Методическая статья

Количественное нитевидных актина (F-актин) Puncta на крысиной корковых нейронов

11.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/53697

⸱

10 февраля 2016 г.

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory Program in Behavioral, Neuroscience, Department of Psychology, University of South Carolina

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Филаментозный актин (F-актин) играет важную роль в спиногенезе, синаптической пластичности и синаптической стабильности. Таким образом, количественное определение F-актина puncta является полезным инструментом для изучения целостности синаптических структур. В этом протоколе описаны процедуры количественного определения F-актина puncta, меченного фаллоидином в культурах первичных корковых нейронов низкой плотности.

Аннотация

Нитчатых актина белок (F-актина) играет важную роль в spinogenesis, синаптической пластичности и синаптической стабильности. Изменения в дендритных F-актин богатых структур предложить изменения в синаптической целостность и связность. Здесь мы предлагаем подробный протокол для культивирования первичных крысиных корковых нейронов, фаллоидином окрашивание для F-актина Puncta и последующих методов количественного. Во-первых, фронтальная кора E18 крысиных эмбрионов диссоциируют на культуре низкой плотности клеток, затем нейроны, выращенные в пробирке в течение по крайней мере 12-14 дней. После экспериментального лечения, кортикальные нейроны окрашивали AlexaFluor 488 фаллоидином (маркировать дендритных F-актина Puncta) и ассоциированный с микротрубочками белок 2 (map2; для проверки нервных клеток и дендритных целостности). Наконец, специализированное программное обеспечение используется для анализа и количественной оценки случайно выбранных нейронов дендриты. F-актин богатых структур идентифицируются на дендритных ветвей второго порядка (диапазон длины 25-75 &# 181; м) при непрерывном map2 иммунофлюоресценции. Протокол, представленные здесь будет полезным методом для исследования изменений в дендритных синапсов структур последующих экспериментальных процедур.

Введение

Основная цель данного исследования заключается в разработке надежного метода измерения (оценки) синаптической целостности нейронов дендритных сети. Здесь мы опишем количественный анализ F-актина Puncta в первичной крыса культивируемых нейронов, используя комбинацию фаллоидином окрашивания и иммуноцитохимическое (МУС) обнаружения дендритов с последующим анализом с использованием специализированного программного обеспечения (NIS-Elements).

Меченые phallotoxins имеют схожую аффинность к больших и малых нитей (F-актин), но не связываются с мономерной шаровое актина (Г-актина), в отличие от некоторых актина антителами 1. Неспецифическое связывание из фаллоидином незначительна, тем самым обеспечивая минимальный фон во визуализации клетки. Фаллоидином намного меньше, чем антитела, которые обычно используемых для обозначения клеточных белков для флуоресцентной микроскопии, который делает возможным более интенсивное маркировки F-актина фаллоидином. Таким образом, детальные изображения F-актина локализации в нейронах может бытьполучены при использовании меченого фаллоидином.

Фаллоидином (F-актин) окрашивание нейронов дендриты генерирует дискретные "горячие точки" или ярко "Puncta", которые представляют собой различные дендритных структур, в том числе зрелых шипов, без колючих синапсов 2 и незрелых шипами. Незрелые шипы включают тонкие филоподий и некоторые формы патч морфологии, и может представлять собой начало spinogenesis 3. Незрелые шипы и без колючих пластыри хватает PSD95 4. Изменения в производстве F-актина приводит к последующим изменениям не только в шипов, но и дополнительных дендритных структур, в результате чего фаллоидином важным инструментом для исследования synaptodendritic целостность 5-7. В общем, количество фаллоидином-положительной (F-актин) Puncta отражать баланс между активными синапсов (возбуждающих и тормозных), динамику актина и стабильности синапсов 8.

