Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Высокочувствительного анализа для измерения ареновирус-клеток Вложение

7.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/53682

⸱

2 марта 2016 г.

 , 
1Department of Medicine, Division of Immunobiology, University of Vermont, 2Department of Microbiology & Molecular Genetics, University of Vermont

В этой статье

Краткое содержание

Первым шагом в жизненном цикле аренавируса является прикрепление вирусных частиц к клеткам-хозяевам. Мы сообщаем о количественном анализе на основе (q)RT-ПЦР для сверхчувствительного обнаружения и количественной оценки событий прикрепления аренавируса.

Аннотация

Arenaviruses — семейство оболочечных РНК-вирусов, вызывающих тяжелое заболевание человека. Первым этапом в жизненном цикле аренавируса является прикрепление вирусных частиц к клеткам хозяина. В то время как прикрепление вируса к клетке может быть измерено с помощью вирионов, меченных биотином, радиоактивными изотопами или флуоресцентными красителями, эти подходы обычно требуют высокой множественности инфекции (MOI) для обнаружения связанного вируса. Мы описываем количественный анализ на основе (q)ОТ-ПЦР, который измеряет прикрепление штамма вируса Хунин Candid 1 путем количественного определения упакованной вирусной геномной РНК вируса. Этот анализ имеет несколько преимуществ, включая его чрезвычайную чувствительность и способность измерять прикрепление в большом динамическом диапазоне MOI без необходимости очистки или маркировки входного вируса. Важно отметить, что этот подход может быть легко адаптирован для использования с другими вирусами за счет использования вирус-специфичных реагентов qRT-PCR. Кроме того, этот анализ может быть модифицирован для измерения эндоцитоза частиц и раскрытия оболочки генома. В заключение мы описываем простой, но надежный анализ для высокочувствительного измерения прикрепления аренавируса к клеткам.

Введение

Аренавирусов представляют собой семейство оболочечных, одноцепочечных РНК -содержащих вирусов, которые обслуживаются в первую очередь у грызунов в природе 1-3. В то время как эти вирусы , как правило , устанавливают бессимптомное, хроническую инфекцию в грызунах водохранилищах 1,2, они могут вызвать серьезные заболевания у людей 3. Важные патогенные виды включают вирус New World Хунин (JUNV) 4 и вирус Ласса Старого Света 5, которые являются этиологическими агентами аргентинской геморрагической лихорадки в Южной Америке и лихорадки Ласса в Африке, соответственно. Лимфоцитарный вирус хореоменингита (LCMV), то прототипичный вирус семейства 6, имеет распространение во всем мире и отвечает за множества болезненных состояний , включая асептического менингита у иммунокомпетентных лиц 6, тяжелых врожденных дефектов развития плода 7 или высокой летальностью иммунодефицитом лица , следующие твердых трансплантации органов. 8,9 Отсутствие Соединенных ШтатовПищевых продуктов и медикаментов (FDA) вакцины или обсуждения и эффективные противовирусные средства для борьбы с этими вирусами подчеркивает острую необходимость в разработке новых стратегий терапевтически предназначаться для этих новых / повторно возникающих патогенных микроорганизмов.

Ареновирус геном состоит из двух одноцепочечных РНК - сегментов, большой (L) (~ 7,2 кб) и малых (S) (~ 3,6 кб) сегментов 10. Сегмент S кодирует вирусный нуклеопротеид (NP) и гликопротеин оболочки (GP) а сегмент L кодирует вирусной полимеразы (L) и матричный белок (Z). L и S геномные сегменты РНК (vRNAs) упакованы в вирионы 10-12. Начальная стадия ареновирус инфекции является прикрепление вирусных частиц к клеткам - хозяевам , через взаимодействие между вирусным GP и ее соответствующими рецепторами клеток - хозяев , которые, для JUNV, включающего человеческий рецептор трансферрина 1 (hTfR1) 13,14. После присоединения частицы JUNV взяты в клетку с помощью клатрин-эндоцитоза 15.Частицы затем трафика на поздних эндосом , где низкое значение рН этого отделения вызывает активацию GP 16,17. После активации GP-кодируемого слитого пептидные вставки в эндосомный мембраны, инициируя слияние между вирусными и эндосомальных мембран. Успешные результаты слияния в выпуске вириона упакованной vRNAs в цитоплазму, где они служат в качестве шаблонов для геномной репликации и транскрипции. Когда достаточное количество вирусных структурных белков и vRNAs образуются новые частицы собираться и бутон из инфицированной клетки , чтобы завершить жизненный цикл 18.

