Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Убыт- и Gain-оф-функции подход к расследованию Early Cell Судьба определителям предимплантационной эмбрионов мыши

8.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/53696

⸱

6 июня 2016 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Nanobiomedical Sciences and BK21 PLUS NBM Global Research Center for Regenerative Medicine, Dankook University, 2Insititute of Tissue Regeneration Engineering, Dankook University, 3Department of Biological Sciences, Ajou University, 4Department of Pharmacy, Sahmyook University, 5Department of Animal Biotechnology, Sahmyook University

В этой статье

Краткое содержание

Цель этого протокола заключается в описании убыт- и амплитудно-метода функции, который применим для идентификации neogenin в качестве рецептора стадиеспецифический, что приводит к трофэктодерме и массовая дифференциация внутренней клеточной у эмбрионов предимплантационной мыши.

Аннотация

Методы подавления и сверхэкспрессии генов играют важную роль в идентификации генов, участвующих в эмбриональном развитии. Прямая модификация генов-мишеней в преимплантационных эмбрионах дает возможность изучить основные механизмы генов, участвующих, например, в клеточной дифференцировке в трофэктодерму (TE) и внутреннюю клеточную массу (ICM). В данной статье мы описываем протокол, в котором рассматривается роль неогенина в качестве аутентичного рецептора для первоначального определения клеточной судьбы в преимплантационных эмбрионах мышей. Во-первых, мы обсуждаем экспериментальные манипуляции, которые использовались для получения усиления и потери функции неогенина путем микроинъекций кДНК и шРНК неогенина; эффективность этого подхода была подтверждена сильной корреляцией между попарными уровнями экспрессии красного флуоресцентного белка (RFP) или зеленого флуоресцентного белка (GFP) и иммуноцитохимическим количественном определением экспрессии неогенина. Во-вторых, чрезмерная экспрессия неогенина в преимплантационных эмбрионах мышей приводит к нормальному развитию ВКМ, в то время как нокдаун неогенина вызывает аномальное развитие ВКМ, подразумевая, что неогенин может быть рецептором, который передает внеклеточные сигналы, приводящие бластомеры к ранней клеточной судьбе. Учитывая успех этого подробного протокола в исследовании функции нового рецептора, специфичного для стадии эмбрионального развития, мы предполагаем, что он может помочь в исследовании и идентификации других генов, специфичных для стадий, во время эмбриогенеза.

Введение

Преимплантационная эмбриональное развитие можно разделить на несколько различных стадий, от стадии одной клетки к морулы и бластоцисты. Многое данные свидетельствуют о том, что полярность и позиционные сигналы играют роль в раннем определении судьбы клеток в трофэктодерме (TE) и массы внутренней клетки (ИВМ). Тем не менее, характер репликами, как они преобразованных в клеточные сигналы, а также физиологические условия, в которых такие сигналы способны инициировать клеточной линии дифференцировки не известны. Эти дифференцированные клетки затем проходят специализацию, начинает приобретать характерные структуры и функции , необходимые для правильного формирования эмбриона и роста плаценты 1-3.

Предимплантационной эмбрионов особенно поддаются манипулированию путем прямой инъекции модифицированных генетических материалов, таких как миРНК или кДНК-мишени и, таким образом, могут быть использованы для изучения конкретных молекул-мишеней. Существует растущее понимание того, что генетическаяанализ эмбрионов позвоночных имеет решающее значение для углубления нашего понимания эмбрионального развития 4. Точное введение гена дикого типа или мутантной формы в эмбрион в своевременном контексте для достижения амплитудно или с потерей функции гена значительно облегчило изучение онтогенетически регулируемых генов. Убыт- и амплитудно-оф-функции с помощью микроинъекции генетических материалов в отдельных ранних эмбрионов не млекопитающих и млекопитающих сравнительно просто из - за их большого размера и большой восприимчивостью 5. Микроинъекция обычно выполняется с использованием не-вирусные векторы. Особое преимущество было принято за легкости использования невирусных векторов над вирусными векторами и трансгенов. Быстрое убыт- или система экспрессии усиления из-функции у эмбрионов мышей была разработана , что позволяет анализировать и понять функции генов в позвоночном эмбриологии 6,7.

