Полиграфическая Порядок записи для измерения спать в мышах

Технический прогресс часто осаждают квантовые скачки в понимании нейробиологических процессов. Например, открытие Ганса Бергера в 1929 году, что электрические потенциалы, записанные с человеческого головы взял форму синусоидальных волн, частота которых была непосредственно связана с уровнем бодрствования субъекта, привело к быстрому прогрессу в понимании сон-бодрствование регулирование, в обоих животных и человека, так. ^{1. Для} этого дня electroencephlogram (ЭЭГ), в сочетании с электромиограмме (ЭМГ), то есть., электрическая активность производится скелетных мышц, представляет собой данные "костяк" из почти каждый экспериментальные и клинические Оценка, которая стремится соотнести поведение и физиологию с деятельностью корковых нейронов в себя животных, включая человека. В большинстве основной научно-исследовательских лабораторий сна эти ЭЭГ выполняется с помощью кабельной системы на основе (рисунок 1), в котором приобрела Dата подвергается офф-лайн, чтобы узор и спектрального анализа [например., применяя быстрого преобразования Фурье (БПФ) алгоритм], чтобы определить, бдительность состояние снимаемого объекта. ^{2, 3} Сон состоит из движения быстрого глаз (REM) и не-REM (NREM) сон. Быстрый сон характеризуется быстрым низкого напряжения ЭЭГ, случайного движения глаз, мышц и атонии, состояние, при котором мышцы эффективно парализован. Медленного сна также известен как парадоксального сна, потому что активность мозга напоминает бодрствования, в то время как тело в основном отключен от головного мозга и, как представляется, в глубокий сон. Напротив, моторные нейроны стимулируются во время NREM сна, но нет движения глаз. Человек NREM сна можно разделить на 4 этапа, в результате чего 4-й стадии называется сон или медленного сна и определенных больших медленных волн мозга с дельта активности между 0,5 - 4 Гц в ЭЭГ. С другой стороны, разделение между фаз NREM сна в небольших животных, как крысы Ай мышей, не было установлено, в основном потому, что они не имеют длинные периоды консолидированной сна, как показано на человека.

На протяжении многих лет, и на основе интерпретации ЭЭГ, несколько моделей регулирования сон-бодрствование, и автоматических и гуморального основе, были предложены. Нервная и клеточная основа необходимости для сна или, в качестве альтернативы, "диск сна", остается нерешенным, но был позиционироваться как гомеостатического давления, который строит в период бодрствования и сна, рассеиваемой. Одна теория состоит в том, что эндогенные факторы накапливаются somnogenic во время бодрствования, и что их постепенное накопление является фундаментом для сна гомеостатического давления. В то время как первое официальное предположение, что сон регулируется гуморальными факторами была зачислена на работу Розенбаум, опубликованной в 1892 ^4, это было Ишимори ^{5, 6 и} Pieron ^7, которые независимо друг от друга, и более 100 лет назад, показали существование сна содействия химических веществ, Оба исследователя предложил, а на самом деле оказалось, что Hypnogenic вещества или 'hypnotoxins "присутствовали в спинномозговой жидкости (ликвора) из лишенных сна собак. ⁸ За последнее столетие несколько дополнительных предполагаемых Hypnogenic веществ, вовлеченных в гомеостатической процесса сна были определены (для обзора см. 9), в том числе простагландинов (PG) _D 2, ^10, 11 цитокинов ^{аденозина,} 12 ^{анандамидом,} 13 и пептида уротензин II. ¹⁴