Хотя важно, чтобы изучить специфические Тypes синапсов (т.е. возбуждающие шипов), когда мишень для лечения неизвестна надо сначала оценить общую целостность различных дендритных структур. Так как F-актин является основным компонентом дендритных шипиков и других структур, в том числе тормозных синапсов, различным числом F-актина Puncta может указывать на synaptopathy. Это synaptopathy затем может быть исследован в дальнейшем для более конкретных изменений. Наш метод количественное для обнаружения нескольких синаптические типы / структуры дает общую оценку дендритных синаптических изменений (увеличений и уменьшений) следующих различных экспериментальных методов лечения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все протоколы животных были рассмотрены и одобрены уходу и использованию комитета животных в Университете Южной Каролины (количество обеспечение: A3049-01) по.

1. Низкая плотность нервные эмбриональные Культура

  1. Подготовка к первичной коркового нейрона культуры
    1. Решения:
      1. Подготовьте поли-L-лизина исходного раствора растворением 5 мг поли-L-лизин в 10 мл боратного буфера.
      2. Подготовьте рабочий раствор путем разбавления 1 мл поли-L-лизин складе в 49 мл боратного буфера.
      3. Подготовьте боратный буфер, рН 8,4, начиная с 395 мл дН 2 O, а затем добавить все ингредиенты (1,24 г борной кислоты + 1,9 г буры). Регулировка рН до 8,4 с помощью 1 М NaOH. Отрегулируйте до 400 мл и фильтруют с 0,2 мкм нейлоновый мембранный фильтр под капотом.
      4. Приготовьте раствор HBSS, рН 7,2, начиная с 445 мл дН 2 O и добавляя все остальные ингредиенты (50 мл 10X HBSS Стоковые + 1,2 г HEPES). Регулировка рН до 7,2 с помощью 1 N HCl, BRIнг до 500 мл и фильтруют с 0,2 мкм фильтр из нейлона мембраны под капотом.
      5. Подготовьте осажденный среду: DMEM / F12 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки. Фильтр с 0,2 мкм фильтр нейлоновый мембранный под капотом.
      6. Подготовить всю среду для роста: До 50 мл среды Neurobasal, добавить добавки (500 мкл GlutaMAX (100X) + 500 мкл Глюкоза + 1 мл B-27 (50X) + 500 мкл антибиотикам противогрибкового раствора (100х) + 100 мкл 7,5% бикарбонат натрия. фильтр с 0,2 мкм фильтр нейлоновый мембранный под капотом.
    2. За два дня до культуры:
      1. Coat двенадцать 35 мм со стеклянным дном блюда с 2 мл рабочего раствора поли-L-лизин и держать под капотом O / N.
    3. За один день до культуры:
      1. Пустой покрывающий агент из блюд и промыть DDH 2 O. Разрешить блюда высохнуть в течение часа под капотом.
      2. Подготовьте покрытие среды (DMEM / F12 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (10% от общего раствора). Внесите 2 мл среды вкаждое блюдо, и инкубировать O / N при 37 ° С, 5% СО 2.
        Примечание: Важно, чтобы избежать пластиковые чашки для культивирования при культивировании. Использование стеклянным дном посуды (для инвертированных микроскопов) или покровные стекла (для вертикальных микроскопов) дает четкие и ясные изображения. По сравнению с пластиковым дном блюдо, со стеклянным дном блюдо избегает нежелательных оттенков или бликов во флуоресцентной микроскопии.
  2. Протокол Клеточная культура:
    1. Положите в холодильнике HBSS буфера (100-150 мл), 100 мм чашках Петри, пинцет, ножницы, 50 мл трубки и 15 мл пробирки под УФ-светом в капот.
    2. Эвтаназии беременных крыс с летальным ингаляции 5% севофлурана под капотом пределами комнатной культуре.
    3. Стерилизовать 70% этанола, палатки коже нижней части живота с помощью щипцов во время резки из хвоста в середине брюшной cavity.Open матка с помощью ножниц, чтобы выставить через плаценту.
    4. Удалить 8-10 E18 плодов. Пласе 8-10 плодов в чашки Петри, содержащие раствор HBSS.
    5. Держите затылок плода щипцами, а затем использовать ножницы, чтобы отрезать голову от тела. Поместите его в другом Петри, наполненной 5-7 мл HBSS. Передача блюдо, чтобы капот.
    6. Заполните два дополнительных 100 мм чашки Петри с холодной HBSS.
    7. Пил сторону черепа, и совок мозг в новой чашки Петри, наполненной HBSS.
    8. Используйте острые изогнутые щипцы, отдельный мозжечок и ствол мозга от мозга, а затем перенести мозг в новом Петри с холодной HBSS в нем.
    9. Используйте пинцет, чтобы обеспечить, отделить полушария с изогнутыми щипцами. Удалить мозговых оболочек; изолировать лобной коры и кусочки передачи в отмеченных 15 мл центрифужные пробирки.
    10. Заполните 15 мл пробирку со свежим 2 мл HBSS и добавить 20 мкл трипсин ЭДТА (10x концентрированную смесь с 0,5% трипсина и 5,3 мМ ЭДТА). Каждому 15 мл пробирку.
    11. Инкубируйте 10-15 мин при комнатной температуре. Аккуратно водоворот трубку каждые несколько минут, не позволяют исчерпывающим.
    12. Мтер 10-15 мин, использование стеклянной пипетки, чтобы удалить старую HBSS и дважды промыть новой HBSS.
    13. Погрузитесь в ингибитор трипсина (1 мг мл, 2 мг ингибитора / Трипсин в 2 мл HBSS), хорошо перемешать и оставьте на 5 мин. Промыть дважды свежей HBSS.
    14. Используя стеклянную пипетку с резиновой грушей, растирают штук мозга 10-15 раз очень медленно, чтобы избежать bubbles.Triturate снова с помощью калиброванного пипетку и стерильный наконечник с уменьшенным диаметром наконечника очень медленно до гомогенного состояния.
    15. Передача диссоциируют клеток при требуемой плотности в заранее подготовленные, покрытые культуральные чашки (50 клеток / мм2). Выдержите O / N при 37 ° С, 5% СО2.
    16. Через 24 часа заменить DMEM / F12, с свежеприготовленный бессывороточной среде Neurobasal полная роста.
    17. Поддержание клеток во все времена в 5% CO 2/95% воздуха в помещении увлажненном инкубаторе в течение по крайней мере 12-14 дней до эксперимента. Дополнение клетки каждые 5-6 дней свежей средой Neurobasal замены примерно 50% старой среде.