Флуоресцентным эмбрионов значительно облегчит выбор MICRoinjected или генетически модифицированных эмбрионов и в то же время предоставляют средство для непрямого количественную оценку уровня экспрессии микроинъецировали миРНК или кДНК , основанный на интенсивности флуоресценции 8. Для выполнения этой маркировки, флуоресцентный белок, кДНК GFP или RFP, являются совместно вводят либо в виде слитых конструкций или по отдельности. Интенсивность флуоресценции GFP или RFP показывает степень экспрессии миРНК или чужеродной ДНК, чтобы гарантировать, что убыт- или получить его функции, было достигнуто.

Здесь мы приводим протокол микроманипуляций для убыт- и усиления посещающих функции методики, которая позволила нам идентифицировать neogenin как рецептор, который передает внеклеточные сигналы важные в начале дифференцировки клеток у эмбрионов предимплантационной мыши.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Примечание: Все процедуры для животноводства и заботами были проведены в соответствии с правилами IACUC из Sahmyook университета, Сеул, Южная Корея.

1. суперовуляции, Селекция и Яйцевод Изоляция

  1. Поддерживать инбредных мышей C57BL / 6 при следующих условиях: 22 ± 3 ° C, ~ 60% влажности, 12 ч цикл свет / темнота, и вода и пища вволю.
  2. Побудить суперовуляцию из 3-5-недельных самок мышей путем внутрибрюшинной инъекции 5 МЕ беременной кобылы сыворотке гонадотропина (PMSG) в количестве 0,1 мл / голову с последующим 48 ч позже внутрибрюшинной инъекции 5 МЕ человеческого хорионического гонадотропина (ХГ) в количестве 0,1 мл /глава.
  3. Сразу же после инъекции ХГЧ, мате суперовуляции индуцированных самок с половозрелых самцов того же штамма, держа их в той же самой клетке в течение ночи.
  4. На следующее утро, подтверждают успешное спаривание наличием матовую пробки или вагинального пробки на женских половых путей.
  5. Жертвоприношение беременных самок мышейСО 2 опьянение с последующим смещением шейных позвонков 18-20 ч после инъекции ХГЧ.
  6. Откройте брюшной полости, разрезав кожу, а затем в брюшную слой с тонкими ножницами.
  7. Возьмите рога матки с тонким пинцетом и отодвигать матки, яйцеводов, яичник и жировой ткани мягко из полости тела.
  8. Вырезать область между яйцеводе и яичнике с мелкими ножницами. Переставьте пинцета и разрезают матку возле яйцевода, в результате чего по меньшей мере, 1 см от верхней части матки прилагается.
  9. Перенести яйцевода ампулу на 35 мм чашки Петри, содержащие среду М16 при комнатной температуре. Бассейн яйцеводах от нескольких мышей в том же блюде.
  10. Поместите посуду под стереомикроскопа для извлечения эмбрионов.

2. Поиск и культура 2-пронуклеарной (2-ПН) Эмбрионы

  1. Отрежьте конец 30 или 32 G иглы для подкожных инъекций, растереть его в тупой кончик, и использовать его в качестве промывочной иглы.
  2. использованиетонким пинцетом, чтобы скользить конец яйцевода на промывочной иглы. Слегка нажмите на кончик иглы промывочного против дно тарелки, чтобы удерживать его на месте. Промыть яйцевод с ~ 0,1 мл M16 среды для высвобождения эмбрионов 2-PN в чашку Петри.
  3. Восстановление эмбрионов 2-ПН наряду с окружающими кучевые массы из промытой среды М16 под стереомикроскопа с использованием стерильного стеклянной пипетки и перенести их в новую чашку Петри.
  4. Диссоциируют кумулюсных клетки из эмбрионов 2-PN ферментативным расщеплением с 1,0 мл 0,1-0,5% гиалуронидазы в фосфатно-солевом буфере Дульбекко (DPBS) при 37 ° С в течение 5-10 мин.
  5. Оголять эмбрионов, осторожно пипеткой со стеклянной пипеткой и физического удаления кучевые клеток.
  6. Промыть Зачищенное эмбрионов три раза с 30-50 мл свежей фосфатно-солевого буферного раствора (PBS) в эмбрионе.
  7. Инкубируйте эмбрионов в 35 мм пластиковой чашке Петри в М16, дополненной 10 мг / мл бычьего сывороточного альбумина (БСА, Fractиона V) , при 37 ° С в 5% CO 2 в увлажненном инкубаторе до тех пор , пока микроинъекции сделано, которая, как правило , меньше , чем 4 часа позже.

