Цель этого протокола заключается в описании убыт- и амплитудно-метода функции, который применим для идентификации neogenin в качестве рецептора стадиеспецифический, что приводит к трофэктодерме и массовая дифференциация внутренней клеточной у эмбрионов предимплантационной мыши.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Убыт- и Gain-оф-функции подход к расследованию Early Cell Судьба определителям предимплантационной эмбрионов мыши
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Методы подавления и сверхэкспрессии генов играют важную роль в идентификации генов, участвующих в эмбриональном развитии. Прямая модификация генов-мишеней в преимплантационных эмбрионах дает возможность изучить основные механизмы генов, участвующих, например, в клеточной дифференцировке в трофэктодерму (TE) и внутреннюю клеточную массу (ICM). В данной статье мы описываем протокол, в котором рассматривается роль неогенина в качестве аутентичного рецептора для первоначального определения клеточной судьбы в преимплантационных эмбрионах мышей. Во-первых, мы обсуждаем экспериментальные манипуляции, которые использовались для получения усиления и потери функции неогенина путем микроинъекций кДНК и шРНК неогенина; эффективность этого подхода была подтверждена сильной корреляцией между попарными уровнями экспрессии красного флуоресцентного белка (RFP) или зеленого флуоресцентного белка (GFP) и иммуноцитохимическим количественном определением экспрессии неогенина. Во-вторых, чрезмерная экспрессия неогенина в преимплантационных эмбрионах мышей приводит к нормальному развитию ВКМ, в то время как нокдаун неогенина вызывает аномальное развитие ВКМ, подразумевая, что неогенин может быть рецептором, который передает внеклеточные сигналы, приводящие бластомеры к ранней клеточной судьбе. Учитывая успех этого подробного протокола в исследовании функции нового рецептора, специфичного для стадии эмбрионального развития, мы предполагаем, что он может помочь в исследовании и идентификации других генов, специфичных для стадий, во время эмбриогенеза.
Введение
Преимплантационная эмбриональное развитие можно разделить на несколько различных стадий, от стадии одной клетки к морулы и бластоцисты. Многое данные свидетельствуют о том, что полярность и позиционные сигналы играют роль в раннем определении судьбы клеток в трофэктодерме (TE) и массы внутренней клетки (ИВМ). Тем не менее, характер репликами, как они преобразованных в клеточные сигналы, а также физиологические условия, в которых такие сигналы способны инициировать клеточной линии дифференцировки не известны. Эти дифференцированные клетки затем проходят специализацию, начинает приобретать характерные структуры и функции , необходимые для правильного формирования эмбри....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Примечание: Все процедуры для животноводства и заботами были проведены в соответствии с правилами IACUC из Sahmyook университета, Сеул, Южная Корея.
1. суперовуляции, Селекция и Яйцевод Изоляция
- Поддерживать инбредных мышей C57BL / 6 при следующих условиях: 22 ± 3 ° C, ~ 60% влажности, 12 ч цикл свет / темнота, и вода и пища вволю.
- Побудить суперовуляцию из 3-5-недельных самок мышей путем внутрибрюшинной инъекции 5 МЕ беременной кобылы сыворотке гонадотропина (PMSG) в количестве 0,1 мл / голову с последующим 48 ч позже внутрибрюшинной инъекции 5 МЕ человеческого хорионического гонадотропина (ХГ) в количестве 0,1 мл /глава.