Для того, чтобы облегчить открытие новых стратегий для терапевтических целевых патогенных аренавирусов, наша группа была сосредоточена на выявлении факторов-хозяев, которые имеют решающее значение для распространения вируса, но необязательны для хозяина. В этом контексте, определяя точную стадию (и) жизненного цикла вируса под контролем таких факторов хозяина необходимо направлятьразработка противовирусных стратегий. Здесь мы опишем количественный (Q) ОТ-ПЦР-анализ , который может быть использован для измерения прикрепление ареновирус-клеток с целью идентификации влияют ли определенные белки , принимающие и / или противовирусные молекулы этой начальной стадии проникновения вируса 19. Альтернативные подходы к оценке вложения ареновирус-клеток фигурируют вирионов , меченные биотином 20, флуоресцентных красителей 21 или радиоактивных изотопов 22. Недостатками этих методов может включать требование больших количеств вируса ввода (например , высокая кратностью инфекции (MOI)), использование радиоактивности и / или дополнительных шагов обработки для подготовки ввода вируса (например , концентрацию и / или маркировки вируса) , В частности, использование высокой MOI делает его трудно отличить производительным по сравнению с непроизводственных вложений событий 15,23. QRT-PCR на основе анализа, описанную здесь можно обнаружить крепления события, используя всего лишь 20 зубной налет дляMing единиц (Pfus) вируса, который переводит в МВД 0,0004 для 48-луночного планшета. Таким образом, сильная чувствительность анализа преодолевает требование высокой MOI, а также любые вирусы маркировки или концентрации шагов. Кроме того, анализ может быть я), предназначенный для измерения вириона эндоцитоз, а также высвобождение вирусного генома в цитоплазму следующие слияния и II) специально для использования с другими вирусами через развитие вирус-специфических QRT-реагентов для ПЦР (примеры см 24-27).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Примечание: Очень важно , что описанный протокол проводиться с использованием строгой методики предварительной ПЦР (см 28 для прекрасный обзор о том , как создать лабораторию предварительной ПЦР и как проводить эксперименты с использованием хорошей техники предварительной ПЦР). Крайне важно, чтобы все реагенты и оборудование свободны от амплифицированной ДНК, содержащей целевую последовательность КПЦР и что соответствующие элементы на месте обнаружения такого загрязнения. Обзор протокола показан на рисунке 1.

1. Подготовка носителя и семя клеток в 48-луночные планшеты

  1. Приготовьте 500 мл полной Дульбекко в модификации Дульбекко (DMEM), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, 1% пенициллина-стрептомицина и 1% HEPES (N-2-гидроксиэтилпиперазин-N-2-этансульфоновой кислоты) буферного раствора путем добавления 50 мл из инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки и 5 мл каждого из 100х пенициллин-стрептомицина и 100x HEPES буферный раствор до 500 мл бутылку DMEM. Этот реагент можно хранить при температуре 476; C в течение нескольких месяцев.
  2. Семенной 2,5 х 10 4 Vero E6 клеток на лунку в 48-луночный планшет для культивирования тканей в конечном объеме 500 мкл полной среды DMEM. Инкубируйте планшет при 37 ° С в увлажненном инкубаторе , содержащем 5% CO 2 в течение 10 до 18 часов.
    1. Семенной пластину в конце рабочего дня. Проверьте каждый образец вируса как в двух или трех повторностях скважин.
      Примечание: В то время как 48-луночный на основе платформы для этого анализа описана, она должна быть возможность масштабировать анализ вниз для использования в 96-или 384-луночных планшетах.

