuro Oncol. 8, 234-243 (2006).
  12. Kostianovsky, A. M., Maier, L. M., Anderson, R. C., Bruce, J. N., Anderson, D. E. Astrocytic regulation of human monocytic/microglial activation. J Immunol. 181, 5425-5432 (2008).
  13. Curtin, J. F., et al. HMGB1 mediates endogenous TLR2 activation and brain tumor regression. PLoS Med. 6, e10(2009).
  14. Curtin, J. F., et al. Fms-like tyrosine kinase 3 ligand recruits plasmacytoid dendritic cells to the brain. J Immunol. 176, 3566-3577 (2006).
  15. Mineharu, Y., et al. Engineering the brain tumor microenvironment enhances the efficacy of dendritic cell vaccination: implications for clinical trial design. Clin Cancer Res. 17, 4705-4718 (2011).
  16. Larocque, D., et al. Exogenous fms-like tyrosine kinase 3 ligand overrides brain immune privilege and facilitates recognition of a neo-antigen without causing autoimmune neuropathology. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 14443-14448 (2010).
  17. Curtin, J. F., et al. Treg depletion inhibits efficacy of cancer immunotherapy: implications for clinical trials. PLoS One. 3, e1983(2008).
  18. Ali, S., et al. Combined immunostimulation and conditional cytotoxic gene therapy provide long-term survival in a large glioma model. Cancer Res. 65, 7194-7204 (2005).
  19. Dewey, R. A., et al. Chronic brain inflammation and persistent herpes simplex virus 1 thymidine kinase expression in survivors of syngeneic glioma treated by adenovirus-mediated gene therapy: implications for clinical trials. Nat Med. 5, 1256-1263 (1999).
  20. Baker, G. J., et al. Natural killer cells eradicate galectin-1-deficient glioma in the absence of adaptive immunity. Cancer Res. 74, 5079-5090 (2014).
  21. Baker, G. J., et al. Mechanisms of glioma formation: iterative perivascular glioma growth and invasion leads to tumor progression, VEGF-independent vascularization, and resistance to antiangiogenic therapy. Neoplasia. 16, 543-561 (2014).
  22. Ormerod, M. G., Novo, D. Flow cytometry : a basic introduction. , (2008).
  23. Stirling, D. P., Yong, V. W. Dynamics of the inflammatory response after murine spinal cord injury revealed by flow cytometry. J Neurosci Res. 86, 1944-1958 (2008).
  24. Hirai, T., et al. The prevalence and phenotype of activated microglia/macrophages within the spinal cord of the hyperostotic mouse (twy/twy) changes in response to chronic progressive spinal cord compression: implications for human cervical compressive myelopathy. PLoS One. 8, e64528(2013).
  25. Fleming, T. J., Fleming, M. L., Malek, T. R. Selective expression of Ly-6G on myeloid lineage cells in mouse bone marrow. RB6-8C5 mAb to granulocyte-differentiation antigen (Gr-1) detects members of the Ly-6 family. J Immunol. 151, 2399-2408 (1993).
  26. Wiesner, S. M., et al. De novo induction of genetically engineered brain tumors in mice using plasmid DNA. Cancer Res. 69, 431-439 (2009).
  27. Holland, E. C., et al. Combined activation of Ras and Akt in neural progenitors induces glioblastoma formation in mice. Nat Genet. 25, 55-57 (2000).
  28. Lynes, J., et al. Lentiviral-induced high-grade gliomas in rats: the effects of PDGFB, HRAS-G12V, AKT, and IDH1-R132H. Neurotherapeutics. 11, 623-635 (2014).
  29. de Vries, N. A., et al. Rapid and robust transgenic high-grade glioma mouse models for therapy intervention studies. Clin Cancer Res. 16, 3431-3441 (2010).
  30. Uhrbom, L., et al. Ink4a-Arf loss cooperates with KRas activation in astrocytes and neural progenitors to generate glioblastomas of various morphologies depending on activated Akt. Cancer Res. 62, 5551-5558 (2002).
  31. Marumoto, T., et al. Development of a novel mouse glioma model using lentiviral vectors. Nat Med. 15, 110-116 (2009).
  32. Assanah, M., et al. Glial progenitors in adult white matter are driven to form malignant gliomas by platelet-derived growth factor-expressing retroviruses. J Neurosci. 26, 6781-6790 (2006).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

NK

Похожие статьи