Методическая статья

Половые различия в мышином гиппокампа астроцитов после

13.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/53695

⸱

25 октября 2016 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Waisman Center, University of Wisconsin, 2Department of Neurological Surgery, University of Wisconsin, 3Department of Pediatrics, University of Wisconsin

В этой статье

Краткое содержание

Астроциты являются одним из наиболее важных ключевых игроков в центральной нервной системе (ЦНС). Здесь мы приводим практический метод Sexed гиппокампа протокола астроцитов культуры с целью изучения механизмов , лежащих в основе функции астроцитов в мужских и женских новорожденных мышат после того, как в лабораторных условиях ишемии.

Аннотация

Астроглиоза следующие гипоксия / ишемия (HI) черепно-мозговой травмой о связанных играет определенную роль в росте заболеваемости и смертности новорожденных. Недавние клинические исследования указывают на то, что тяжесть черепно - мозговой травмы , как представляется, секс зависит, и что мужчины новорожденные более восприимчивы к воздействию HI-связанной травмы головного мозга, что приводит к более тяжелых неврологических осложнений по сравнению с женщинами с сопоставимыми черепно - мозговых травм. Разработка надежных методов, чтобы изолировать и поддерживать высокую обогащенные популяции Sexed гиппокампа астроцитов имеет важное значение для понимания клеточной основы половых различий в патологических последствий новорожденных HI. В данном исследовании мы опишем метод для создания секс - специфические гиппокампа культуры астроцитов , которые подвергаются модели в лабораторных условиях ишемии, кислородно-глюкозы лишения, с последующим реоксигенация. Последующее реактивная астроглиоз был осмотрен immunostaiнин для глиального фибриллярного кислого белка (GFAP) и S100B. Этот метод является полезным инструментом для изучения роли мужского и женского пола гиппокампа астроцитов следующий новорожденных HI, отдельно.

Введение

Астроциты являются одним из наиболее важных ключевых игроков в центральной нервной системе (ЦНС). Все больше фактов указывает на то, что роли астроцитов больше, чем предоставление поддержки нейронов. На самом деле, роли астроцитов в физиологических условиях может быть очень сложным, например, направляя миграцию развивающихся аксонов 1, регулируя ЦНС кровотока 2, поддерживая рН гомеостаза синаптическую межклеточной жидкости 3, а также участвует в гематоэнцефалического барьера 4 и 5 синаптической передачи. При патологических условиях, астроциты реагируют на повреждения с помощью процесса , называемого реактивного астроглиоз , в котором морфология, количество, расположение, рельеф местности (по расстоянию от инсульта) и функции астроцитов может измениться в гетерогенной образом 6,7. Астроглиоза видел следующие неонатальной гипоксической ишемической энцефалопатии, возможно, вносит свой вклад в заболеваемость и смертность новорожденных .

Недавние клинические и экспериментальные исследования указывают на то, что тяжесть черепно-мозговой травмой, как представляется, секс-зависимым и что мужчины новорожденные более восприимчивы к воздействию гипоксии / ишемии (HI) черепно-мозговой травмой о связанных, в результате чего в более тяжелых неврологических осложнений по сравнению с самки с сопоставимыми черепно - мозговых травм 9-11. Хотя локализация повреждения зависит от гестационного возраста и продолжительности и степени тяжести инсульта, гиппокамп является одним из наиболее часто осуществляется областей в ЦНС после срока новорожденных HI, и увеличилась гиппокампа астроглиоз подтверждена повышающую регуляцию протеин глиального фибриллярного Кислая (GFAP) 3 d после неонатального HI 7,10,12,13. Половые различия в функции астроцитов были показаны в обоих новорожденных и взрослых грызунов после ишемии головного мозга 14,15. Кроме того, мужчина астроцитов восприимчивость к экстракорпорального ишемии проявляется увеличением CELл смерть по сравнению с женским корковых астроцитов в культуре 16.