2. Провести Вирус-клеточное Вложений:

Примечание: вирус , используемый в данном протоколе, штамм JUNV Откровенный # 1 (C # 1), был успешно использован в качестве живой ослабленной вакцины для профилактики заболевания JUNV 29. JUNV C # 1 был получен из вирулентного штамма JUNV через XJ последовательного прохождения как в естественных условиях и в пробирке и отличается от исходного штамма на 12 XJ аминокислот 30. Becausе JUNV C # 1 является уровень биологической безопасности (BSL) -2-номинальная патоген, работа , описанная в данном разделе должны выполняться с использованием соответствующих BSL-2 практики 31. Это включает в себя использование средств индивидуальной защиты (например , средства защиты глаз, лабораторный халат, двойные перчатки), кабинет биологической безопасности II класса, а также обеспечение того , чтобы все сотрудники получили организационную подготовку и согласований , необходимых для безопасного обращения этого организма.

  1. Развести JUNV C # 1 образца (ов), подлежащих испытанию до желаемого Pfus или фокус-образующих единиц в ледяном полной DMEM и хранить на льду до готовности добавить в каждую лунку.
    Примечание: В качестве альтернативы проведения исследования связывания с вирусом, разведенного в полной среде DMEM, используют минимальную среду, содержащую PBS с пониженной концентрацией сыворотки (2%) и соответствующий буфер, чтобы установить, может ли сыворотка вызвать помехи с приложением вируса. Подобные протоколы для крепления альтернативных вирусов сообщили об использовании RPMI 1640 без bicarboНат , содержащий 0,2% бычьего сывороточного альбумина, 10 мМ (2- (морфолино) этансульфоновой кислоты), и 10 мМ HEPES, рН 6,8 32. Эта привязка носитель может быть выше , чтобы предотвратить изменение рН , которые могут возникнуть , когда носитель удаляется из СО 2 Окружающая среда инкубатора.
    1. Привить скважин с Pfus в диапазоне от 200 до 2000, чтобы ограничить непродуктивные события вложений. Как показано на фиг.2, этот анализ способен обнаруживать прикрепление с помощью всего лишь 20 БОЕ (или целых 2 х 10 6 БОЕ).
    2. Создание мастер-микс вируса для инокуляции клеток. Каждый образец вируса будет высевают на дублированных лунках в объеме 50 мкл на лунку. Таким образом, если добавление 2000 Pfus вируса на лунку желательно, разбавленные 4,800 Pfus в общем объеме 120 мкл охлажденного льдом полной DMEM.
      1. Для контроля специфичности анализа, использовать подобранную пару китайского хомячка клеточных линий яичника, которые либо не выразить TfR1 (TRVb) или ехрССГ hTfR1 (TRVb-1) в качестве JUNV присоединения к этим клеткам должны быть либо сокращены или нет, соответственно , 13,33. В качестве альтернативы, лечить клетки с протеазой , такой как протеиназы К , чтобы предотвратить ареновирус вложение 34 или 35 запись. Растворимый hTfR1 или monocolonal ch128.1 антитело, которое является специфическим для hTfR1, также могут быть рассмотрены , как они известны , чтобы блокировать проникновение в клетки JUNV 13,36. Кроме того, предварительная обработка клеток с свободной маннозы 14 или инкубации частиц с JUNV специфических нейтрализующих антител 37 может ингибировать проникновение вирусов.
      2. Обратите внимание, однако, что эти последние реагенты и подходы, несмотря на блокирование вход JUNV, не были подтверждены, чтобы блокировать вложение, хотя это вероятное объяснение. Протокол, описанный здесь, может быть использован для формально определить, являются ли эти различные подходы прикрепления воздействие вирионов.
  2. Удалить пластины из 37 ° C инкубатора ипоместить либо в C холодильнике 4 ° или на льду в течение 15 мин, чтобы ингибировать способность посеянных клеток осуществлять эндоцитоз.
  3. Далее, аспирация полный DMEM из каждой лунки и быстро промыть каждую лунку дважды с использованием 100 мкл охлажденного льдом PBS (фосфатно-солевого буферного раствора) с рН 7,4. Затем добавьте 50 мкл предварительно разбавленных образцов вируса (полученного на стадии 2.1) в соответствующие лунки.
  4. Оберните пластину в полиэтиленовую пленку и немедленно поместить либо обратно на лед или в 4 ° C холодильнике в течение от 1 до 1,5 часа, чтобы позволить произойти прикрепление вируса. Держите тарелку, промывочный буфер и образцы вируса холода при температуре 4 ° C в течение этого шага.
  5. После завершения 4 ° C Инкубационный, аспирация вирус прививочный материал и промыть каждую лунку 3 раза с 200 мкл охлажденного льдом PBS.