2. Люминесцентные Маркировка и Иммуноцитохимическая

Примечание: иммунофлуоресцентного маркировка первичных культурах корковых клеток проводили в стеклянным дном 35 мм чашках для культивирования клеток с рабочим объемом 1 мл.

  1. Промыть со стеклянным дном блюдо дважды фосфатно-солевом буфере, рН 7,4 (PBS).
  2. Устранить клетки с 4% параформальдегидом в течение 15 минут при комнатной температуре.
  3. Промыть клетки дважды PBS и проницаемыми с 0,1% Triton X-100 в PBS в течение 5 мин.
  4. Treat клетки в течение 20 мин при комнатной температуре с F-актина конкретного пятна, AlexaFluor 488 фаллоидином (1:40, 25 мкл фаллоидином в 1 мл PBS).
  5. Промыть клетки дважды PBS и блокируют с 10% нормальной козьей сывороткой при комнатной температуре в течение 1-2 ч.
  6. Развести куриные поликлональных анти-map2 антитела (1: 2500) в PBS с 2% нормальной козьей сывороткой и инкубировать O / N при 4 о С.
  7. После инкубации, промыть в PBS в два раза.
  8. Развести вторичными антителами (Alexa Rред 594-конъюгированного козьего антитела против IgG куриное (1: 500) с 2% нормальной козьей сывороткой и инкубировать в течение 2 ч при комнатной температуре.
  9. Промыть PBS и добавить 10 мкл / блюдо Hoescht красителя.
  10. Выдержите 3 мин при комнатной температуре и промывают PBS в два раза.
    Примечание: меченые клетки теперь готов к шагу 3 (F-актин счетной Puncta).
  11. Сохранение клеточного образца с 100 мкл реагента antifade как coverslipping агента и держать при температуре 4 ° С в темноте в течение длительного хранения.
    Примечание: фаллоидином относительно стабилен в PBS при 4 ° С в темноте в течение до 1 недели и флуоресценции может быть сохранена с antifade coverslipping реагентов. Тем не менее, оптимальные изображения получаются из 1-3 дней после окрашивания, так как фаллоидином может начать диффундировать с длительного хранения.