Половые различия начинаются в утробе матери и продолжается до смерти 17. За последнее десятилетие, важность включения полов в экспериментальных условиях в клеточной культуре , так и в естественных условиях исследования были акцент Института медицины и NIH искать фундаментальные знания в половые различия видели в физиологических и патологических состояниях 17,18 , Разработка надежных методов для выделения и сохранения популяций Sexed гиппокампа астроцитов имеет важное значение для понимания клеточной основы половых различий в патологических последствий новорожденных HI. Настоящее исследование было разработано, чтобы обеспечить методы для подготовки обогащенные секс-специфические гиппокампа астроцитов культуры от новорожденных мышей с целью оценки роли GFAP-иммунореактивных астроцитов следующих кислорода / глюкозы Лишение (OGD) и реоксигенация (REOX), вызываяHI в среде клеточной культуры. Этот метод может быть использован для тестирования любую гипотезу, имеющую отношение к гиппокампа астроцитов у новорожденных самцов и самок при нормоксических и ишемических состояний.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Примечание: Данное исследование было проведено в соответствии с рекомендацией Руководства по уходу и использованию лабораторных животных Национального института здравоохранения. Протокол был утвержден животных в Университете Висконсин-Мэдисон, Институциональные уходу и использованию животных комитета. Первичный протокол культуры астроцитов , который представлен здесь принимается из протоколов , представленных Zhang Y 19 и др. И Дженгиза P 20 и др. , С некоторыми изменениями.