Экспериментальная работа по Экономо ^{15, 16,} Моруцци и Magoun ¹⁷ и других в начале и середине ^20-го века, были выработаны выводы, которые вдохновили схемы на основе теории сна и бодрствования и, в определенной степени, омрачено тогдашних гуморальный теории спать. На сегодняшний день, несколько "моделей" схема были предложены, каждый по данным записей различного качества и количества (для обзора см. 18). Одна модельНапример, предлагается, чтобы медленного сна генерируется через аденозин-опосредованного ингибирования высвобождения ацетилхолина из холинергических нейронов в базальном переднем мозге, область основном consisiting ядра горизонтальной конечности диагональной полосы Брока и веществе inominata. ¹⁹ Еще один популярный модель регулирования сна / бодрствования описывает механизм переключения флип-флоп на основе взаимовыгодного тормозных взаимодействий между снотворных нейронов в вентролатеральной преоптическом и следа вызывающие нейронов в гипоталамусе и ствола мозга. ^{18, 20, 21} Кроме того, для переключения в и из сна, подобная взаимно ингибирующий взаимодействие было предложено областях в стволе головного мозга, то есть брюшной около водопровода головного мозга серый, боковая мостовой покрышку, и sublaterodorsal ядро. ²² В совокупности, эти модели оказались ценным эвристика и предоставляемые важные толковании рамки для исследований в области исследований сна; Тем не менее, выт полное понимание молекулярных механизмов и схем, регулирующих цикл сон-бодрствование потребует более полное знание его компонентов. Система для полиграфической записи подробно ниже, должны помочь в достижении этой цели.

О себе этика: Процедуры с участием животных предметы были одобрены Комитетом эксперимента Институциональная животных в Университете Цукуба по.

1. Подготовка электродов и кабелей для ЭЭГ / ЭМГ Recordings

1. Подготовьте ЭЭГ / ЭМГ записи электрод в соответствии со следующей процедурой.
   Примечание: Электрод одноразовый и может быть использован только для 1 животного. План тщательно схема проводки для всех разъемов. Поместите отметки на разъемах для правильной ориентации.
   1. Припой каждый штифт заголовка 4-контактный для 2-см проволоки из нержавеющей стали. Вкратце, держать один конец провода к контакту, место горячий паяльник на провода-контактный сустава и растопить припой для того, чтобы достаточно просто припой проходит гладко в сустав. Будьте осторожны, чтобы не применять слишком много тепла, чтобы штифт; в противном случае, пластиковый вокруг штифтов растает.
   2. Припой свободный конец каждого из 2 проводов, подключенных к штырьками в голову1,0 мм нержавеющей стали диаметром шнека с. Вкратце, удерживайте свободный конец провода к теме ниже головки винта, поместите горячим паяльником на провод-резьбового соединения, и растопить припой для того, чтобы достаточно просто припой проходит гладко в сустав. 2 провода с винтами служат записи ЭЭГ электродов, в то время как 2 провода без винтов служат ЭМГ регистрирующих электродов.
   3. Используйте ножницы, чтобы сдирать 1 мм изоляции на конце электродов ЭМГ повысить качество сигнала ЭМГ.
   4. Полностью охватить все спаянные контакты с эпоксидным клеем с помощью тонкой деревянной палочкой или зубной выбор, чтобы уменьшить электрический шум во время ЭЭГ / ЭМГ записей.
2. Подготовьте кабель для подключения электрода с контактным кольцом, как описано ниже. Этот кабель может быть использован повторно.
   1. Припой каждый штифт 4-контактный разъем FFC / FPC с проводом 30 см плоского кабеля. Вкратце, провести зачищенный конец провода к контакту, место горячий паяльникна провод-контактный сустава и растопить припой для того, чтобы достаточно припой проходит гладко в сустав.
      Примечание: Выберите длину плоского кабеля, который подходит для высоты экспериментальной клетке животного, используемого для ЭЭГ / ЭМГ записей.
   2. Припой обжимной розетки к кончику провода на другом конце плоского кабел. Вкратце, провести обжимной разъем для раздетого свободного конца проволоки, поместите горячим паяльником на проводной шарнир, и растопить припой для того, чтобы достаточно припой проходит гладко в сустав.
   3. Вставьте каждый разъем обжимной в 4-положении опрессовки жилье.
   4. Полностью покрыть обжимной головки с эпоксидным клеем с помощью тонкой деревянной палочкой или зубной выбор.

2. Имплантация электродов в мышь руководителя (Продолжительность: пр. 20 мин)