3. Вирусный Экстракция РНК

  1. Очищают вирусной РНК из JUNV C # 1 частицы , прикрепленные к монослоя с помощью коммерческого набора (например, RNeasy Mini Kit) Accorдинь с протоколом производителя. В частности, следить за "очистку тотальной РНК из клеток животных с использованием протокола спиновой технологии" на страницах 23-28 в мини - справочнике RNeasy (4 - е издание, апрель 2006 г.) с изменениями , перечисленных ниже.
    1. Лизировать клетки, направленные на стадии 1В путем добавления 350 мкл буфера для лизиса RLT непосредственно в каждую лунку. Смешайте буфер несколько раз, чтобы обеспечить лизис клеток. Следует отметить, что клетки легко лизируют в этом буфере и полный лизис может быть проверена с помощью смотровых колодцев под инвертированным микроскопом.
    2. Передача в результате клеточного лизата к колонке набора (этап 3a) и следовать остальной части протокола, как описано. В этот момент, как вирус был нейтрализован буфера для лизиса таким образом остальные стадии протокола может быть сделано вне шкафа биологической безопасности класс II при условии, что комплект трубок не были заражены вирусом инфекционного.
    3. Включите дополнительный шаг 9 из протокола производителя, который является добавки из растиРациональная центрифугирование спиновой колонке для устранения возможного унос буфера ППД.
    4. На заключительном этапе протокола производителя (этап 10), элюировать очищенную РНК из колонки спина с использованием 30 мкл нуклеазы без DDH 2 O. Магазин РНК при -80 ° С в этом пункте, или использовать непосредственно в анализе QRT-PCR. Для того, чтобы предотвратить деградацию очищенных вирусных образцов РНК с помощью нуклеазы, используют нуклеазы реагенты и оборудование, и держать размораживают образцов РНК на льду.
      Примечание: Буферы RLT и RW1 содержат соли гуанидина и не должны быть смешаны с отбеливателем. Буфер RW1 содержит этанол.