1. гиппокампа Вскрытие и астроцитов культуры

  1. Подготовьте все необходимые реагенты и материалы, в том числе хирургических ножниц, гладкие тонким пинцетом, плоским наконечником пинцет, бумажные полотенца, мешок отходов, 70% этанола и 2 рассекающих Петри (диаметр 3,5 см) на льду, заполненных 2 мл Хэнкса сбалансированный солевой раствор (HBSS) каждого , Убедитесь, что хирургическое оборудование являются стерильными (автоклав) до процедуры и использовать все другие материалы (астроцитов металлизированный среда: DMEM + 5% лошадиной сыворотки +1% пенициллина-стрептомицина, лошадиной сыворотки, HBSS, 0,25% трипсина, покровные стекла, чашки Петри, 15/50 мл пробирки, колбы Т25 и т.д.) в качестве предварительно стерильно.
  2. Придерживая и распылить голову и шею детеныша мыши с 70% этанолом и обезглавить с помощью острых стерильных ножниц [Рисунок 1 (1)].
  3. Выполните срединный разрез от задней к передней черепа с маленькими ножницами вдоль головы , чтобы обнажить мозг [Рисунок 1 (2-3)].
  4. Аккуратно вырежьте череп от шеи к носу с маленькими ножницами. Затем вырежьте черепе впереди от обонятельной луковицы и уступает мозжечка, чтобы отключить череп от основания черепа.
  5. Сделайте небольшой надрез у основания черепа и разрезают вдоль средней линии. Используйте стерильные с плоским наконечником пинцет, чтобы очистить от черепа. Удалить ствол мозга с помощью изогнутого пинцета. Удалить мозг из черепной коробки и поместить в первый рассекает блюдо [Рисунок 1 (4-9)] 21.
  6. С помощью изогнутых щипцов, флип мозг таким образом , что вентральная поверхность головного мозга была обращена вверх , а затем отделить обоих полушарий с острым стерильным хирургическим скальпелем [Рисунок 1 (10,11)]
  7. Отогните полушарий головного мозга и осторожно удалить выдавленные и среднего мозга ткани зрительного бугра с стерильным плоскими изогнутыми щипцами , чтобы выявить гиппокамп, небольшой Seahorse-образной структуры в медиальной височной доле [Рисунок 1 (12-14)].
  8. Удалить как гиппокампа мочки [Рисунок 1 (15,16)] и тщательно препарировать мозговые оболочки из лепестков, потянув с тонким пинцетом. Этот шаг позволяет избежать загрязнения конечного астроцитов культуры путем менингеальных клеток и фибробластов.
  9. Перенести подготовленные гиппокампа лепестка во второе блюдо , заполнены HBSS и вернуть его на лед [Рисунок 1 (17,18)]. Бассейн и гиппокампа мочки от одной мыши (P0 - P2) для подготовки бегемотаcampal астроцитов культуры. Это дает Астроцитарная нужную плотность. Фарш гиппокампа мочки используя острый стерильный хирургический нож (примерно в 4 раза).
  10. Отберите HBSS с блюдом с использованием стерильного наконечника, прикрепленный к 1 мл пипеткой и добавляют 3 мл 0,25% трипсина, перемешать, переносят в 15 мл стерильного коническую пробирку и инкубировать ткани при температуре 37 ° С в течение 20 мин при осторожном встряхивании.
  11. Центрифуга трубки при 300 мкг в течение 5 мин. Отберите супернатант осторожно с помощью стерильной стеклянной пипетки, прикрепленный к вакуумной линии. Добавляют 10 мл астроцитов гальваническое среды и тритурата (20 - 30 раз) с использованием огня полированного стекла пипетку до кусочки ткани не гомогенизируют.
  12. Центрифуга трубки при 300 мкг в течение 5 мин. Отберите супернатант и добавьте 2 мл свежего подогретую астроцитов гальванического СМИ. Pass клеток через фильтр с диаметром 70 мкм меш (клеточный фильтр) в новую 50 мл коническую трубку.
  13. Тарелка Всю суспензию клеток на поли-D-лизином / ламинина покрытием стерильной Т25 культуральную колбу, содержащую 3 мластроцитов металлизированный носитель, а затем инкубировать колбы при 37 ° С в 5% СО 2 инкубатора.
  14. Отберите все средства массовой информации в дня- я н-витро (ДИВ) 1, 3 и ДИВ ДИВ 7, и заменить 2 мл свежих астроцитов металлизированный сред. Обратите внимание на прогрессию и астроцитов впадения под световым микроскопом каждый раз при замене астроцитов осажденный СМИ.
    Примечание: В Div 1, все жизнеспособные астроциты прикреплены к поверхности колбы культуры и мертвые или умирающие клетки, которые включают нейроны плывут в надосадочной жидкости. В DIV 3, прикрепленные клетки начинают делиться с образованием астроцитов слоя клеток. При отсутствии Поддерживающий условий, культура практически лишена какого-либо роста нейронов. На 7 DIV, астроцитов слой составляет около 80 - 90% сплошности и несколько микроглии, а также клетки-предшественники олигодендроцитов присутствуют на верхней части слоя астроцитов.
  15. Аспирируйте осажденный среду из колбы, добавляют 2 мл свежего подогретую астроцитов металлизированный среды, полоскатьй удалить снова в DIV 11, когда астроциты сливная и готовы к югу культивирования.
  16. Добавить 2 мл 0,25% трипсина, аккуратно поверните колбы несколько раз, и аспирата трипсина, используя стерильную стеклянную пипетку.
  17. Добавляют 2 мл 0,25% трипсина и пусть колбу сидеть в культуре ткани капот в течение 4 - 5 мин при комнатной температуре.
  18. Удалить трипсина и держать колбу при 37 ° С в 5% CO 2 инкубаторе в течение 10 мин. Добавить 5 мл предварительно нагретые астроцитов гальваническое среды и снять астроцитов слой, нажав колбу против вашей ладони (3 - 4 раза) с последующим растиранием нежным, чтобы добиться полного отряд и собирать астроциты в 15 мл коническую трубку.
  19. Центрифуга трубки при 300 мкг в течение 5 мин, аспирация супернатант и добавьте 1 мл свежего астроцитов осажденный среды.
  20. Добавьте 10 мкл суспензии клеток в гемоцитометра и подсчета клеток в большом центральном сетчатом участке (1 мм 2) с использованием контрастного микроскопа инвертированный по фазе (10x цель). Multiply от 10 4 до оценки количества клеток на мл. Один T25 колбу даст ~ 1 × 10 6 клеток всего диссоциированы. Семенной ~ 1 × 10 5 клеток в 2 мл астроцитов обшивке среды на 12 мм диаметр поли-D-лизин с предварительным покрытием покровного стекла в лунку культуральной чашке 24-луночного.
  21. Инкубировать при 37 ° С в 5% СО 2 инкубатора. Выполните OGD / REOX в DIV 12 - 14 (раздел 2).
  22. Относитесь астроцитов культуры на 3 с DIV L-лейцина (LME) гидрохлорида 5 мМ до 11, если DIV гиппокампа культуры лишенные микроглии желательны. После инкубации LME, при условии культур встряхивании (300 оборотов в минуту в течение 1 ч), чтобы удалить загрязняющие микроглии.
    Примечание: LME является микроглии цитотоксический агент , который широко используется в качестве метода для устранения пролиферирующих микроглии 22.

