Вот протокол для выращивания плюрипотентных стволовых клеток (PSC) и нейральных стволовых клеток (NSC) в закрытой системе культивирования клеток, который обеспечивает максимальную стерильность и воспроизводимость, заменяя традиционный шкаф биобезопасности и инкубатор. Это оборудование соответствует требованиям надлежащей клинической производственной практики (cGMP) и надлежащей клинической лабораторной практики (cGLP).
Методическая статья
Культивирование Человеческий плюрипотентных и нервные стволовые клетки в замкнутой системе клеточной культуре фундаментальных и доклинических исследований
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
В этой статье описывается, как использовать изготовленную на заказ, коммерчески доступную закрытую систему культивирования клеток для фундаментальных и доклинических исследований. Шкафы биобезопасности (БСК) и инкубаторы уже давно являются стандартом для культивирования и расширения клеточных линий для фундаментальных и доклинических исследований. Однако, поскольку фокус многих лабораторий стволовых клеток смещается с фундаментальных исследований на клиническую трансляцию, к системе культивирования клеток предъявляются дополнительные требования. Все процессы должны быть хорошо задокументированы и соответствовать исключительным требованиям к стерильности и воспроизводимости. В традиционных инкубаторах концентрация газов и температура колеблются в широких пределах каждый раз, когда клетки удаляются для кормления, прохождения или других манипуляций. Такие перебои приводят к созданию среды, которая не соответствует стандартам cGMP и GLP. Эти прерывания должны быть сведены к минимуму, особенно когда клетки используются в терапевтических целях. Мотивацией для перехода от стандартной системы BSC и инкубатора к закрытой системе является то, что такие перерывы могут быть незначительными. Закрытые системы обеспечивают рабочее пространство для кормления и манипулирования клеточными культурами, а также для их содержания в контролируемой среде, где температура и концентрация газов являются постоянными. Таким образом, плюрипотентные и мультипотентные стволовые клетки могут поддерживаться в оптимальном состоянии здоровья с момента их образования до их возможного использования в терапии.
Введение
Стандартные методы культивирования стволовых клеток страдают от нескольких ограничений окружающей среды, которые создают чрезмерную нагрузку на клетки и подвергают клетки неприемлемым рискам заражения. К числу стрессов, которые клетки могут испытывать в стандартных условиях клеточной культуры, относятся резкие изменения уровней углекислого газа и концентраций кислорода3,4. Это происходит, когда клетки перемещаются из инкубатора в шкаф биобезопасности и/или микроскоп, что может быть не оптимальным для клеток. Предыдущие исследования подтвердили преимущества культивирования как плюрипотентных, так и нейральных стволовых клеток в условиях гипоксии4,11, и для достижения наилучших результатов эти условия должны быть непрерывными. Кроме того, риск клеточного загрязнения выше, поскольку лабораторная среда и персонал воздействуют на клетки почти на каждом этапе их культивирования и манипуляций. Традиционные чистые помещения представляют собой один из эффективных методов значительного снижения риска загрязнения, но они дороги, занимают большую площадь и не устраняют стрессовые факторы, связанные с концентрацией углекислого газа и кислорода.
Предприятие по производству клеток, которое может учитывать как риски загрязнения, так и концентрации газов и которое может быть квалифицировано в соответствии с критериями cGMP9, обеспечивает высокое качество клеток для фундаментальных научных исследований, а также для клинического применения1,6,7. Такое предприятие по производству клеток состоит, как минимум, из следующих компонентов: технологическая камера, которая выступает в качестве отапливаемого рабочего пространства для кормления и манипуляций с клеточными культурами; ламинарный проточный колпак для первичной стерилизации реагентов, трубок и инструментов; две буферные шлюзовые камеры между колпаком и технологической камерой; два инкубатора для клеточных культур, доступ к которым осуществляется из технологической камеры; камера микроскопа, примыкающая к технологической камере; и, наконец, компьютерное программное обеспечение для установки и мониторинга условий в этих модулях. Используя эту базовую инфраструктуру, можно выполнять широкий спектр задач, таких как стандартное кормление и пассирование плюрипотентных стволовых клеток и мультипотентных нейральных стволовых клеток, а также более специализированные методы, такие как перепрограммирование на основе вируса Сендая, исследования миграции in vitro и дифференцировка нейральных стволовых клеток для электрофизиологической характеристики.
Протокол
1. Первоначальная настройка
- Установка и температуры газа Концентрации
- С помощью программного обеспечения, перейдите на вкладку "Гость", расположенную в верхнем левом углу графического интерфейса. Вход в систему с помощью назначенного имени пользователя и пароля. Убедитесь, что каждый пользователь имеет свое собственное имя пользователя и пароль.
- Нажмите на модуль для настройки (Рисунок 1). В новом окне отображаются текущие настройки, нажмите на существующем O 2 значения уставки ниже "Установить точку" и введите требуемое O 2 уровень концентрации для этого модуля. Введите 5% O 2 , если плюрипотентные стволовые клетки будут выращиваться или манипулируют в этом модуле, и 9% O 2 , если нервные стволовые клетки будут выращиваться или манипулировать. Нажмите на зеленую галочку для подтверждения заданного значения.
Примечание: Два модуля не газа регулируется: ламинарный шкаф, и микроскоп камеры. Концентрации газа в ламинарный являются атмосферные whilе те в микроскоп камеры пассивно поддерживается концентрации газа в технологической камере. - Повторите этот шаг для CO 2. Введите заданное значение 5% CO 2 для всех модулей для буферных камер, которые регулируются только для O 2 , за исключением.