3. Эмбрион с обратной транскрипцией (ОТ) и полимеразной цепной реакции (ПЦР)

  1. Собирают по крайней мере 10 эмбрионов из каждой стадии вплоть до стадии бластоцисты и объединить их в 4,0 мкл 5х обратной транскриптазы раствора предварительной смеси, содержащей обратной транскриптазы, ингибитор РНКазы, олиго- дТ праймер, случайный 6mers, дНТФ смесь, и реакционный буфер в ПЦР-трубки.
  2. Добавить РНКазы дистиллированная H 2 O до полного объема 20 мкл , и разрушать ультразвуком Отстоявшийся эмбрионов в течение 30 сек при 200 Вт немедленно начать реакцию RT при 42 ° С в течение 1 ч , а затем 5 мин инкубации при 95 ° С.
  3. Для каждого 5,0 мкл кДНК раствора генерируемой, проводят обычную ПЦР - амплификации с использованием праймеров для neogenin, Cdx2, Sox2, Tead4, Nanog, последовательности праймеров Oct3 / 4, или β-актина (приведены в таблице 1. ПЦР состоит из 40 циклов 15 сек инкубации при 95 ° С, 30 с при температуре отжига ( как показано в Таблице 1), и 30 с при 72 ° С.
  4. Отдельные продукты ПЦР с помощью электрофореза в агарозном геле 2% и визуализации геля в УФ-свете после окрашивания бромистым этидием.
  5. Нормализация экспрессию генов мишеней против бета-актина уровней.

4. Иммуноцитохимическая эмбрионов

  1. Закрепить эмбрионов из каждой стадии 4% параформальдегида в PBS в течение 30 мин при комнатной температуре с последующим кратковременным промывкой 3 раза PBS, содержащим 0,01% BSA.
  2. Проницаемыми Клеточные мембраны путем инкубирования 10 эмбрионов в 1,0 мл PBS, содержащего 0,1% Tween 20 и 0,1% Тритон Х-100 при комнатной температуре в течение 10 мин.
  3. Для того, чтобы блокировать неспецифические связывания инкубировать проницаемыми эмбрионов в 1,0 мл PBS с добавлением 10% нормальной козьей сывороткой в ​​течение 30 мин при комнатной температуре.
  4. Выдержите заблокированное эмбрионов остроумиеч кролика против neogenin антител в разведении 1: 100 в PBS, содержащем 0,1% бычьего сывороточного альбумина в течение ночи при 4 ° С.
  5. После трех промывок в течение 30 секунд каждый в каплях PBS, инкубировать эмбрионов либо с Alexa 488-конъюгированного IgG козы к антителам кролика или Alexa 568-конъюгированного козьего анти-кроличьего IgG в разведении 1: 500 в растворе PBS / БСА в течение ночи при температуре 4 ° С ,
  6. Для визуализации актиновые филаменты, инкубировать эмбрионов в 1 мкг / мл фаллоидином в PBS в течение 1 ч при комнатной температуре.
  7. Пятно ядра путем добавления 5 мл ПБС, содержащего 1 мкг / мл DAPI (4 ', 6-диамидино-2-фенилиндол, дигидрохлорида) в течение 5 мин при комнатной температуре.
  8. Вымойте эмбрионов в три раза на короткое время с PBS.
  9. Перенос эмбрионов на предметное стекло и покрывают их с каплей минерального масла.
  10. Возьмите изображения при увеличении 1,000X с конфокальной микроскопии с возбуждением соответствующей длины волны.

5. Получение Neogenin-RFP и Neogenin-миРНК GFP плазмид

  1. Subклонировать кДНК, кодирующей мыши neogenin в белок красный флуоресцентный (RFP) -содержащий вектора, что приводит к neogenin-флаг-ЗП.
  2. Подклон небольшой шпилька РНК таргетирования neogenin в Protein Emerald Green Fluorescent (EmGFP) -содержащий вектор, в результате pcDNA-EmGFP-MIR-neogenin (показано на рисунке 1).
  3. Amplify как neogenin флаг-RFP и pcDNA-EmGFP-Mir-neogenin плазмид и очистить их с традиционными методами.
  4. Отрегулировать конечные концентрации плазмид до ~ 1,0 мкг / мл в стерильном Трис-ЭДТА (ТЕ) буфера.