2. OGD / REOX Лечение

  1. Аспирируйте средств массовой информации из покровного содержащие клейкий астроцитов культуры (ДИВ 12 - 14) и полоскать 3 разаосторожно вращая 24-луночного культуры блюдо держит покровного пару раз с 1 мл изотонического раствора OGD (рН 7,4) , содержащей (в мМ): 0 глюкозы, 21 NaHCO 3, 120 NaCl, 5,36 KCl, 0,33 Na 2 HPO 4, 0,44 KH 2 PO 4, 1,27 CaCl 2 и 0,81 MgSO 4.
  2. Добавить 0,2 мл раствора OGD в лунку для покрытия покровное и инкубировать в течение 2 ч в гипоксических инкубаторе , содержащем 94% N 2, 1% O 2, и 5% CO 2. Аккуратно перемешайте с орбитальном шейкере (50 оборотов в минуту) в течение первых 30 мин гипоксии для облегчения обмена газа.
  3. Выдержите нормоксических контрольные клетки в течение 2 ч в 5% СО 2 и атмосферного воздуха в буфере , идентичный раствору OGD для добавления 5,5 мМ глюкозы , за исключением.
  4. Для REOX, аспирация раствор OGD и добавляют 2 мл астроцитов металлизированный среды. Выдержите в 5% CO 2 и атмосферного воздуха при 37 ° С в течение 5 часов.

3. Иммуноцитохимическая Окрашивание

  1. Аспирируйте культуральной среды с помощью стерильной стеклянной пипетки, прикрепленный к вакуумной линии и быстро прополоскать покровное один раз добавлением 1 мл 0,1 М Трис-буферном солевом растворе (TBS) (154 мМ NaCl, 16 мМ Trizma основание, 84 мМ Трис-HCl, рН 7,4) к колодцу. Отберите и добавляют 2 мл 4% параформальдегида (PFA) в 1x фосфатным буферным физиологическим раствором (PBS). Инкубируют в течение 15 мин при комнатной температуре.
  2. Отберите и добавить 1 мл 0,1 М TBS, а затем поместить на ротационном шейкере в течение 2 мин. Повторите 3 раза. Добавьте 1 мл блокирующего раствора (10% козьей сыворотки, 10 мг / мл БСА, 0,025% Тритон Х-100 в 0,1 М TBS) и инкубируют в течение 30 мин при 37 ° С на ротационном шейкере.
  3. Отберите блокирующего раствора и добавить первичный Мышиные моноклональные анти-GFAP антитела (0,2 мл 1: 500 разбавление в блокирующем растворе) и кроличьи поликлональные анти-S100B (1: 500) или кроличьи поликлональные анти-HIF1α (1: 200) в течение 60 мин при 37 ° с на ротационном шейкере.
  4. С другой стороны, некоторые астроциты инкубируют с кроличьей поликлональной анти-Iba1 (1: 200) и мыши пнoclonal анти-MAP2 для доступа чистоты культуры.
  5. Отберите первичное антитело и прополоскать покровное путем добавления 1 мл 0,1 М TBS и размещения на ротационном шейкере в течение 2 мин, а затем аспирата. Повторите дважды.
  6. Добавить 0,2 мл 1: 200 разбавлением вторичного козы к антителам кролика 488-конъюгированных и анти-мышь 568-конъюгированных антител в блокирующем растворе в течение 60 мин при 37 ° С на ротационном шейкере.
  7. Отберите вторичное антитело и полоскать покровное путем добавления 1 мл 0,1 М TBS и место на ротационном шейкере в течение 2 мин, а затем аспирата. Повторите дважды.
  8. Удалить покровное из скважины и сухой путем размещения на слайде, расположенный на слайде-осушителя. Гора покровное на новый слайд путем переворачивания на одной капле Vectashield hardset монтажной среды с DAPI (1,5 нг / мкл).
  9. Image покровные на конфокальной микроскопии с использованием либо 20X сухой или 60X цели масла. Получение изображений (512 х 512) для DAPI (405 нм ех / 450 нм EM) и флуорохромом 488 помечено GFAP антитела (488 нм ех / 515 нмЭм). Держите параметры получения постоянной в пределах 20X и 60X групп.