- Мониторинг текущих концентраций газа, которые помечены как "значений процесса", чтобы убедиться, что они достигают нового набора очков.
- Отрегулируйте установочные газа точки всех модулей к соответствующим значениям. Матч уровни CO 2 и O 2 из камер , которые будут подвергаться друг к другу. Например, настроить рабочую камеру до 5% O 2 до открытия инкубатора , который растет клеток при 5% O 2. Также отрегулировать до 5% O 2 любой буфер камеры , который используется для добавления элементов в рабочей камере в течение этого времени.
- Установите температуру рабочей камеры до 37 ° С, используя один и тот же экран для корректировки газа. Также установите технологическую камеру пLoor температуры до 37 ° С.
- Нажмите на модуль Инкубационный банки под каждым инкубаторе. Отрегулируйте температуру банков до 37 ° С.
- Эксплуатация буферные камеры
- Соберите все необходимые расходные материалы для данной задачи (кормление, расщепление, окрашивание и т.д.) в начале , чтобы предотвратить задержку в потоке работы. Обильно распылить все материалы с 70% этанола и дайте им высохнуть в ламинарном шкафу. Не распылять колбах или пластин клеток - протрите их осторожно стерильной марлевой губкой насыщенного 70% этанолом.
- Убедитесь в том, как внешние и внутренние двери буферной камеры надежно закрыты. Затем откройте дверь снаружи, и поместите предметы внутри.
- Закройте наружную дверь. В программном обеспечении, выберите модуль буфера, и нажмите на вкладку коэффициент разбавления. Введите 1 в поле фактор журнала. Нажмите кнопку Пуск.
Примечание: "коэффициент разбавления" определяется как означающее, что атмосфера модуля буфера будетэвакуировать и заменить 1 раз чистой, HEPA-фильтром газа. - После того, как графический интерфейс перестанет мигать "коэффициент разбавления", открыть внутреннюю дверь буферной камеры и принести материалы внутри рабочей камеры.
Внимание: Не допускайте внутренние и внешние двери всегда быть открытыми в то же время и не открывайте внутреннюю дверцу, если буфер камеры не претерпел коэффициент разбавления. - Для того, чтобы удалить элементы из технологической камеры, сначала убедитесь, что буферная камера подверглась коэффициент разбавления. Затем откройте внутреннюю дверь, поместите элементы должны быть удалены внутрь, и закройте внутреннюю дверь. Затем откройте наружную дверь и удалить элементы.
Примечание: коэффициент разбавления не нужно работать, прежде чем открыть наружную дверь.
2. Введение и подкормки Клетки
- Настройка инкубатор
- Поместите 3 чашки Петри в воде кастрюлю на базе каждого инкубатора. Заполните эти блюда с Sterilе воды. Непосредственно не заполняют водой кастрюлю. Поддерживать уровень воды в этих блюдах, так как они имеют решающее значение для поддержания заданного значения относительной влажности (RH) в инкубаторах.
- В графическом интерфейсе, нажмите на инкубаторе. Нажмите на существующее значение для относительной влажности (RH) в соответствии с заданной точки и введите 85%. Нажмите на зеленую галочку, чтобы принять это значение.
- Подготовка клеточного фонда производства для клеток
- Если еще не сделали этого, установите буферные камеры, в камере, а инкубатор для заданных точек газа, необходимых для данного типа клетки внедряются.
- Очистите поверхность рабочей камеры с стерильную марлю и негорючим дезинфицирующим средством. Не используйте дезинфицирующее надуксусной кислоты на основе, как в замкнутой системе сильного, сохраняющиеся пары являются токсичными к клеткам млекопитающих. Вместо этого следует использовать хлорид бензалкония на основе продуктов.
- Продолжайте дезинфицировать. Очистите перчатки и поверхности, которые Коммоолько прикоснулся, такие как дверные ручки. Используйте дезинфицирующее средство тщательно, но умеренно, так как избыток жидкости в рабочей камере будет способствовать влажности, конденсации и возможного роста микробов.
- Очистите поверхность капота ламинарного потока и буферной камеры с 70% этанола, и дайте ему высохнуть. Поместите колбу или пластину клеток (в нашем случае, ЧОК или NSCs) в капюшоне, и кратко протрите его наружную поверхность стерильной марлевой губкой, насыщенной этанолом.
- Поместите колбу или пластину в буферной камере, и запустить коэффициент разбавления (этап 1.2.3).
- После завершения коэффициент разбавления, немедленно переместить колбу или пластину к соответствующему инкубаторе. Поскольку инкубаторы в задней части технологической камеры, вытащить полку из в технологическую камеру для размещения клеток. Не следует открывать инкубатор двери без необходимости или в течение длительных периодов времени, так как воздух в рабочую камеру является очень сухим по сравнению с инкубаторах, и приведет к значительнымПотеря влажности в инкубаторе.
- Кормление клеточных культур
- Сбор компонентов среды, серологические пипетки, электронный пипетку, марлю и дезинфицирующее средство. Также собрать контейнер для отходов для отработанного среды для культивирования клеток, но не заполнять его с отбеливателем. Принесите материалы в технологическую камеру через буферную камеру, как это описано в разделе 1.2. Подготовка культуральной среды клеток в технологической камере, как описано ранее , 9,10 (также см Материалы таблицу)
- Расположить материалов таким образом, чтобы дать оптимальное рабочее пространство. Избегайте размещения элементов не используются в центре рабочей камеры.