4. QRT-PCR Измерение вирусного генома

  1. Для преобразования JUNV C # 1 S сегмента РНК в кДНК для последующего КПЦР, подвергнуть вирусной РНК (генерируемый на этапе 3.1.4) в РТ в общем объеме 50 мкл.
    1. Чтобы настроить реакцию RT, сначала необходимо создать мастер-смеси, содержащей каждый из следующих реагентов в реакции: 6,75 мкл нуклеазы-бесплатно DDH 2 O, 5 мкл 2 мкМ запаса праймера S RT 2098- до 2075- (5'-AAGGGTTTAAAAATGGTAGCAGAC-3 '), который является дополнением к НП области S сегмента геномной РНК, 5 мкл 10Х ПЦР - буфера II, 11 мкл раствора 2 мМ MgCl 25, 1,25 мкл (62,5 единиц) фермента RT 1 мкл (0,4 единиц) ингибитора РНКазы и 10 мкл 500 мкМ дНТФ запаса.
      Примечание: Во время ареновирус репликации, 4 вид вируса S сегмент РНК образуются: полноразмерным геномную РНК (вРНК), полная длина антигеномного РНК (vcRNA) (то есть обратное дополнение к вРНК), а также два субгеномных мРНК кодирующие гены NP и GP, соответственно. RT праймер, перечисленные здесь имеет место только для сегмента S вРНК, но не vcRNA, мРНК NP, или мРНК GP.
    2. Аккуратно перемешать основной смеси RT и затем аликвоту 40 мкл в отдельные 0,2 мл ПЦР-пробирки. Добавьте 10 мкл вирусной РНК в каждую пробирку. Включают я) Нет управления шаблон трубки (например ,. Добавить 10 мкл нуклеазы без DDH 2 O до 40 мкл основной смеси) и II) в отсутствии контроля фермента RT (например , добавить 10 мкл заведомо положительного образца вирусной РНК в 40 мкл основной смеси , которые не получали любой фермент РТ) для скрининга загрязнения реагентов RT с амплифицированной ДНК, содержащей вирусную последовательность-мишень. Включают РНК, выделенной из неинфицированных клеток с полной RT мастер-смеси для контроля за Специфичность анализа в присутствии клеточной РНК.
    3. Кроме того, включают в себя заведомо положительный вирусный образец РНК в полной смеси мастер-микс, чтобы проверить качество реагентов RT. Следует отметить, что объем реакционной смеси RT может быть снижена до 25 мкл, при необходимости.
  2. Subject трубы RT для следующих условий езды на велосипеде: 25 ° C в течение 10 мин, 48 ° С в течение 30 мин и 95 ° С в течение 5 мин. Следует отметить, что образцы можно хранить при -20 ° С в этой точке или оставляют на ночь в амплификатор, добавив шаг 4 ° C.
  3. пerform КПЦР в общем объеме 25 мкл.
    1. Сделать мастер смеси КПЦР путем объединения следующий: 2,5 мкл (в соотношении 9 мкМ акций) каждого прямого праймера ПЦР S1937 + до 1958+ (5'-CATGGAGGTCAAACAACTTCCT-3 ') и обратного праймера PCR S 2001- в 1982- (5 '-GCCTCCAGACATGGTTGTGA-3'), 2,5 мкл (из 2 мкМ запаса) от КПЦР зонда S 1960+ с 1975+ (5'-6FAM-ATGTCATCGGATCCTT-MGBNFQ-3 '), и 12,5 мкл мастер 2X универсальный КПЦР смешивание. Следует отметить , что прямой праймер сообщалось здесь, который является специфическим для JUNV C # 1, отличается от 1 нт от первоначально сообщалось праймера последовательности 38, которая ориентирована на яростную JUNV штамма Ромеро.
    2. Аккуратно перемешать раствор и затем добавляют 20 мкл в каждую кПЦР хорошо. Добавьте по 5 мкл каждой реакционной смеси RT в соответствующие КПЦР скважин. Проведение КПЦР в трех экземплярах для каждого испытуемого образца. Обратите внимание, что при необходимости объем реакции ПЦР может быть уменьшена до всего лишь 12,5 мкл.
      Примечание: программное обеспечение, связанное смашина КПЦР будет генерировать абсолютные числа копий JUNV C # 1 S сегмента геномной РНК путем сравнения значения каждого неизвестного образца к серии стандартных разведений плазмиды, кодирующей JUNV С # 1 NP гена, который является объектом праймера КПЦР и зонд установлен. Анализ КПЦР может обеспечить только количественное определение значений, которые находятся в пределах диапазона стандартной кривой. По этой причине, включают в себя следующие количества плазмид (в трех лунках): 5, 50, 5 х 10 3, 5 × 10 5 и 5 х 10 7 копий на каждую лунку.