4. Секс Определение с помощью ПЦР

  1. Тепло щениться носок или обрывы пальцев при 95 ° С в течение 45 мин в 50 мМ NaOH и нейтрализуют с равным объемом 1 М Трис, рН 6,8.
  2. Добавить 1 мкл раствора ДНК, извлеченной до 19 мкл следующей смеси: 5 пмоль праймеров для генов Myog и SRY, 1x реакционного буфера, 0,2 мМ каждого дезоксинуклеотид и 8 U Taq-полимеразы.
  3. С помощью праймеров последовательностей; Sry 5'TCATGAGACTGCCAACCACAG3 ', 5'CATGACCACCACCACCACCAA3' и Myog 5'TTACGTCCATCGTGGACAGC3 ', 5'TGGGCTGGGTGTTAGTCTTA3' 23.
  4. Выполните следующие ПЦР-протокол: 95 ° С в течение 3 мин, затем 30 циклов денатурации при 95 ° С в течение 15 с, отжиг при 58 ° С в течение 15 с, а относительное удлинение при 72 ° С в течение 1 мин. Вслед за этим в 30 циклов, реакция завершается конечной 72 ° C Удлинение в течение 1 мин.
  5. Отдельный ПКR продукты электрофоретически на этидий бромидом, содержащего 2% -ном агарозном геле и визуализировать под действием УФ-освещении. (Рисунок 2A.) ВНИМАНИЕ! Бромистый этидий является потенциальным канцерогеном и должны быть тщательно обработаны и утилизировать надлежащим образом в соответствии с правилами учреждения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Понимание роли Sexed функций астроцитов в физиологических или патофизиологических условиях были чрезвычайно выяснены путем культивирования этих клеток в условиях в пробирке. Важным аспектом выполнения Sexed Культивирование, чтобы определить пол детеныша мыши до его использования. Мы определили пол мыши генетически с помощью ПЦР и путем визуальной оценки (рисунок 2) 16. Методология определения пола с помощью ПЦР был принят с изменениями от McClive и Си...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Для изучения половых различий в свойствах и функции астроцитов при физиологических и патологических состояниях, подготовка Sexed первичных астроцитов в культуре клеток является важным инструментом для использования. В настоящем исследовании мы сообщаем высокоэффективным и воспроизводимый метод для культивирования сильно обогащены гомогенной популяции Sexed гиппокампа астроцитов от новорожденных (P0-P2) C57BL / 6 (дикий тип) или K19F (GFAP нуль) щенками мыши в пробирке. Установление этой методики помогает следов...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Ни один из авторов не имеют конкурирующие или конфликтующие интересы.