1. Стерилизовать всех хирургических инструментов в горячей стерилизатор шарик до операции. Обезболить мужской мышь (10 - 20 недель, 20 - 30 г)внутрибрюшинной инъекции пентобарбитала (50 мг / кг). После проверки, что мышь глубоко под наркозом, зажимая палец на ноге, брить волосы на голове и шее с садовыми ножницами.
2. Наведите указатель мыши на стереотаксической рамы и зафиксировать голову между уха баров 2. Применить вазелин на глазах, чтобы предотвратить сухость. Очисти бритая шкуру с алкоголем и сократить его по средней линии с помощью скальпеля, чтобы выставить череп. Клип кожу, чтобы сохранить хирургическую область открыта.
3. Резаком карбида (размер сверла: 0,8 мм диаметр), дрель 2 отверстия в черепе, один над лобной области коры (1 мм впереди брегмы, 1,5 мм сбоку от средней линии), а другой на теменной области ( 1 мм впереди лямбда, 1,5 мм сбоку средней линии) правого полушария, в соответствии с стереотаксических координат Paxinos и Франклин. ²³
4. С помощью отвертки ювелира, место из нержавеющей стали ЭЭГ записи винты в отверстия и сделать 2 - 2,5 оборота для каждого ScreВт для эпидуральной позиционирования по коре.
   Примечание: Не вставляйте винты слишком глубоко, чтобы предотвратить повреждение ткани головного мозга. Убедитесь, что винты плотно фиксируется на черепе. Это важно, чтобы иметь стабильные сигналы ЭЭГ в течение длительного периода нескольких записей (обычно, более 1 месяца). Wiggly винты производить артефакты ЭЭГ и может оторваться до конца экспериментального графика.
5. Закрепите электродный узел (см раздел 1.1, булавки кверху) с мгновенной клея к черепу и покрыть зубным цементом. Сделайте небольшие отверстия в двустороннем щипцами в трапециевидной (шеи) мышц и вставьте провода из нержавеющей стали, которые служат электродами ЭМГ в отверстия. Шовный кожу с шелковой нитью (диаметр 0,1 мм), чтобы избежать воздействия на мышцы.
6. Отключив мышь от стереотаксической рамы. Администрирование ампициллин (100 мг / кг) и мелоксикама (1 мг / кг) внутрибрюшинно мыши, чтобы избежать бактериальной инфекции и снижения послеоперационной боли, соответственно. Кеер мыши на тепловой площадку и контролировать его, пока он не восстановил достаточную сознание поддерживать грудины лежачее положение. Дом мышь индивидуально во время восстановления, чтобы избежать удаления электродов другими животными, и управлять мелоксикам (1 мг / кг) внутрибрюшинно в первый день после операции.

3. Запись и Получение ЭЭГ / ЭМГ данных

1. После 1-недельного периода восстановления, дом друг мыши по отдельности на экспериментальной клетке, помещенной в звуконепроницаемой камере записи. Поддержание температуры окружающей среды 23 ± 1 ° С и автоматически контролировать циклы 12-ч света / 12 ч темноты-(свет включали в 08:00, освещенность ~ 100 лк).
2. Подключите электродный узел ЭЭГ / ЭМГ на голове мыши с кабелем записи. Убедитесь, что кабель записи подключено к контактным кольцом (который устроен так, что движение мыши не ограничены скручивания кабеля) и усилителем сигнала ЭЭГ / ЭМГ. Фильтр ЭЭГ / ЭМГ сигналы (ЭЭГ, 0,5-64 Гц; ЭМГ, 16-64 Гц), оцифровать с частотой дискретизации 128 Гц от преобразователя аналого-цифровой (A / D) и, наконец, записывать на компьютере под управлением программного обеспечения для записи ЭЭГ / ЭМГ (стол «Материалы», ^4-й вход снизу).
3. Приучают мыши в течение 2 - 3 дней в записи камеры. Если запись ЭЭГ / ЭМГ включает внутрибрюшинно наркотиков, мягко обращаться с мышью на каждый день привыкания во время введения препарата.
4. Впоследствии, запустить программное обеспечение ЭЭГ / ЭМГ записи (таблица "Материалы", ^4-й въезд снизу).
   1. Выберите вкладку "Информация о файле" Данные и нажмите флажок рядом с именем файла. Введите имя файла и нажмите "Сохранить".
   2. Выберите вкладку "Запись состояние" и выберите все каналы ЭЭГ / ЭМГ, которые будут записаны.
   3. Выберите частоту дискретизации (128 Гц) на вкладке "Запись" состоянии.
   4. Проверьте выбранные каналы отображаются должным образом в го'Информация о канале "вкладка E.
   5. Выберите вкладку "настройки таймера 'и нажмите' Monitor ', чтобы отобразить ЭЭГ и ЭМГ.
   6. Проверьте, если сигналы ЭЭГ / ЭМГ отображаются корректно.
   7. Выберите вкладку "настройки таймера 'и установите время на часах на начало и конец записи в области' Главная Таймер».
   8. Нажмите кнопку "Monitor" на вкладке "настройки таймера ', чтобы начать запись.
5. Запись сигналов ЭЭГ / ЭМГ под базовой (то есть., Сон / бодрствование поведение свободно ведет себя мыши) и различные условия обработки (например,., Администрация кофеин или фиктивных лечение) в течение нескольких дней. Эвтаназии мышь внутрибрюшинной инъекцией пентобарбитала (200 мг / кг) после последнего день эксперимента.