- Разрешить для среды , чтобы уравновесить с уровнями CO 2 и O 2 , присутствующих в системе, оставив контейнер СМИ слегка колпачков. Некоторые производители PSC средние указывают не нагреться СМИ при температуре 37 ° С; если это так, используют буферную камеру для уравновешивания среды. Позвольте мнеDIUM для уравновешивания в течение 20 мин.
- Удалите старую среду из лунок с помощью соответствующего стереологической пипетку и электронный дозаторов. Для ЧОК, удалить все, кроме небольшого количества оставшегося старой среды, достаточно, чтобы предотвратить высыхание в процессе кормления. Для NSCs, удалить половину старой среды. Пипетируйте отходы в контейнер для отходов.
- Поместите использованный пипетку обратно в оригинальную упаковку и переместить его в сторону рабочей камеры, или в буферную камеру, предназначенную для удаления отходов. С свежей стерильной серологических пипетки, добавьте свежую среду в клеточной культуре тарелки и поместить листы обратно в свой назначенный инкубатор.
- В конце кормления, спрей марлю с дезинфицирующим средством и тщательно очистить пол и дверные ручки рабочей камеры. При наличии нескольких клеточных линий, выращиваемых в системе, стерилизовать между подачей каждой клеточной линии. Это помогает свести к минимуму риск перекрестного загрязнения.
- После завершения удаления отходовили других ненужных предметов через одну из буферных камер.
3. Расщепление клеточных культур
- Ферментативный пассажи ЭСК или NSCs
- Соберите все предметы, необходимые для пересева. Это включает в себя средства массовой информации, фермент или неферментативного буфера для диссоциации клеток (последнее для NSCs только), ДЗФР, тарелки или баллонах, внеклеточного матрикса (ЕСМ), конические трубы, и серологические пипетки. Привести их в систему, используя буферную камеру.
- Coat свежие пластины или колбы с ECM, как описано выше 9,10. Некоторые ЕСМ -such, как те, которые получены из линий мыши саркомы клеток - это только жидкость, от 4 до 15 ° C, так что используйте стерилизованный холодный блок или гель пакет со льдом, чтобы держать ECM холод во время работы в рабочей камере с подогревом.
- Пипетируйте от отработанной среды из культуры и распоряжаться ею в контейнер для отходов.
- Промыть скважину или колба поверхность, используя 1 мл ДЗФР / лунку и распоряжаться ДЗФР.
- Добавить 1 - 2мл теплого фермента в каждую лунку. Только очень плотные культуры требуют 2 мл.
- Немедленно переместите культуры блюдо или колбу с микроскопом камеры, и внимательно наблюдать за культуру. Следите за признаками отдельных клеток начинают ослабьте от блюдо. Не ждите, пока клетки не всплывают в суспензии, прежде чем перейти к следующему шагу.
- Вернуть клетки к основной технологической камере. С помощью 5 мл серологической пипеткой, добавляют 4 мл ДЗФР на каждый 1 мл фермента, а затем с силой пипеткой вверх и вниз, чтобы вытеснить клетки с поверхности скважины. Если пересева нескольких скважин в пределах многослойный пластины, добавьте DPBS в каждую лунку, прежде чем выбивании клетки из отдельных лунок.
- Перенести фермент и клеточную суспензию PBS до соответствующего размера конической трубки.
- Если центрифуга не доступен в производственном объекте клеток, плотно запечатать коническую трубку, поместите ее в буферную камеру и уплотнение двери закрыты.
- Снимите коническую трубку с BUFFER камера со стороны ламинарного потока и спина клетки при 100 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Брызги коническую трубку с 70% этанола, и привести его в рабочую камеру, используя буферную камеру и коэффициент разбавления.
- Пипеткой надосадочную жидкость и клетки вновь суспендируют в 2 мл PSC или NSC среды. Если пересева ЧОК, удостоверьтесь , чтобы включать ингибитор ROCK в среде при концентрации 10 мкМ, как описано выше 9,10.
- Граф клеток с помощью гемоцитометра, и определить количество лунок, или пластин, необходимых. Пластинчатые ЧОК в 5 х 10 4 - 1 × 10 5 клеток / см 2. Разделить NSCs в соотношении 1: 2.
Примечание: NSCs часто комок и сопротивляются точный подсчет в гемоцитометра. - Если криоконсервации клеток требуется, следовать за соответствующий протокол 9,10, но убедитесь , что все поставки и замораживание средств массовой информации готовятся заранее и размещены внутри рабочей камеры. ДМСО очень токсичен для клеток при 376; С, поэтому работать очень быстро. Держите изопропиловым рубашкой замораживания контейнер при комнатной температуре в ламинарном потоке. После того, как криоконсервации флаконы заполнены и запечатаны, немедленно удалить из чаш технологической камеры, пропуская их через буферную камеру.
- Руководство пассажи ЭСК
- Убедитесь , что культура должна быть пассировать, как описано ранее 8. Если да, то приготовить свежие чашки или баллонах, покрытые внеклеточного матрикса. Затем измените среду полностью.
- Очистите камеру микроскопа стерильной марлей, смоченной в количестве щадящий негорючим дезинфицирующим - слишком много приведет к избыточному запотевания в камере. Только чистить перчатки, площадь и стадии. Принесите несколько 200 мкл или 1000 мкл в индивидуальной упаковке советы пипеткой в камеру.
