Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

В Vivo Функциональное мозга изображений подход, основанный на Биолюминесцентный кальция Индикатор GFP-акворина

11.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/53705

⸱

8 января 2016 г.

 ,  , 
1Equipe: Imagerie Cérébrale Fonctionnelle et Comportements (ICFC), Institut des Neurosciences Paris-Saclay (Nero-PSI), UMR-9197, CNRS/Université Paris Sud, 2Interdisciplinary Program in Neuroscience, Graduate College, University of Iowa, 3Department of Anesthesia, Carver College of Medicine, University of Iowa

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем роман Ca 2+ -imaging подход с использованием биолюминесцентного репортера. Этот подход использует конденсированную конструкт GFP-экворин, который связывается с Са 2+ и излучает свет, устраняя необходимость в возбуждении светом. Значительно этот метод позволяет длительной непрерывной визуализации, доступ к глубинных структур головного мозга и высоким временным разрешением.

Аннотация

Функционал естественных изображений стала мощным подход к изучению функции и физиологию клеток головного мозга и структур, представляющих интерес. Недавно был разработан новый метод Ca 2+ -imaging помощью биолюминесценции репортер GFP-экворин (GA). Этот новый метод опирается на слияния GFP и экворин генов, производя молекулу, способную связываться кальций и - с добавлением его кофактора коэлентеразина - излучающих яркий свет, который можно наблюдать через фотонов коллектора. Трансгенные линии, несущие ген GFP в-экворин были получены для мышей и Drosophila. У Drosophila, ген GFP-экворин был помещен под контроль системы двоичной GAL4 / UAS позволяет направленной экспрессии и визуализации в головном мозге. Этот метод впоследствии было показано, чтобы быть способным обнаруживать и внутрь Ca 2+ -transients и Са 2+ -released от внутренних магазинов, Самое главное это позволяет в большей продолжительности в непрерывной записи изображений на больших глубинах в пределах мозга, и записи на высоких временным разрешением (до 8,3 мс). Здесь мы представляем основной метод для использования биолюминесцентного изображений для записи и анализа Ca 2+-активности в течение грибных тел, структуру центрального к обучению и памяти в летучей мозга.

Введение

Основная рисунка и функции деятельности в головном мозге и его отдельных структур уже давно является областью интенсивного изучения в области неврологии. Возможно, некоторые из самых ранних успешных подходов, используемых для решения этого вопроса были прямыми физиологическое измерение изменения в электрической активности - однако альтернативные методы, которые позволяют жить визуализации изменений напряжения, рН или кальция концентрации (как прокси-сервер для деятельности) привели дополнительные возможности для изучение нейронной активности 1. Методы визуализации выполнять широкий спектр преимуществ, таких как снижение инвазивности и способности контролировать деятельность в целом структур головного мозга. Кроме того, в животных с послушными генетики в том числе плодовой мушки дрозофилы, развитие генетически кодируемых показателей кальция, таких как Cameleon, GCaMPs и других 1 позволили исследователям следить одиночные нейроны, нейронные популяции и весь мозгструктуры. В то время как более традиционные люминесцентные методы визуализации кальция с помощью GCaMPs (GFP, слитый с кальмодулина) или беспокоиться (CFP и YFP, слитый с кальмодулина) оказались полезные методы, обеспечивающие хорошее пространственное и временное разрешение, основной процесс светового возбуждения порождает некоторые ограничения на его экспериментальное Приложения. Из-за природы света возбуждения, флуоресценции, фото-отбеливания, и фототоксичности неизбежно производимого, которые, следовательно, ограничивает глубину структур, которые могут быть отображаемого, продолжительность записи, а также непрерывность реального времени записи. Другими словами, записи, часто должна быть выполнена с перерывами, чтобы избежать этих нежелательных побочных эффектов.