  4. Вставьте пластину КПЦР в амплификатор и запустить следующие реакционные условия: 95 ° C в течение 10 мин и 40 циклов при 95 ° С в течение 15 с и 60 ° С в течение 1 мин.
    1. Сбор и анализ данных для определения количества вирусной РНК, присутствующего в каждом образце в соответствии с протоколом производителя.
  5. Для того, чтобы установить стандартную кривую, используя недавно очищенный образец плазмиды, содержащей смолу КПЦРполучить последовательность, сначала необходимо определить число копий плазмиды в этом растворе.
    1. Вычислить молекулярную массу плазмиды. Если последовательность всей плазмиды, как известно, его вычислить по следующей формуле: ММ = ([А * 312,2] + [G * 328,2] + [C * 288,2] + [T * 303,2] - 61,13). Не забудьте включить общее количество конкретного нуклеотида, найденной на каждой цепи двухцепочечной плазмиды.
    2. Если размер плазмиды известен, но его точная последовательность не вычислите MW в предположении, что каждая пара оснований двухцепочечной ДНК имеет MW 600.
      Примечание: NP плазмиду pCAGGS-JUNV C # 1 , используемый здесь имеет МВт 4,2 х 10 6.
    3. После того, как МВТ плазмиды было установлено, вычислить, сколько копий на мкл присутствуют в запас раствора плазмиды.
    4. Во- первых рассчитать общую мкг плазмиды в растворе, а затем преобразовать это число молей плазмиды (например , если 69 мкг плазмиды, содержатся в 300 мкл воды, затем 6,9 х 10 -5 г плазмидной * 1 моль / 4,2 х 10 6 мкг плазмиды = 1,6 · 10 -11 моль плазмиды), которые могут быть преобразованы , чтобы скопировать номер (например , 1,6 × 10 -11 моль плазмиды * 6.022 х 10 23 молекул / моль = 9,8 × 10 12 молекул (или их копии)).
    5. Разделите общее число копий плазмиды в плазмиде растворе по объему этого раствора , чтобы получить копий в мкл (например , 9.8 × 10 12 копий / 300 мкл = 3,28 · 10 10 копий).
    6. Развести это решение соответствующим образом так, что 5 мкл объемы могут быть загружены на пластину ПЦР, чтобы поставить диапазон числа копий, необходимых для создания стандартной кривой.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Чтобы продемонстрировать чувствительность и динамический диапазон анализа КПЦР, известные количества плазмиды , кодирующей ген НП JUNV C # 1 (диапазон 5-5 х 10 7 экземпляров) были подвергнуты кПЦР , как описано в разделе 4 протокола. Анализ чувствителен и может надежно обнаружить всего лишь 5 копий нуклеиновой кислоты - мишени (рисунок 2). Кроме того, динамический диапазон анализа велик и, как показано на рисунке 2, может покрывать , по меньше...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Протокол мы описываем прост и надежный при соблюдении следующих критических соображений. Во- первых, необходимо применять строгие предварительно ПЦР метод (см 28 для отличного обзора). Крайне важно, чтобы все реагенты и оборудование свободны от амплифицированной ДНК, содержащей целевую последовательность КПЦР и что соответствующие элементы на месте обнаружения такого загрязнения. Во-вторых, для крепежной части вирус-клетка протокола, вирус, клетки, и средства массовой информации должны храниться при температу...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Мы благодарим Маркус Thali, Натан Рой, Кристофер Ziegler, Эмили Брюс, и Бенджамин Кинг за полезные обсуждения и Национальным институтом здравоохранения для поддержки этих исследований через гранты T32 AI055402 (JK), R21 AI088059 (JB), и P20RR021905 (JB) ,