- Принесите тарелку ЧОК в микроскоп камеры, снимите крышку и поместите его лицевой стороной вниз на свежеочищенной этаже. Оставив крышку вверх выставляет нижней режectly воздушных потоков, а также возможного загрязнения.
- Берем кончик пипетки, и с помощью микроскопа для визуализации культуры, выбрать, кроме колоний, которые имеют хорошую морфологию, используя кончик пипетки.
Примечание: наконечник пипетки может быть прикреплен к пипетку, если отдельный пользователь находит это более комфортно. - Установите крышку на тарелку, и переместите пластину обратно в рабочую камеру.
- Пипетируйте от избытка ЕСМ из новой пластинки, и передать носитель из старой пластинки (содержащие кусочки колонии в суспензии) на новой пластинке. Если старая пластинка все еще содержит колоний, которые не готовы быть собраны, кормить его.
4. Методы Специализированная культура
- Сендай Трансдукция фибробластами в ЧОК
- В производственном объекте клеток, расширение человеческих фибробластов кожи в 1 фибробласта средах , содержащих DMEM / F12, 10% FBS и 20 нг / мл FGF2, при 5% O 2. Используйте 6-луночного культуры disheы покрывали 0,1% желатином.
- Приготовить клетки должны быть трансдуцированных диссоциацией их с 1 мл 0,25% трипсина на лунку. Деактивировать трипсина с 1 мл фибробластами среды. Спин при 200g, клетки вновь суспендируют в 1 мл среды фибробластов, и сосчитать их с помощью гемоцитометра.
- Ресуспендируют 2,0 х 10 5 клеток в 2 мл среды фибробластов, и добавляют суспензию клеток в 1 лунку желатин покрытием 6 - луночного планшета (2,1 × 10 4 клеток / см 2). Положите клетки обратно в инкубатор.
- Разрешить 24 ч для клеток, чтобы прикрепить к нижней части пластины.
- Поместите свежую фибробластический среду внутри рабочей камеры (1 мл среды на лунку клеток быть трансдуцированных), и дайте ему уравновешиваться в газах.
- Стерилизовать предварительно охлажденный холодный блок с 70% этанола и поместить его в буферной камере. Используйте пакет со льдом гель с отверстиями в ней, если коммерческий холодный блок не доступен.
Примечание: Есть 3 - 4 отдельных Сендайвирусы (в зависимости от версии комплекта трансдукции), который должен быть талой быстро, но держали в холодном блоке однажды талой. - Опустите нижнюю половину труб в водяной бане при 37 ° С в течение 15 секунд (не погружать трубы), а затем сразу же очистить экстерьеров трубка с 70% -ным этанолом. Место труб на стерилизованную холодный блок в буферной камере и запустить коэффициент разбавления.
- Работая быстро, добавьте необходимый объем каждого вируса Сендай перепрограммирования к уравновешенной среде 2. Этот объем определяется тремя переменными - количество клеток, титр каждого вируса, и желаемой множественности заражения для каждого вируса. Обратитесь к руководству комплект для рекомендованного МВД России. Формула:
[(Число клеток, которые трансфицированы) (множественность инфекции), (1000)] / (вирусный титр) = требуется мкл вируса - Удалить супернатант из скважины (ов) клеток перепрограммировать. Для каждой лунки, добавьте 1 мл лечебгм, содержащие вирусы. Слегка покачивая тарелку, стараясь не расплескать СМИ, и поместите пластину обратно в 5% O 2 инкубатора.
- Через 2 часа осторожно встряхните пластину снова и снова повторить еще через 2 часа.
- Через 24 часа (день 1 после трансдукции), кормить хорошо с 1 мл плюрипотентных стволовых клеток среды. Повторите на 2-й день, но не удаляют среду из скважины.
- В дни, 3 и 4, изменить половину среды.
- На 5-й день и за его пределами, изменить всю среду.
- Когда появляются колонии, окрашивает культуру , используя стерильные антитела , чтобы подтвердить , что колонии действительно плюрипотентные, как описано выше 2. Как с питающими клетками, убедитесь, что ККП носители, содержащие антитела уравновешивали в газы в производственном объекте клеток.
Примечание: В успешном перепрограммировании, IPSC колонии должны присутствовать примерно через две недели после трансдукции 1. - Когда колонии выросли большиедостаточно использовать микроскоп, чтобы отметить и механически прохождение их на планшет ECM-покрытием, как описано в разделе 3.2.
- Расширение колоний либо вручную , либо ферментативно, как было описано выше 9,10.
5. Очистка после ежедневного использования
- Поместите все материалы отходов, в том числе колбы жидких отходов, в стерильный буферную камеру. Протрите поверхность рабочей камеры и все районы, которые вступают в контакт с поставками с стерильную марлю и негорючим дезинфицирующим средством.
- Удалить все твердые отходы из буферной камеры и выбросить в соответствующий контейнер для отходов.
- Откажитесь жидкие отходы в соответствующий контейнер с отходами, или просто смешать с отбеливателем и вылить в канализацию. Очистите контейнер для отходов с мылом и щеткой. Стерилизовать контейнер с 70% этанола и переместить его обратно в рабочую камеру через буферную камеру.
Примечание: Не рекомендуется использовать отбеливатель вКонтейнер для отходов в то время как он находится внутри системы, так как отбеливатель пары могут рециркуляцию и повредить клеточные культуры. - Для соображений гигиены, протирать переднюю пластиковую поверхность камеры обработки системы с 70% этанола. Это помогает очистить от пота и масла кожи от лба пользователя.