6. Микроинъекция плазмид в 2-PN Эмбрионы

  1. Вымойте денудированные 2-ПН эмбрионов один раз, кратко, со свежими СМИ М16.
  2. Центрифуга эмбрионов 2-PN в течение 10 мин при 1000 х г в настольной центрифуге, чтобы обеспечить наблюдение за пронуклеусов.
  3. Инкубируйте эмбрионов в микро - капли 20-30 мкл M16 сред на эмбрион под минеральным маслом при температуре 37 ° С в 5% CO 2 в течение дополнительнальная 1-2 ч.
  4. Изготовление инъекционные пипетки и удерживающие пипетки, потянув боросиликатного стекла капиллярной трубки (OD = 1,2 мм; ID = 0,94 мм) с механическим съемника.
  5. Изготовить инъекционные пипетки, чтобы иметь тупые советы и полированные отверстия <длина наконечника 500 мкм и 1-2 мкм наконечника внутреннего диаметра, используя микромельница и microforger.
  6. Изготовить проведение пипеток таким образом, что они имеют тупые советы и полированные отверстия с внутренним диаметром 20 мкм и наружным диаметром 100 мкм.
  7. инжекционные нагрузки пипеток с достаточным количеством (> 200 нл) плазмидной раствора при 1,0 мкг / мкл.
  8. Microinject ~ 10 мкл раствора плазмиды для каждого 2-ПН эмбриона в один из пронуклеусов с использованием microinjector, прикрепленную к моторизованным микроманипулятором; В ходе этого процесса, держать эмбрионов в положении с помощью отрицательного давления с удерживающей пипеткой.
  9. После того, как микроинъекции, мыть эмбрионов 2-PN 3 раза со свежим M16 сред для лESS чем 1 мин каждый раз.
  10. Культура зародыши 2-PN в капле свежей среде М16 на пластиковую чашку для культивирования, покрытой каплей минерального масла, чтобы предотвратить испарение средств массовой информации.
  11. Обратите внимание эмбрионов на 24 интервалов ч в дифференциально-интерференционного контраста (DIC) инвертированным микроскопом при увеличении 200X.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Мы обнаружили , что neogenin временно экспрессируется на ранних стадиях развития эмбрионов предимплантационной мыши, появляются уже на стадии 2-клеточного и прочного до начала морулы , но становится дефицитом на поздней морулы и бластоцисты этапов (рис 2А). Кроме того, пространственное распределение neogenin было ограничено, главным образом, за пределами клетки. Результаты анализа ОТ-ПЦР согласовывались с ранней и переходной природы neogenin выражения, достигая максимума...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В настоящем протоколе, мы демонстрируем новые способы микроинъекции генетических материалов, либо кДНК или shRNA, в эмбрионах 2-ПН мыши, чтобы исследовать роль neogenin в ранней дифференцировки клеток во время эмбриогенеза мыши. Генетическая модификация предимплантационной эмбрионов является мощным средством в раскрытии ключевой информации о базовых молекулярных механизмов, например, первого определения клеточных клонов. Генетическая модификация является одним из наиболее часто используемых методов для выяснения функции...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют конкурирующих финансовых интересов раскрывать.