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
DMEMLife Technologies11965-118
Пенициллин-стрептомицинLife Technologies15140-163100x
HEPES Буферный раствор LifeTechnologies15630-130100x
PBS pH 7.4Life Technologies10010-0231x
Vero E6 клеткиАмериканская коллекция типовых культурCRL-1586
Costar 48-луночный планшетCorning3548
RNeasy mini kitQiagen74106не смешивать буферы RLT или RW1 с отбеливателем
QIAизмельчитель гомогенизаторQiagen79654
Taqman Universal PCR Master MixLife Technologies4326614
Multiscribe Reverse Transcriptase (50U/&микро; l)Life Technologies4311235
смесь dNTP (10 мМ; 2,5 мМ каждый dNTP)Life TechnologiesN808-0260
GeneAmp 10X PCR Buffer II и 25 мМ раствор MgCl2Life TechnologiesN808-0010
РНКазный ингибитор (5000U/100; l)Life TechnologiesN808-0119
RT грунтовка 5'-AAGGGTTTAAAAAT
GGTAGCAGAC-3'		Integrated DNA Technologies250 нмоль ДНК олигостандартное обессоливание
Forward qPCR primer  5'-CATGGAGGTCAAACAACTTCCT-3'Life Technologies4304971обратного обессоливания
5'-GCCTCCAGACATGGTTGTGA-3'Life Technologies4304971стандартный обессоливающий
зонд TaqMan 5'-6FAM-ATGTCATCGGATCCTT-MGBNFQ-3'Life Technologies4316033
96-луночная реакционная пластина MicroAmp Fast Optical от ВЭЖХ (0,1 мл)Life Technologies4346906
для ПЦР в реальном времени StepOnePlusLife Technologies4376598или другой прибор для количественной ПЦР
стандартный праймер для система