- Если конденсат накопил внутри рабочей камеры, запустить коэффициент разбавления для очистки конденсата. Позвольте по крайней мере 1 час для этого, чтобы закончить.
6. Плановые неежедневных Задачи
- Залить посуду воды в инкубаторах для культивирования клеток стерильной дистиллированной воды при необходимости. Довершение блюда не реже одного раза в неделю. Тем не менее, скорость испарения будет меняться в зависимости от того, как часто открываются двери инкубатора, объем жидкости в культурах, а также настройки инкубатора.
- Раз в месяц, откалибровать настройки O 2 и CO 2 во всех камерах. Это требует использования SPAN (калибровки) газа, который продAINS известных концентраций уровни O 2 и CO 2 в качестве стандарта в качестве ссылки. Убедитесь, что имеется достаточный запас SPAN газа перед началом калибровки. Система использует специальные датчики газа, расположенные в каждом модуле, для обнаружения концентрации газа; Таким образом, использование высококачественных SPAN газов гарантирует, что датчики надежно дают точные концентрации газа.
- Заменить перчатки в рабочую камеру и камеру микроскопа на регулярной основе. Заменить перчатки каждые 2 месяца, независимо от того, как часто используется система. Перед установкой стерилизовать новые перчатки с дезинфицирующим средством. Выполнить коэффициент разбавления на технологической камере после того, как перчатки, были заменены.
Примечание: При натянутой на манжетах системы, нитриловые перчатки имеют тенденцию к развитию отверстий в местах, подверженных воздействию физического стресса и тепла. Это нормально и неизбежно износа. - Изменение вне шприцевые фильтры во всех камерах каждые 6 месяцев.
- Заменить или мыть тон на предварительной фильтрации капот ламинарного потока, как только он начинает появляться грязные.
- Регулярно Обратитесь к документации производителя для получения информации о замене основных частей.
7. Очистка системы
- В случае крупного события загрязнения, затрагивающей большинство клеточных культур, перемещать любые культуры клеток выжившим из системы, или (если это возможно) в незатронутой инкубаторе.
- Выключите газовый регулятор для всех камер, за исключением, что непоражаемых инкубаторах.
- Снимите гибкую переднюю панель аппарата и удалите полки из нержавеющей стали из пораженной клеточной культуры инкубатора. Также удалите воду кастрюлю.
- Автоклав полки инкубатора и воды кастрюлю, и положил их обратно в инкубатор. Протрите внутренние поверхности инкубатора с 70% -ным этанолом. Разрешить этанол испарится, и закройте дверцу инкубатора.
- Протрите поверхности процесса и микроскопа камеры с 70% и дрhanol. Установите на место переднюю панель аппарата.
- Протрите внутренние поверхности аппарата, что пораженного инкубатора, с негорючим дезинфицирующего включая. Оставьте дверцу пострадавшего инкубатора открыть, и запустить коэффициент разбавления на технологической камере. Убедитесь, что микроскоп камеры двери также открыты.
- Для обычной очистки инкубаторов клеточных культур, убедитесь, что инкубатор и процесс камеры находятся на одних и тех же атмосферных условиях. Откройте дверцу инкубатора, и поставить все блюда культуры клеток на поверхности рабочей камеры.
- Протереть полки инкубатора и внутренние поверхности с негорючим дезинфицирующим средством. Дайте дезинфицирующим испариться, и переместить клеточные культуры обратно в инкубатор. Работать как можно быстрее, чтобы избежать усыхания клеточных культур.
Результаты
Эта рукопись описывает в некоторых деталях производственной ячейки объекта, а также уникальные аспекты культивирования клеток внутри замкнутой системы. Основная часть производственной ячейки объекта включает в себя заказные, закрываемый, культуры клеток аппарат , который имеет небольшие размеры и может быть легко смонтированные в 6 х 7,5 м 2 комнатной (рисунок 2). Ни в какое время являются клетки внутри аппарата воздействию лабораторного персонала и окружающей среды. Устройство состоит из нескольких модулей: технологическую камеру, ламинаре, 2 буферизация Airlock камер в между капотом и рабочей камеры, двух инкубаторах клеточных культур и микроскопа камеры , прилегающей к рабочей камере (рисунок 3). Система управляется с помощью программного обеспечения , позволяющего экологические переменные , которые будут управляться и контролироваться (Рисунок 1). Компьютер это программное обеспечение находится на источник бесперебойного питания. Газы подают в гоэлектронной системы с помощью набора коллекторы для кислорода, азота и углекислого газа (рисунок 4). Газы для устройства снабжены разнообразными системами, которые имеют два комплекта танков каждый - активный набор и набор резерва. Когда активный набор обращается вниз, коллектор автоматически переключается на резервные и установлены на персонал запасных заказ танков. Питания на резервную систему генератора.
Плюрипотентных и нервные стволовые клетки можно выращивать в условиях гипоксии в этом объекте с использованием ранее разработанных протоколов 9, с дополнительными осложнениями , присущих новому оборудованию. Плюрипотентные стволовые клетки могут быть получены с использованием вируса Сендай, используя плюрипотентности-специфических антител для идентификации полностью трансфектированных колоний, которые затем выделяют и развернутые. (Рисунок 5А и В), Из этих ИПСК, нервные стволовые клетки и нейроны могут быть получены с помощью ингибирования двойной Smad, и их фенотип проверены USI нг NSC-специфических антител (рис 5С и D).