Из-за этих проблем, были разработаны дополнительные альтернативные методы визуализации кальция. Одним из наиболее перспективных методов биолюминесцентного изображений, которая опирается на свете получаемой посредством ферментативной реакции после связывания кальция. Bioluminescenт изображения не требует света возбуждения и, следовательно, не испытывает те же трудности, как и обычные изображения кальция. Биолюминесцентного репортера акворина - изолирован от Aequorea Виктория, то же самое, из которого медузы GFP был также isolated- связывает кальций помощью трех ручных EF структур и проходит конформационное изменение, что приводит к окислению его кофактора коэлентеразином и выхода синего света (λ = 469 нм) 2,3. Акворина имеет очень низкое сродство к кальцию (K D = 10 мкм), что делает его идеальным для мониторинга переходных кальция, поскольку он производит очень мало шума и фонового не мешает системе буферизации внутриклеточного кальция 4. Хотя экворин ранее использовался для наблюдения за процессом индукции нервной в Xenopus яйца 5 свет производится слишком тусклый, чтобы использовать для реального времени визуализации нейронной активности. В целях решения этой проблемы, Филиппа Br &# 251; пусть и коллеги в Институте Пастера создали генетическую конструкцию слияния GFP и экворин гены, имитируя естественное состояние в 4 медуз. Этот ген слитого продукта связывает кальций снова с помощью трех ручных EF структур акворина, которые претерпевает конформационное изменение, ведущий к окислению коэлентеразином, который передает энергию без радиационно к GFP. Эта передача энергии приводит к высвобождению зеленого света (λ = 509 нм) с GFP, а не синим светом от акворина. Слияние GFP и акворина также придает большую стабильность белка помогает слитого белка производят свет от 19 до 65 раз ярче, чем в одиночку экворин 4. Использование биолюминесцентного подход в головном мозге расширяется текущее экспериментальное использование визуализации кальция как с точки зрения длительности непрерывной записи и количества структур в головном мозге, которые могут быть записаны. В широком смысле в контексте предыдущей работы это означает, что как глобальные и большееРазнообразие регионализации "деятельности" мозга могут контролироваться (через прокси-сервер переходных кальция). Что еще более важно деятельность может контролироваться дольше, в режиме реального времени и постоянной основе, которые легко поддается погоне за полного понимания базисной функции в головном мозге.

В последние несколько лет, наша лаборатория и другие разработали трансгенных мух, выражающие GFP-экворин под контролем двоичной системе экспрессии (GAL4 / UAS-GFP-экворин) 5,6. Мы использовали GFP-экворин биолюминесценции для записи активности при естественных раздражителей, таких как запах 7,8, а также изученных клеточных компонентов, модулирующих Ca 2+-активности в грибных тел следующих рецептора ацетилхолина стимуляции прямой никотиновой применения 9. Кроме того, мы также использовали GFP-экворин решить ряд экспериментальных вопросов, которые не смогли быть рассмотрены ранее, как долгосрочныеизображения спонтанных переходных кальция и визуализации глубоких структур головного мозга 10. Совсем недавно мы использовали систему / UAS GAL4 выразить млекопитающих рецептор АТФ Р2Х 2 11 катион канала, в проекционных нейронов (ПНС) и использовать систему Lexa, чтобы выразить GFP-экворин в грибных тел (MB247-Lexa, 13XLexAop2-ИВС-G5A-ВР) (любезность Б. Пфайффер, Janelia Farm, США). Это позволило нам активизировать ПН применением СПС, в свою очередь, активирует грибные тела (вниз по течению целевых ПНС), имитируя более естественные условия, такие как ответ на запах раздражитель. В целом этот метод объединения Р2Х 2 и GFP-экворин расширяет экспериментальные возможности. В широком смысле это дает возможность лучше понять закономерности деятельности мозга, инициируя новые исследования о том, как различные стимулы и возмущения могут изменять базальную паттерна активности.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Получение образцов