Благодарности

Программа премий в области клинической и трансляционной науки NCATS UL1 TR0000427 и KL2 TR000428 (Cengiz P), UL1TR000427 в UW ICTR от NIH/NCATS и средства от Центра Вайсмана (Cengiz P), K08 NS088563-01A1 от NINDS (Cengiz P) и NIH P30 HD03352 (Центр Вайсмана), NIH/NINDS 1K08NS078113 (Ferrazzano P). Мы хотели бы поблагодарить Олби Мессинга (Albee Messing), доктора философии, за предоставленную нам мышей с нокаутом GFAP.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Astrocyte culture media
DMEM, с высоким содержанием глюкозыCellgro10-013-CV
Horse SerumGibco26050-070Конечная концентрация: 10%
пенициллин-стрептомицинCellgro 30-002-CIКонечная концентрация: 1%
L-L-лейцина метиловый эфир гидрохлоридAldrichL1002-25GКонечная концентрация: 5 мМ<
>Раствор для переваривания тканей мозга
HBSSLife Technologies14170-088
Trypsincellgro25-050-CIКонечная концентрация: 0,25%
Other
70% (vol/vol) этанолRoth9065.2
Poly-D-Lysine (PDL) 12 мм круглые покровные стекла Corning354087
WaterSigmaW3500Клеточная культура PBS
cellgro21-040-CVКлеточная культура
0,05% Трипсин-ЭДТА Life Technologies25300-062
70 μ m Стерильное клеточное ситечко Научный22363548
Фишера 3,5 см Чашка ПетриBD Falcon353001
15 мл Соколиная трубкаBD Falcon352096
50 мл Соколиная трубкаBD Falcon352070
Щипцы, тонкие.Dumont2-1032; 2-1033# 3c; # 5
Щипцы, плоский наконечникKLS Martin12-120-11
13 см хирургические ножницыAesculapBC-140-R
Конфокальный микроскопNikonA1RSi 
ЦентрифугаEppendorf5805000.0175804R
Орбитальный шейкерThermo ScientificSHKE 4450-1CEMaxQ 4450 
Anti-IBA1Wako019-19741Кролик моноклональный
Anti-MAP2SigmaM2320Мышиный моноклональный
Anti-HIF1alphaabcam ab179483Кролик моноклональный
Anti-S100BSigmaHPA015768кролик поликлональный
Anti-GFAP (коктейль)Biolegend837602
VECTASTAIN Elite ABC Kit (кролик IgG)Vector LabsPK-6101содержит 4 реагента 
Goat Anti Rabbit Alexa-Fluor 488InvitrogenA11070
Goat Anti Mouse Alexa-fluor 568InvitrogenA11004
strong