Рисунок 1. Графический интерфейс для объекта Cell Production. (А) Графическое представление СПЛ является экран по умолчанию и соответствует чертеж CAD , показанный на рисунке 3. Щелчок мыши над буфером модуль 1 (2F на рисунке 1) открывает экран управления (B) , где 2 значения O устанавливаются в соответствии с рабочей камере (3 на рисунке 3). Точно так же, нажав на технологической камере или Инкубатор 1 приносит свои соответствующие экраны управления (C и D, соответственно), где значения могут быть изменены или отслеживаемые в зависимости от обстоятельств. rget = "_blank"> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Клетка производственном объекте. (А) Система , как видно из переднего правого ракурса. Обратите внимание на электрические и газовые соединения на потолке и тележку с микроскопом и аксессуаров компьютера справа. (B) Капот ламинарный поток с дверями доступа к буферу модулей видно справа. (C) Процесс камеры с двумя инкубаторы (черные двери) видно сзади. (D) Вид через правую сторону системы , показывающий микроскоп и монитор с дверями в буфер камеры видно на расстоянии. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Чертеж САПР Объекта сотового Production. Все детали , поступающие на устройство, сначала протирать спиртом и сушат на воздухе в вытяжном шкафу с ламинарным потоком воздуха (1). Элементы затем переходит к соответствующей атмосферы в модуле передней буферной (2F) перед поступлением в модуль UCPC, или технологическую камеру (3). Клетки культивируют в двух инкубаторах (4, 5). Живая клетка окрашивания, собирание колонии, оценка общей клеточной морфологии и анализа миграции происходит в модуле UPC или микроскоп камера (6). И, наконец, отходы выходит из системы через модуль заднего буфера (2R). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть большую версию этого рисунка. < / Р>
Рисунок 4. Источники газов и Силы. (A) CO 2 многообразие является установка 4 х 4 , как она поставляет все инкубаторы лаборатории. (B) O 2 многообразие представляет собой 2 х 2 установки и расходные материалы только производство ячейки объекта. Азот для системы генерируется в испарителе (C, как раз под знаком выход) , присоединенные к жидким азотом коллектора (справа) , который также автоматически заполняет cryofreezers (внизу слева). Многообразие является установка 2 х 2 подается двумя парами 160 л танков жидкого азота. CO 2, O 2, N 2 и поставляются с потолка через отсечные (D). вакуумный дом также поставляется в этом месте. Видел только за поставки газа отключений являются парой силовых кабелей, которые поставляют питание системы.F = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig4large.jpg" целевых = "_blank"> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5. плюрипотентные стволовые клетки , полученные в Гипоксия с вирусом Сендай. (A) SC187-SF4-2I0-E3 иПСК иПСК (номенклатура найдены в Стовера и др. 9), фазовый контраст 10x. (B) SC88.1-UH1-2I0 иПСК живой окрашивали AF-594-меченым TRA-1-60, разведение 1: 100 в средствах массовой информации. Все иПСК были трансдуцированных в производственном объекте клеток в 5% O 2 с вирусом Сендай. (C) Фаза контраст SC68.1-UH0-2I0-M0S13-N2G6 IPSC-производных NSCs, выращенных при 5% O 2 в камере слайдов. Затем клетки фиксировали в 4% параформальдегида и окрашивали анти-человеческим Nestin первичным антителом, и Алекс-488 вторичное антитело. Все масштабные линейки находятся на 1001; м . Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Обсуждение
Клетки, выращенные в РПС не видят каких-либо изменений в атмосфере кислорода или углекислого газа концентрации, как они перемещаются из инкубатора в камеру обработки с микроскопом камеру и обратно. Очень важно, чтобы условия в каждой камере сопоставляются с конкретным инкубаторе, в котором клетки хранятся до того, как клетки удаляются из инкубатора. Атмосфера внутри аппарата непрерывно НЕРА-фильтром и настраивается в отношении концентрации кислорода и двуокиси углерода. Клетки могут быть выращены при стандартных концентрациях для ЧОК или NSCs, 5% и 9%, соответственно; или альтернативные концентрации могут быть выбраны для различных типов клеток или для конкретных экспериментов. Таким образом, устройство поставляется с постоянными источниками медицинской чистоты кислорода, углекислого газа и азота (рисунок 4). Все три из этих газов снабжены газом конкретных систем коллектора, которые обеспечивают постоянные поставки. Устройство также поставляется с калибровочным газовой смеси, состоящей из10% (± 0,01%) двуокиси углерода в кислороде. Многообразие систем расположены за пределами производственной ячейки объекта и газы по трубопроводу в средство через потолок. Калибровочного газа расположен в пределах объекта. Устройство дополнительно снабжен вакуумом, также через потолок. Используя электронную систему мониторинга и беспроводной отправки единиц, выходное давление всех коллекторов постоянно контролируются. В том случае, если какое-либо давление выпадает из диапазона, операторы установки по производству ячейки автоматически позвонил по телефону и уведомление таким образом, что соответствующие меры могут быть приняты.