4. Подсчет поведенческой государства на основе ЭЭГ / ЭМГ данных

1. Запустите программное обеспечение для анализа ЭЭГ / ЭМГ (стол «Материалы», ^4-й входа снизу), Откройте исходные данные ЭЭГ / ЭМГ (.kcd файлов), подготовленных в рамках этапа 3. Перейдите на вкладку "сон" и выберите Epoch время. Выберите 10 сек.
2. Щелкните вкладку "сон" и выберите "Мульти-скрининга», чтобы автоматически забить все 10 сек эпохи в 3 этапа (т.е.., NREM и REM сна, и бодрствование) на основе амплитуд ЭЭГ и ЭМГ и сила спектрального анализа ЭЭГ. ³
3. Нажмите кнопку "состояние БПФ для ЭЭГ».
4. Установите параметры для анализа спектра мощности [256 исходными точками (соответствует 2 сек ЭЭГ), функции Хеннинга окно, и в среднем на 5 спектров в эпоху]. ³ Нажмите кнопку "ОК".
5. Нажмите кнопку "Пуск Скрининг", чтобы начать автоматическую скрининг. Откройте набрал данные (.raf файлов).
6. Проверьте результаты автоматического скрининга и, при необходимости, исправить их вручную на основе стандартных критериев (см представитель результаты, рисунок 1b и таблица 1 2, 3 Кратко нажмите и удерживайте левую кнопку мыши на неправильно забил эпохи и перетащите курсор по строке неправильно забитых эпох. Отпустите левую кнопку мыши и выбрать правильный поведения государства в всплывающем окне.
   Примечание: Иногда, эпохи при переходе между двумя бдительными состояний трудно забить однозначно одного государства. В таких случаях, эпоха должна быть забит в состоянии мнимой и те же критерии должны применяться к аналогичным эпох в течение всего эксперимента, чтобы гарантировать воспроизводимость данных.

1В иллюстрирует примеры мыши ЭЭГ в различных бдительности государств. Как показано в таблице 1, эпохи, классифицируются как NREM сна, если ЭЭГ большой медленно мозговые волны с дельта ритма ниже 4 Гц и ЭМГ имеет лишь слабое или не сигнал. Эпохи, классифицируются как сна, если ЭЭГ быстрые волны мозга низковольтные в тета-диапазоне между 6 и 10 Гц, а ЭМГ показывает низкую амплитуду. Другие эпохи должны быть классифицированы как бодрствования (т.е.., Низкого до умеренного ЭЭГ напряжения и возникновение ЭМГ активности).

Например, ЭЭГ / ЭМГ настройки описано в данном протоколе могут быть использованы для определения количества сна и сон / бодрствование профиль мышей C57BL / 6 под исходных условий или после лечения с кофеином (фиг.2 и 3).

Под бУсловия aseline, мышей, которые ночные животные, выставлены четкую циркадный сон-бодрствование ритм, как видно на этих чертежах, при больших объемах сна в течение светового периода, чем во время темного (фиг.2А). Во время 12-часового периода света, мыши показали 6,7 ч и 0,9 ч NREM и REM сна, соответственно; в то время как в течение 12-часового темного периода, бодрствование было преобладающим (2В). С другой стороны, качество сна может быть оценена на основании государственной бдительности и ЭЭГ спектра мощности анализа (фиг.2С-F). Как правило, полиграфические записи ЭЭГ и ЭМГ может быть использован для определения эпизод распределение длительности, средняя продолжительность и количество переходный этап для каждого состояния бдительности (рис 2С-Е). Кроме того, спектр мощности ЭЭГ для NREM и REM сна у мышей при легкой и темное время (рис 2F) показывает сильную плотность мощности ЭЭГ в диапазоне частот 0,5 - 4 Гц и 6 - 10Гц, соответственно. Следует отметить, что ЭЭГ во время сна включает в себя небольшое количество дельта-волн (0,5 - 4 Гц), поскольку перемешаны состояния NREM сна и иногда загрязнителем.