Ссылки

  1. Powell, E. M., Geller, H. M. Dissection of astrocyte-mediated cues in neuronal guidance and process extension. Glia. 26, 73-83 (1999).
  2. Koehler, R. C., Roman, R. J., Harder, D. R. Astrocytes and the regulation of cerebral blood flow. Trends in neurosciences. 32, 160-169 (2009).
  3. Seifert, G., Schilling, K., Steinhauser, C. Astrocyte dysfunction in neurological disorders: a molecular perspective. Nature reviews. Neuroscience. 7, 194-206 (2006).
  4. Ballabh, P., Braun, A., Nedergaard, M. The blood-brain barrier: an overview: structure, regulation, and clinical implications. Neurobiology of disease. 16, 1-13 (2004).
  5. Araque, A., Parpura, V., Sanzgiri, R. P., Haydon, P. G. Tripartite synapses: glia, the unacknowledged partner. Trends in neurosciences. 22, 208-215 (1999).
  6. Anderson, M. A., Ao, Y., Sofroniew, M. V. Heterogeneity of reactive astrocytes. Neuroscience letters. 565, 23-29 (2014).
  7. Cengiz, P., et al. Inhibition of Na+/H+ exchanger isoform 1 is neuroprotective in neonatal hypoxic ischemic brain injury. Antioxidants & redox signaling. 14, 1803-1813 (2011).
  8. Ferriero, D. M. Neonatal brain injury. The New England journal of medicine. 351, 1985-1995 (2004).
  9. Hill, C. A., Fitch, R. H. Sex differences in mechanisms and outcome of neonatal hypoxia-ischemia in rodent models: implications for sex-specific neuroprotection in clinical neonatal practice. Neurol Res Int. , 1-9 (2012).
  10. Cikla, U., et al. ERalpha Signaling Is Required for TrkB-Mediated Hippocampal Neuroprotection in Female Neonatal Mice after Hypoxic Ischemic Encephalopathy(1,2,3). eNeuro. 3, (2016).
  11. Uluc, K., et al. TrkB receptor agonist 7, 8 dihydroxyflavone triggers profound gender- dependent neuroprotection in mice after perinatal hypoxia and ischemia. CNS Neurol Disord Drug Targets. 12, 360-370 (2013).
  12. Cikla, U., et al. Suppression of microglia activation after hypoxia-ischemia results in age-dependent improvements in neurologic injury. J Neuroimmunol. 291, 18-27 (2016).
  13. McQuillen, P. S., Ferriero, D. M. Selective vulnerability in the developing central nervous system. Pediatr Neurol. 30, 227-235 (2004).
  14. Morken, T. S., et al. Altered astrocyte-neuronal interactions after hypoxia-ischemia in the neonatal brain in female and male rats. Stroke; a journal of cerebral circulation. 45, 2777-2785 (2014).
  15. Chisholm, N. C., Sohrabji, F. Astrocytic response to cerebral ischemia is influenced by sex differences and impaired by aging. Neurobiology of disease. 85, 245-253 (2016).
  16. Liu, M., Oyarzabal, E. A., Yang, R., Murphy, S. J., Hurn, P. D. A novel method for assessing sex-specific and genotype-specific response to injury in astrocyte culture. Journal of neuroscience methods. 171, 214-217 (2008).
  17. Exploring the biological contributions to human health: does sex matter?. Journal of women's health & gender-based. 10, 433-439 (2001).
  18. Collins, F. S., Tabak, L. A. Policy: NIH plans to enhance reproducibility. Nature. 505, 612-613 (2014).
  19. Zhang, Y., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78, 785-798 (2013).
  20. Cengiz, P., et al. Sustained Na+/H+ exchanger activation promotes gliotransmitter release from reactive hippocampal astrocytes following oxygen-glucose deprivation. PloS one. 9, e84294(2014).
  21. Landis, S. C., et al. A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research. Nature. 490, 187-191 (2012).
  22. Hamby, M. E., Uliasz, T. F., Hewett, S. J., Hewett, J. A. Characterization of an improved procedure for the removal of microglia from confluent monolayers of primary astrocytes. J Neurosci Methods. 150, 128-137 (2006).
  23. McClive, P. J., Sinclair, A. H. Rapid DNA extraction and PCR-sexing of mouse embryos. Molecular reproduction and development. 60, 225-226 (2001).
  24. Wolterink-Donselaar, I. G., Meerding, J. M., Fernandes, C. A method for gender determination in newborn dark pigmented mice. Lab Anim (NY). 38, 35-38 (2009).
  25. Uliasz, T. F., Hamby, M. E., Jackman, N. A., Hewett, J. A., Hewett, S. J. Generation of primary astrocyte cultures devoid of contaminating microglia. Methods Mol Biol. 814, 61-79 (2012).
  26. Raponi, E., et al. S100B expression defines a state in which GFAP-expressing cells lose their neural stem cell potential and acquire a more mature developmental stage. Glia. 55, 165-177 (2007).
  27. Souza, D. G., Bellaver, B., Souza, D. O., Quincozes-Santos, A. Characterization of adult rat astrocyte cultures. PloS one. 8, e60282(2013).
  28. Puschmann, T. B., Dixon, K. J., Turnley, A. M. Species differences in reactivity of mouse and rat astrocytes in vitro. Neuro-Signals. 18, 152-163 (2010).
  29. Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2013).
  30. Saura, J. Microglial cells in astroglial cultures: a cautionary note. J Neuroinflammation. 4 (26), (2007).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

GFAPS100B

Похожие статьи