Требования к мощности аппарата выполнены шестью выделенными 120 V цепей, спускающимися с потолка и соединен с резервными генераторами больницы, чтобы обеспечить постоянное снабжение. Работа устройства управляется с помощью программного обеспечения на компьютере на базе ПК через источник бесперебойного питания. Эти силовые и компьютерные устройстваубедитесь, что система функционирует непрерывно, даже в случае выхода из строя системы публичной власти. Программное обеспечение управления устройством имеет удобный графический интерфейс (рисунок 1) , который позволяет для контроля концентрации кислорода и углекислого газа, а также давления температуры, влажности и камеры. Значения всех этих параметров непрерывно записываются, чтобы обеспечить бегущую запись всех параметров аппарата. Эти данные резервное копирование на удаленный сервер каждую ночь, чтобы защитить их целостность. Компьютер и программное обеспечение можно получить удаленный доступ административными пользователями для оценки и / или изменить любой параметр. Кроме того, компьютер и программное обеспечение можно получить удаленный доступ, что позволяет интерактивной оценки параметров аппаратуры и устранение неполадок с локальными пользователями. Дополнительный сигнал тревоги блок передачи соединен с устройством таким образом, чтобы операторы производства сотового объекта уведомляются о любом из-за допустимые пределы состояния аппарата. Удаленный доступ сapabilities позволяют войти и оценка особенностей состояния вне диапазона.
Аппарат выполнен в виде модульной системы как в макро и микро смысле. Модули Отдельные культура клеток, такие как инкубаторы и обработки камер, могут быть настроены в отношении их размеров и требований, а также в их расположение по отношению друг к другу. Кроме того, большинство функций управления отдельными модулями являются сами модульное таким образом, что отдельные контроллеры атмосферный газ, например, может быть легко заменен без существенного сбоев в системе.
Специализированные камеры обработки, например, один для микроскопического визуализации и манипуляций с культурами клеток, легко адаптируются к системе. Оба фазового контраста и флуоресцентный микроскоп находятся внутри системы (рисунок 6) таким образом , что клетки могут быть живой окрашенном, и колонии могут быть расчленены в тех же атмосферных условиях, в тон инкубаторы. Прокладка кабелей через герметичные прокладки в боковых стенках рабочей камеры позволяет такое оборудование, как источники питания и компьютеры , которые будут храниться вне устройства, как правило , на тележке (рисунок 6).
Камеры для обработки в производственном объекте ячейки имеют различный характер воздушного потока по сравнению с обычными КБС. В обычных БББ, воздушный поток стекает вниз из центрального выпускного отверстия и разделяется на два отдельных потока, которые затем обрабатывают с помощью двух различных отверстий для забора в передней и задней части пола шкафа. В противоположность этому, СПЛ имеет один отверстие в передней части потолка. Воздух течет вниз и по направлению к задней части камеры, где он затем обращается вверх в отверстие для забора воздуха. Хотя СПЛ по своей сути очень чистый, этот уникальный образец потока воздуха означает, что технические специалисты должны слегка скорректировать свою технику, чтобы уменьшить риск заражения. Как и с обычным BSC, лаборатории работника сhould Избегайте размещения их руки перед открытыми планшеты для культивирования клеток и медиа-бутылок. Тем не менее, направление, которое находится выше по течению было изменено в ЦПС
Объект производственной лаборатории клетка сама по себе является довольно стандартным и оснащен C морозильнике -20 °, -80 ° C морозильнике, 4 ° C холодильник, центрифуга и водяная баня. В лаборатории также имеется раковина с педалей управления для удобной работы без участия рук. Для того, чтобы этой лаборатории, чтобы стать функциональной клинической производственной ячейки объекта, однако, несколько дополнительных модификаций еще должны быть сделаны. Во-первых, сам аппарат должен быть повышен, чтобы иметь возможность отслеживать летучих органических соединений, частиц и концентрации диоксида хлора, который используется для обеззараживания. Во-вторых, рабочая камера, содержащая машину FACS может быть размещен и соединен с остальной частью аппарата через буфер модуля. Это позволит для сортировки и очистки тр клетокпопуляции ansplantable клеток при соответствующих условиях окружающей среды. И, наконец, весь аппарат должен быть размещен внутри мягкой стены чистой комнате. Это обеспечивает Международная организация по стандартизации (ISO) класс 8 среды для устройства 5.