Благодарности

Авторы также хотели бы отметить группу доктора Сюна в Грузии медицинских наук университета для производства и обмена конструкций для neogenin кДНК и shRNA векторов. Это исследование было поддержано грантами Программы фундаментальных исследований (Science 2013R1A1A4A01012572), финансируемого Фондом Корейского научно-исследовательского и научно-исследовательского гранта от Sahmyook университета.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
M16средний,Gibco BRL (Гранд-Айленд, Нью-Йорк)M7292 LOT# 11A832
Сыворотка для козы, Dako (Glostrup, Дания)X0907
PMSGFolligon, Intervet, HollandG4877-1000IU LOT#SLBD0719V
Минеральное маслоSigma AldrichCG5-1VL LOT# SLBC6783V
хорионического гонадотропина человека и гонадотропина сыворотки крови беременной кобылы (Intervet, Голландия)(invitrogen , 15596-026)
SuperScript® III Обратная транскриптазаlifetechnologies18080-044
ПЦР предварительная смесь ( Bioneer, Daejon, S. Korea)GenDEPOT, A0224-050
Agarose (молекулярный класс)BioRad161-3101
Раствор параформальдегида, 4% в PBSAffymetrix США19943
поликлональное антитело кролика против неогенинаSanta Cruz Biotechnology, USSC-15337
Alexa fluor 488 меченые анти-кроличьи антителаМолекулярные зонды (Invitrogen, США)A-11094
Alexa fluor 555 меченые молекулярные зонды против антител к кроликам(Invitrogen, США)A-21428
Alexa Fluor® 555 молекулярные зонды фаллоидина(Invitrogen, США)A34055
DAPI (4',6-диамидино-2-фенилиндол, дигидрохлоридInvitrogen, СШАD1306
Рекомбинантный человеческий RGM-C/ГемоджувелинR&;D системы3720-RG
все плазмидные конструкции Профессор Вэнь Чэн Сюн в Университете медицинских наук Джорджии (Агуста, Джорджия).Для настоящего исследования были любезно предоставлены 
Неон®   Трансфекционная системаlifetechMPK10096
Стерео Microscrope
Микромэнпуляция с NikonNikon Narishige ONM-1
МикроинжекторNikon NarishigeGASTIGHT #1750
ДержательNikon NarishigeIM 16
MicrofugeNikon NarishigeКофемолка Narishige MF-900
ПуллерNarishigeEG400
PullerSutter Instrumnet компанииP-97
CO2 инкубаторThermo Scientific FormaEW-39320-16
Veriti® 384-луночный термоамплификатор Технологии жизни4388444
) Микромэнпуляция Nikon SMZ1000

Ссылки

  1. Yamanaka, Y., Ralston, A., Stephenson, R. O., Rossant, J. Cell and molecular regulation of the mouse blastocyst. Dev. Dyn. 235 (9), 2301-2314 (2006).
  2. Sasaki, H. Mechanisms of trophectoderm fate specification in preimplantation mouse development. Dev. Growth Differ. 52 (3), 263-273 (2010).
  3. Nishioka, N., Yamamoto, S., Kiyonari, H., Sato, H., Sawada, A., Ota, M., et al. Tead4 is required for specification of trophectoderm in pre-implantation mouse. Mech. Dev. 125 (3-4), 270-283 (2008).
  4. Ovitt, C. E., Schöler, H. R. The molecular biology of Oct-4 in the early mouse embryo. Mol. Hum. Reprod. 4 (11), 1021-1031 (1998).
  5. Stein, P., Schindler, K. Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment. J. Vis. Exp. (53), e2851(2011).
  6. Shin, M. R., Cui, X. S., Jun, J. H., Jeong, Y. J., Kim, N. H. Identification of mouse blastocyst genes that are down regulated by double-stranded RNA-mediated knockdown of Oct-4 expression. Mol. Reprod. Dev. 70 (4), 390-396 (2005).
  7. Khang, I., Sonn, S., Park, J. -H., Rhee, K., Park, D., Kim, K. Expression of epithin in mouse preimplantation development: Its role in compaction. Dev. Biol. 281, 134-144 (2005).
  8. Prieto, D., Aparicio, G., Machado, M., Zolessi, F. R. Application of the DNA-Specific Stain Methyl Green in the Fluorescent Labeling of Embryos. J. Vis. Exp. (99), e52769(2015).
  9. Lee, J. H., Choi, S. S., Kim, H. W., Xiong, W. C., Min, C. K., Lee, S. J. Neogenin as a receptor for early cell fate determination in preimplantation mouse embryos. PLoS One. 9 (7), e101989(2014).
  10. Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77 (12), 7380-7384 (1980).
  11. Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Yagle, M. K., Palmiter, R. D. Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 4438-4442 (1985).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Убыт- и Gain-оф-функции подход к расследованию Early Cell Судьба определителям предимплантационной эмбрионов мыши
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.