Ссылки

  1. Childs, J. C., Peters, C. J. The Arenaviridae. Salvato, M. S. , Plenum Press. 331-373 (1993).
  2. Salazar-Bravo, J., Ruedas, L. A., Yates, T. L. Mammalian reservoirs of arenaviruses. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 262, 25-63 (2002).
  3. Buchmeier, M. J., de la Torre, J. C., Peters, C. J., et al. Ch. 50. Fields Virology. Knipe, D. M. 2, Wolters Kluwer Health/Lippincott Williams & Wilkins. 1791-1827 (2007).
  4. Parodi, A. S., et al. Sobre la etiologia del brote epidemico de Junin (Nota previa). Dia Medico. 30, (1958).
  5. Frame, J. D., Baldwin, J. M., Gocke, D. J., Troup, J. M. Lassa fever, a new virus disease of man from West Africa. I. Clinical description and pathological findings. Am. J. Trop. Med. Hyg. 19, 670-676 (1970).
  6. Buchmeier, M. J., Zajac, A. J. Lymphocytic Choriomenigitis Virus. , John Wiley & Sons Ltd. (1999).
  7. Barton, L. L., Mets, M. B., Beauchamp, C. L. Lymphocytic choriomeningitis virus: emerging fetal teratogen. Am. J. Obstet. Gynecol. 187, 1715-1716 (2002).
  8. Fischer, S. A., et al. Transmission of lymphocytic choriomeningitis virus by organ transplantation. N. Engl. J. Med. 354, 2235-2249 (2006).
  9. Palacios, G., et al. A new arenavirus in a cluster of fatal transplant-associated diseases. N. Engl. J. Med. 358, 991-998 (2008).
  10. Meyer, B. J., de la Torre, J. C., Southern, P. J. Arenaviruses: genomic RNAs, transcription, and replication. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 262, 139-157 (2002).
  11. Meyer, B. J., Southern, P. J. Sequence heterogeneity in the termini of lymphocytic choriomeningitis virus genomic and antigenomic RNAs. J. Virol. 68, 7659-7664 (1994).
  12. Haist, K., Ziegler, C., Botten, J. Strand-Specific Quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction Assay for Measurement of Arenavirus Genomic and Antigenomic RNAs. PLoS One. 10, e0120043(2015).
  13. Radoshitzky, S. R., et al. Transferrin receptor 1 is a cellular receptor for New World haemorrhagic fever arenaviruses. Nature. 446, 92-96 (2007).
  14. Martinez, M. G., et al. Utilization of human DC-SIGN and L-SIGN for entry and infection of host cells by the New World arenavirus, Junin virus. Biochem. Biophys. Res. Commun. 441, 612-617 (2013).
  15. Martinez, M. G., Cordo, S. M., Candurra, N. A. Characterization of Junin arenavirus cell entry. J. Gen. Virol. 88, 1776-1784 (2007).
  16. Martinez, M. G., Forlenza, M. B., Candurra, N. A. Involvement of cellular proteins in Junin arenavirus entry. Biotechnol J. 4, 866-870 (2009).
  17. Nunberg, J. H., York, J. The Curious Case of Arenavirus Entry, and Its Inhibition. Viruses. 4, 83-101 (2012).
  18. Botten, J., King, B., Klaus, J., Zielger, C. Viral Hemorrhagic Fevers. , CRC Press. 233-260 (2013).
  19. Klaus, J. P., et al. The intracellular cargo receptor ERGIC-53 is required for the production of infectious arenavirus, coronavirus, and filovirus particles. Cell Host Microbe. 14, 522-534 (2013).
  20. Rojek, J. M., Perez, M., Kunz, S. Cellular entry of lymphocytic choriomeningitis virus. J. Virol. 82, 1505-1517 (2008).
  21. Lavanya, M., Cuevas, C. D., Thomas, M., Cherry, S., Ross, S. R. siRNA screen for genes that affect Junin virus entry uncovers voltage-gated calcium channels as a therapeutic target. Sci Transl Med. 5, 204ra131(2013).
  22. Ellenberg, P., Edreira, M., Scolaro, L. Resistance to superinfection of Vero cells persistently infected with Junin virus. Arch. Virol. 149, 507-522 (2004).
  23. Brandenburg, B., et al. Imaging poliovirus entry in live cells. PLoS Biol. 5, e183(2007).
  24. Petersen, J., et al. The Major Cellular Sterol Regulatory Pathway Is Required for Andes Virus Infection. PLoS pathogens. 10, e1003911(2014).
  25. Jonsson, N., Gullberg, M., Israelsson, S., Lindberg, A. M. A rapid and efficient method for studies of virus interaction at the host cell surface using enteroviruses and real-time PCR. Virol J. 6, 217(2009).
  26. Jiang, J., et al. Hepatitis C virus attachment mediated by apolipoprotein E binding to cell surface heparan sulfate. J. Virol. 86, 7256-7267 (2012).
  27. Shannon-Lowe, C., et al. Epstein-Barr virus-induced B-cell transformation: quantitating events from virus binding to cell outgrowth. J. Gen. Virol. 86, 3009-3019 (2005).
  28. Mifflin, T. E. Setting up a PCR laboratory. CSH Protoc. 2007, pdb top14(2007).
  29. Maiztegui, J. I., et al. Protective efficacy of a live attenuated vaccine against Argentine hemorrhagic fever. AHF Study Group. J. Infect. Dis. 177, 277-283 (1998).
  30. Goni, S. E., et al. Genomic features of attenuated Junin virus vaccine strain candidate. Virus Genes. 32, 37-41 (2006).
  31. Chosewood, L. C., Wilson, D. E. Centers for Disease Control and Prevention (U.S.). Biosafety in microbiological and biomedical laboratories. , 5th edn, U.S. Dept. of Health and Human Services, Public Health Service, Centers for Disease Control and Prevention, National Institutes of Health. (2009).
  32. White, J., Matlin, K., Helenius, A. Cell fusion by Semliki Forest, influenza, and vesicular stomatitis viruses. J. Cell Biol. 89, 674-679 (1981).
  33. McGraw, T. E., Greenfield, L., Maxfield, F. R. Functional expression of the human transferrin receptor cDNA in Chinese hamster ovary cells deficient in endogenous transferrin receptor. J. Cell Biol. 105, 207-214 (1987).
  34. Borrow, P., Oldstone, M. B. Characterization of lymphocytic choriomeningitis virus-binding protein(s): a candidate cellular receptor for the virus. J. Virol. 66, 7270-7281 (1992).
  35. Rojek, J. M., Spiropoulou, C. F., Kunz, S. Characterization of the cellular receptors for the South American hemorrhagic fever viruses Junin, Guanarito, and Machupo. 346. , 476-491 (2006).
  36. Helguera, G., et al. An antibody recognizing the apical domain of human transferrin receptor 1 efficiently inhibits the entry of all new world hemorrhagic Fever arenaviruses. J. Virol. 86, 4024-4028 (2012).
  37. Sanchez, A., et al. Junin virus monoclonal antibodies: characterization and cross-reactivity with other arenaviruses. J. Gen. Virol. 70, 1125-1132 (1989).
  38. Trombley, A. R., et al. Comprehensive panel of real-time TaqMan polymerase chain reaction assays for detection and absolute quantification of filoviruses, arenaviruses, and New World hantaviruses. Am. J. Trop. Med. Hyg. 82, 954-960 (2010).
  39. Helenius, A., Marsh, M., White, J. Inhibition of Semliki forest virus penetration by lysosomotropic weak bases. J. Gen. Virol. 58 (Pt 1), 47-61 (1982).
  40. Nour, A. M., Li, Y., Wolenski, J., Modis, Y. Viral membrane fusion and nucleocapsid delivery into the cytoplasm are distinct events in some flaviviruses. PLoS pathogens. 9, e1003585(2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Прикрепление аренавирусаанализ qRT-ПЦРколичественное определение вирусной РНКсвязывание вируса с клеткамивирус Хунин Candid 1клетки Vero E6набор для изоляции РНКопределение методом кПЦРбокс биологической безопасностиэкстракция вирусной РНК
Высокочувствительного анализа для измерения ареновирус-клеток Вложение
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.