Высокой стерильности и компьютерным управлением характер СПЛ делает его идеальной системой для будущих приложений с клеточной терапии и хороших производственных процессов. Риск заражения значительно смягчены, но что более важно, условия расширения ячейки автоматически записываются и архивируются с помощью компьютерной системы. Отклонения в концентрации газа, температуры, влажности и всех событий доступа в систему строго документированы. Это может значительно помочь при исследовании проблемы качества продукции. Тем не менее, все еще существуют ограничения. Использование любых и всех реагентов и расходных материалов (например, компоненты среды, пипеток, тарелки) должны быть задокументированы отдельно. Добавитьitionally, существует множество потенциальных проблем (в том числе многих форм человеческой ошибки), которые могут возникнуть, которые абсолютно не связаны с переменными документированных системы мониторинга ПСЛ. Таким образом, потребность в хорошо подготовленных кадров и детальной ручной документации задач остается на месте.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Благодарности
Авторы хотели бы выразить благодарность сотрудникам в Biospherix за их помощь в обучении использовать Xvivo закрытую систему культивирования клеток, особенно Matt Freeman; сотрудники Miles & Kelley Construction Company, Inc. для их работы в создании лабораторной инфраструктуры, особенно Russ Hughes; сотрудники Детской больницы Orange County департамента средств и служб поддержки для обеспечения их работы в координации лабораторных реконструируют, особенно Адам Lukhard и Девин Hugie; сотрудники Детской больницы Orange County отдела информационных систем за их помощь в создании инфраструктуры управления данными и удаленный доступ, особенно Viet Tran; Детская больница группы Исполнительного управления Orange County за многолетнюю поддержку проекта, особенно д-ра Марии Minon и Brent Dethlefs. Эта работа была профинансирована Детской больницы Orange County и Калифорнийского института регенеративной Medicinе через грант TR3-05476 к PHS. Все авторы внесли одинаковый вклад в эту работу.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Equipment | |||
| Xvivo System | Biospherix | на заказ | |
| Xvivo Программное обеспечение | Biospherix | версия i.o.2.1.2.1 | |
| O2 коллектор | Amico | P-M2H-C3-S-U-OXY | |
| CO2 коллектор | Amico | M2H-C3-D-U-CO2 | |
| N2 Manifold | Western Innovator | Микроскоп CTM75-7-2-2-BM | |
| с камерой DP21 и флуоресцентной | корпорацией Olympus | CKX41 | |
| Название | Company< | strong>Номер в каталоге | Комментарии |
| <сильные>реагенты | |||
| DMEM/F12 Глутамакс | Лайф Технолоджис | 10565-018 | |
| StemPro hESC Supplement | Life Technologies | A100006-01 | |
| Аккутаза | Миллипор | SCR005 | |
| Фосфатно-буферный | гиклон | 9236 | |
| Фактор роста фибробластов 2 | НИР D Systems | AFL233 | |
| Диметилсульфоксид | Протид | PP1130 | |
| Буфер диссоциации клеток на основе Хэнка | Life Technologies | 13150-016 | |
| 2-меркаптоэтанол | Life Technologies | 21985-023 | |
| Эпидермальный фактор роста | R& D Systems | AFL236 | |
| Oct-3/4 Антитело | Millipore | AB3209 | |
| TRA-1-60 Антитело | Millipore | MAB4260 | |
| SSEA4 | Антитело Millipore | MAB4304 | |
| BIT-9500 Сывороточная добавка | Stemcell Technologies | 9500 | |
| Name | Company | Каталожный номер | Комментарии |
| >Расходные материалы | |||
| 2 мл Серологическая пипетка | VWR | 89130-894 | |
| 5 мл Серологическая пипетка | Olympus Plastics | 12-102 | |
| 10 мл Серологическая пипетка | Olympus Plastics | 12-104 | |
| 25 мл Серологическая пипетка | Olympus Plastics | 12-106 | |
| 50 мл Серологическая пипетка | Olympus Plastics | 12-107 | |
| 6-луночная пластина | Corning | 353046 | |
| 12-луночная колба | Corning | 353043 | |
| T25 колба | TPP | 90026 | |
| T-75 колба | TPP | 90076 | |
| 20 & micro; l наконечники для дозаторов | Eppendorf | 22491130 | |
| 200 & микро; l наконечники для дозаторов | Eppendorf | 22491148 | |
| 1 000 наконечников для дозаторов | Eppendorf | 22491156 | |
| Cryovials | Thermo Scientific | 5000.102 | |
| 70% этанол | BDH | BDH1164-4LP | |
| Sanimaster 4 | Ecolab | 65332960 | |
| отбеливатель | Clorox | A714239 |
Ссылки
- Brick, D. J., et al. The Autism Spectrum Disorders Stem Cell Resource at Children's Hospital of Orange County: Implications for Disease Modeling and Drug Discovery. Stem Cells Transl.Med. 3 (11), 1275-1286 (2014).
- Nethercott, H. E., Brick, D. J., Schwartz, P. H. Derivation of induced pluripotent stem cells by lentiviral transduction. Methods Mol.Biol. 767, 67-85 (2011).
- Pistollato, F., et al. Hypoxia and HIF1alpha repress the differentiative effects of BMPs in high-grade glioma. Stem Cells. 27 (1), 7-17 (2009).
- Pistollato, F., Chen, H. L., Schwartz, P. H., Basso, G., Panchision, D. M. Oxygen tension controls the expansion of human CNS precursors and the generation of astrocytes and oligodendrocytes. Mol.Cell Neurosci. 35, 424-435 (2007).
- Raval, J. S., Koch, E., Donnenberg, A. D. Real-time monitoring of non-viable airborne particles correlates with airborne colonies and represents an acceptable surrogate for daily assessment of cell-processing cleanroom performance. Cytotherapy. 14 (9), 1144-1150 (2012).
- Schwartz, P. H. The potential of stem cell therapies for neurological diseases. Expert.Rev.Neurother. 6, 153-161 (2006).
- Schwartz, P. H., Brick, D. J. Stem cell therapies for the lysosomal storage diseases - the quintessential neurodegenerative diseases. Curr.Stem Cell Res.Ther. 3 (2), 88-98 (2008).
- Schwartz, P. H., Brick, D. J., Nethercott, H. E., Stover, A. E. Traditional human embryonic stem cell culture. Methods Mol.Biol. 767, 107-123 (2011).
- Stover, A. E., et al. Process-based expansion and neural differentiation of human pluripotent stem cells for transplantation and disease modeling. J Neurosci.Res. 91 (10), 1247-1262 (2013).
- Stover, A. E., Schwartz, P. H. Adaptation of human pluripotent stem cells to feeder-free conditions in chemically defined medium with enzymatic single-cell passaging. Methods Mol.Biol. 767, 137-146 (2011).
- Yoshida, Y., Takahashi, K., Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Hypoxia enhances the generation of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 5 (3), 237-241 (2009).
Перепечатки и разрешения
Теги