3. F-актин Puncta Подсчет

  1. Включите флуоресцентным микроскопом и переключиться на 20 × цели. Открытое программное обеспечение микроскопа, а также создать программу на × 960 пикселей размером изображения 1280, и 0,1разрешение изображения / пиксель 7 мкм на 1 × зумом.
  2. Получение изображений СО-меченых F-актина / map2 нейронов под зеленым (495 нм) / красный (613 нм) флуоресцентных каналов.
  3. Выберите 5 Зеленый (F-актин) / Красный (map2) immunolabeled / синий (Hoescht) флуоресцентные изображения индивидуального нейрона с четко определенными дендритных беседки.
  4. Определить F-актин богатых структур в дендритных сегменте второго порядка (диапазон длины 25-75 мкм) с непрерывным map2 иммунофлюоресценции.
  5. Поворот выделенной области изображения в горизонтальном уровне. Копирование и вставка в виде нового изображения.
  6. Вычтите фон изображений, используя последовательную корректировку для каждого блюда.
  7. Подсчитайте ярко-зеленый F-актин Puncta и проследить длину выбранного дендритных сегменте вручную обученным независимых наблюдателей. Экспорт данных в файл электронной таблицы.
  8. Рассчитайте плотность путем деления общей F-актина с надписью Puncta (N) на длину (L) из КАРТА 2 меченого дендриты. Экспресс данные как количество F-ACолова Puncta за 10 мкм дендритов
    Примечание: Puncta (размер ≤1.5 мкм) из F-актина флуоресценции с пиковой интенсивности, по крайней мере 50% выше средней интенсивности окрашивания в дендритной вала были включены в каждой выбранной дендритной сегмента.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В нынешних методов, мы впервые культуры крысы корковых нейронов при низкой плотности в 35 мм с прозрачным дном посуды, что позволяет выявить дендритов отдельных нейронов. На рисунке 1, дифференциального интерференционного контраста (DIC) изображения показывают морфологические изменения в развитии плода крысы корковых нейронов в дни 4, 6, 10, 14, 21 и 27 в пробирке. Заметим, что длина и количество дендритов увеличивается с созреванием культивируемых первичных кры...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этом протоколе, мы описываем культивирования крысы корковых нейронов при низкой плотности в 35 мм с прозрачным дном посуды, которая позволяет нам идентифицировать дендритов отдельных нейронов. Далее, мы используем фаллоидином и map2 окрашивание для выявления дендритные изменения. Затем мы использовали специализированное программное обеспечение для количественной оценки изменений в F-актин Puncta.

Для определения изменений в F-актин Puncta вся нейронная сеть отдельного нейрона должны быть о...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Ни у одного из авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявить.