Для оценки влияния наркотиков на поведение сон-бодрствование мышей, 24-30 ЭЭГ и ЭМГ обычно записываются в течение 2 дней подряд. Чтобы определить, например, возбуждение эффект кофеина на мышей C57BL / 6, 24 мышей обрабатывали носителем (10 мл / кг физиологического раствора; внутрибрюшинно) на 1 день в 10:00 в начале фазы световой период. Животных затем обрабатывают с кофеином (15 мг / кг) 24 ч позже, и бдительность государства были классифицированы форума в бодрствовании, сна, и NREM сна. 3А показывает типичные примеры ЭЭГ, ЭМГ и hypnograms после введения кофеин (более низкие полисомнографические панели) или транспортное средство (верхние панели полисомнографические) в C57BL / 6 мыши. Кофеин растет в ценеAsed количество бодрствования в C57BL / 6 мышей в 2,8 раза в течение 3 ч после инъекции (фиг.3В).

Рисунок 1. Сон биопроб системы для мышей.

(A) Чтобы контролировать сигналы ЭЭГ, винты из нержавеющей стали имплантируют эпидурально над лобных и теменных корковых областях 1 полушарии. Кроме того, ЭМГ-активность контролируется проволоки из нержавеющей стали, размещенных на двусторонней основе в трапециевидных мышцах. (Б) Типичные примеры ЭЭГ, ЭМГ, ЭЭГ и плотности мощности в течение 10 сек в течение NREM или REM сна или бодрствования у мыши. В NREM сна, ЭЭГ показывает большой амплитуды волны; и дельта диапазона (0,5 - 4 Гц) доминирует (слева). В быстрого сна, ЭЭГ показывает низкие волны амплитуды, с тета-диапазона (6 - 10 Гц), которые доминирующей (в центре). В бодрствования, ЕЕ. показывает малой амплитуды волны, с не частота не будучи доминирующим (справа). Сигналы ЭМГ ниже как NREM и REM сна, чем при бодрствовании. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2. сон-бодрствование Профили под исходными условиями в C57BL / 6 мышей оценивали по ЭЭГ / ЭМГ Recordings.

(А) изменения времени курс в часовом суммы каждого поведенческого этапа. Белые и черные полосы выше х -axes указать светлые и темные периоды, соответственно. (Б) Общая сумма каждого этапа в течение 12 часов показывает большее количество NREM и REM сна в течение светового периода по сравнению с, что в темное время суток. (С) Распределение еПродолжительность pisode каждого этапа. (D) Средняя длительность каждого этапа дольше бодрствования в темное время. (Е) Стадия-переход число каждого этапа показывает более частые переходы в течение светового периода. (F), ЭЭГ спектр мощности во время NREM и фаза быстрого сна существенно не показывает плотность мощности различия между светлыми и темными периодами. Данные представлены в виде среднего значения ± SEM (n = 5). * Р <0,05, ** р <0,01, по оценке т теста в паре двух Стьюдента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3. Возбуждение Влияние кофеина на ЭЭГ Начисленные / EMG Recordings.

(А) Типичные примеры ЭЭГ, ЭМГ и hypnograms после введения транспортного средства (верхняя панель) или кофеина в дозе 15 мг / кг (нижняя панель). (B) Время курсов бодрствование у мышей, получавших кофеин. (C) бодрствования в течение 3-часового после инъекции кофеина. Данные представлены в виде среднего значения ± SEM (n = 5). ** Р <0,01 по сравнению с инъекцией транспортного средства, по оценке т теста в паре двух Стьюдента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Таблица 1: Общие критерии забьют поведенческой государства по ЭЭГ / ЭМГ сигналов.

Авторы Юдзиро Таугучи и Саяка Кохто являются сотрудниками компании Kissei Comtech Co., Ltd, которая разрабатывает программное обеспечение SleepSign для сбора и автоматической оценки данных ЭЭГ/ЭМГ, используемых в этой статье.