- Сразу....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Мы обнаружили , что neogenin временно экспрессируется на ранних стадиях развития эмбрионов предимплантационной мыши, появляются уже на стадии 2-клеточного и прочного до начала морулы , но становится дефицитом на поздней морулы и бластоцисты этапов (рис 2А). Кроме того, пространственное распределение neogenin было ограничено, главным образом, за пределами клетки. Результаты анализа ОТ-ПЦР согласовывались с ранней и переходной природы neogenin выражения, достигая максимума.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В настоящем протоколе, мы демонстрируем новые способы микроинъекции генетических материалов, либо кДНК или shRNA, в эмбрионах 2-ПН мыши, чтобы исследовать роль neogenin в ранней дифференцировки клеток во время эмбриогенеза мыши. Генетическая модификация предимплантационной эмбрионов является мощным средством в раскрытии ключевой информации о базовых молекулярных механизмов, например, первого определения клеточных клонов. Генетическая модификация является одним из наиболее часто используемых методов для выяснения функции.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют конкурирующих финансовых интересов раскрывать.
Благодарности
Авторы также хотели бы отметить группу доктора Сюна в Грузии медицинских наук университета для производства и обмена конструкций для neogenin кДНК и shRNA векторов. Это исследование было поддержано грантами Программы фундаментальных исследований (Science 2013R1A1A4A01012572), финансируемого Фондом Корейского научно-исследовательского и научно-исследовательского гранта от Sahmyook университета.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| M16 | средний,Gibco BRL (Гранд-Айленд, Нью-Йорк) | M7292 LOT# 11A832 | |
| Сыворотка для козы, | Dako (Glostrup, Дания) | X0907 | |
| PMSG | Folligon, Intervet, Holland | G4877-1000IU LOT#SLBD0719V | |
| Минеральное масло | Sigma Aldrich | CG5-1VL LOT# SLBC6783V | |
| хорионического гонадотропина человека и гонадотропина сыворотки крови беременной кобылы | (Intervet, Голландия) | (invitrogen , 15596-026) | |
| SuperScript® III Обратная транскриптаза | lifetechnologies | 18080-044 | |
| ПЦР предварительная смесь | ( Bioneer, Daejon, S. Korea) | GenDEPOT, A0224-050 | |
| Agarose (молекулярный класс) | BioRad | 161-3101 | |
| Раствор параформальдегида, 4% в PBS | Affymetrix США | 19943 | |
| поликлональное антитело кролика против неогенина | Santa Cruz Biotechnology, US | SC-15337 | |
| Alexa fluor 488 меченые анти-кроличьи антитела | Молекулярные зонды (Invitrogen, США) | A-11094 | |
| Alexa fluor 555 меченые молекулярные зонды против антител к кроликам | (Invitrogen, США) | A-21428 | |
| Alexa Fluor® 555 молекулярные зонды фаллоидина | (Invitrogen, США) | A34055 | |
| DAPI (4',6-диамидино-2-фенилиндол, дигидрохлорид | Invitrogen, США | D1306 | |
| Рекомбинантный человеческий RGM-C/Гемоджувелин | R&;D системы | 3720-RG | |
| все плазмидные конструкции | Профессор Вэнь Чэн Сюн в Университете медицинских наук Джорджии (Агуста, Джорджия). | Для настоящего исследования были любезно предоставлены | |
| Неон® Трансфекционная система | lifetech | MPK10096 | |
| Стерео Microscrope | |||
| Микромэнпуляция с Nikon | Nikon Narishige ONM-1 | ||
| Микроинжектор | Nikon Narishige | GASTIGHT #1750 | |
| Держатель | Nikon Narishige | IM 16 | |
| Microfuge | Nikon Narishige | Кофемолка Narishige MF-900 | |
| Пуллер | Narishige | EG400 | |
| Puller | Sutter Instrumnet компании | P-97 | |
| CO2 инкубатор | Thermo Scientific Forma | EW-39320-16 | |
| Veriti® 384-луночный термоамплификатор | Технологии жизни | 4388444 |
Ссылки
- Yamanaka, Y., Ralston, A., Stephenson, R. O., Rossant, J. Cell and molecular regulation of the mouse blastocyst. Dev. Dyn. 235 (9), 2301-2314 (2006).
- Sasaki, H. Mechanisms of trophectoderm fate specification in preimplantation mouse development. Dev. Growth Differ. ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