Благодарности

Эта работа финансировалась грантами NIH DA013137, DA031604 и HD043680. Частичная поддержка была предоставлена в виде гранта NIH T32 на обучение в области биомедицинско-поведенческих наук.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
35 мм Стеклянное дно Тарелка No1.5 Покровное стеклоMatTek CorporationP35G-1.5-20-C
DMEM/F12 mediumLife Technologies10565-018
Трипсин-ЭДТАLife Technologies15400-054
Поли-L-лизинSigmaP9155
Борная кислотаSigmaB0252
БураSigmaB9876
GlutaMaxLife Technologies35050-061100X
глюкозаVWR101174Y
HBSSSigmaH464110X
Нейробазальная средаLife Technologies21103-049
B-27 добавкаLife Technologies17504-04450X
Антибиотик-антимикотик решениеCellgro30004CI100X
Бикарбонат натрияLife Technologies25080
Ножницы VannasWorld Precision Instruments500086
Ножницы с диафрагмойWorld Precision Instruments500216
Щипцы с диафрагмойWorld Precision Instruments15914
Dumont #7 ЩипцыWorld Precision Instruments14097
Dumont #5 ЩипцыWorld Precision Instruments14095
ProLong GoldLife TechnologiesP36930
Параформальдегид SigmaP6148
Защитное стеклоVWR631-0137
AlexaFluor 488 ФаллоидинLife TechnologiesA12379
Нормальная лошадиная сывороткаLife Technologies26050-070
Курица поликлональная анти-MAP2abcamAb92434
Alexa Red 594-конъюгированная коза антикурица IgGLife TechnologiesA11042
NucBlue Окрашивание живых клеток ReadyProbes Реагент Hoescht 33342Life TechnologiesR37605
NIS-Elements программный пакетNikon Instruments
Nikon Eclipse TE2000-E инвертированный флуоресцентный микроскоп с компьютерным управлением Приборы
0.2 μ m Нейлоновый мембранный фильтр NalgeneFishersci151-4020
Nikon

Ссылки

  1. Heller, E. A., et al. The biochemical anatomy of cortical inhibitory synapses. PLoS One. 7, e39572(2012).
  2. Craig, A. M., Blackstone, C. D., Huganir, R. L., Banker, G. Selective clustering of glutamate and gamma-aminobutyric acid receptors opposite terminals releasing the corresponding neurotransmitters. Proc Natl Acad Sci USA. 91, 12373-12377 (1994).
  3. Johnson, O. L., Ouimet, C. C. A regulatory role for actin in dendritic spine proliferation. Brain Res. 1113, 1-9 (2006).
  4. Rao, A., Craig, A. M. Signaling between the actin cytoskeleton and the postsynaptic density of dendritic spines. Hippocampus. 10 (5), 527-541 (2000).
  5. Matus, A., Ackermann, M., Pehling, G., Byers, H. R., Fujiwara, K. High actin concentrations in brain dendritic spines and postsynaptic densities. Proc Natl Acad Sci USA. 79, 7590-7594 (1982).
  6. Allison, D. W., Gelfand, V. I., Spector, I., Craig, A. M. Role of actin in anchoring postsynaptic receptors in cultured hippocampal neurons: differential attachment of NMDA versus AMPA receptors. J Neurosci. 18, 2423-2436 (1998).
  7. Sekino, Y., Kojima, N., Shirao, T. Role of actin cytoskeleton in dendritic spine morphogenesis. Neurochem Int. 51, 92-104 (2007).
  8. Zhang, W., Benson, D. L. Stages of synapse development defined by dependence on F-actin. J Neurosci. 21 (14), 5169-5181 (2001).
  9. Bertrand, S. J., Aksenova, M. V., Mactutus, C. F., Booze, R. M. HIV-1 Tat protein variants: Critical role for the cysteine region in synaptodendritic injury. Exp Neurol. 248, 228-235 (2013).
  10. Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Aksenova, M. V., Espensen-Sturges, T. D., Booze, R. M. Synaptodendritic recovery following HIV Tat exposure: neurorestoration by phytoestrogens. J Neurochem. 128 (1), 140-151 (2014).
  11. Lau, P. M., Zucker, R. S., Bentley, D. Induction of filopodia by direct local elevation of intracellular calcium ion concentration. J Cell Biol. 145, 1265-1275 (1999).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

MAP2

Похожие статьи