  1. Приготовление растворов и настроить
    1. Поддерживать все дрозофилы линии на 24 ° C по стандартной пищевой среде. Задняя и держать их при низкой плотности во флаконе для генерации стандартизированного размера и веса мух.
      1. Добавьте 10 девственных самок с 10 мужчин в пробирке, пусть спариваться и передавать их через каждые 2 дня на свежем флакон. Затем 10 дней спустя, когда мухи начинают eclose, урожай мух каждый день. Держите точный учет возраста мух и держать их в хорошем состоянии.
      2. В 3-й день, отделить самцов от самок и держать самок мух за 20 флакона. Запишите мух на 4 или 5 дней от роду.
    2. Готовят раствор Рингера с следующих концентрациях: 130 мм NaCl, 5 мМ КСl, 2 мМ MgCl 2, 2 мМ CaCl 2, 5 мМ HEPES и 36 мМ сахарозы и регулировать рН раствора, чтобы точно 7,3. Подготовка перфузии решения 25 ц; М никотина и 100 мМ KCl в растворе Рингера.
    3. Подготовьте 1000 мкл пипетки: с помощью кончика лезвия форма для бритвы уклоном (примерно 35 ° от конца наконечника) и снимите излишки базу за 1 ½ см от кончика.
    4. Подготовьте коробку для хранения (23 см х 17 см х 8,5 см) образца во время инкубации. Поместите два губки (12 см х 8 см х 3 см) насыщенных водой в низ [для предотвращения высыхания образец] ниже небольшую стойку аппарата разместить образцы на их получение завершено.
    5. Подготовка образцов мух, так что они содержат, по меньшей мере 1 экземпляр УАС-GFP-акворина и один экземпляр строки Gal4 ездить выражение GFP-акворина. OK107 Gal4 линия (линия выражение вождения в первую очередь в грибных тел) пересекается с UAS-GFP-акворина в этой подготовке.
      Примечание: Внутри коробки должно быть водонепроницаемым и снаружи должны блокировать свет от входа окно для предотвращения деградации коэлентеразином во время инкубации.
  2. Приготовительныйтовка образцов
    1. Лед обезболить дрозофилы путем передачи его в стеклянном флаконе и держать на льду в течение 2 мин, после чего переехал в охлажденной чашке Петри для размещения на кончике пипетки. Подготовка наконечники на слегка смоченной фильтровальной бумаги в 100 мл чашке Петри на льду под микроскопом рассечение.
    2. Аккуратно пинцетом месте летать внутри пипетки.
    3. Используя щетку осторожно нажмите и выровнять муху, так что головка полностью за край наконечника и область дорсальной частично подвергается секцией удалены во наконечника формирования (Фигура 2В).
    4. Комбинат небольшие (примерно 3-4 мкл) части двух компонентов зубной клея. Нанесите клей тщательно вокруг передней и задней головы и шеи до и вокруг пипетки наконечник краю - избежать темя. Пусть клей сохнуть в течение 2 мин.
    5. Место пипетки с клееного лету через отверстия в записи камеры (рис 2D) и генTLY нажмите чтобы обеспечить на месте.
    6. Объедините две компоненты клея кремния (примерно 3-4 мкл). Нанесите клей на плоской стороне камеры вдоль края, где камера и пипетки встречаются, чтобы предотвратить утечку раствора Рингера. Пусть клей сохнуть в течение 2 мин.
  3. Рассечение
    1. Прикрепите ленты на перфузии канала, коротким краем и распространяется на задней части камеры.
    2. Поместите камеру с лету на рассечение блока под микроскопом свою очередь на люминесцентной лампе. Внесите 1 мл раствора Рингера в камеру.
    3. Используйте тонкую хирургическую нож, чтобы удалить кутикулу. Сделайте надрезы параллельно от задней части головы до усиков регионе. Затем разрезать вдоль края глаза затем сделать надрез перпендикулярно над антенной, соединяющей предыдущие разрезы. Сделать окончательный разрез параллельно, что в задней части головы. Используйте мелкие острые щипцы для удаления кутикулы (рис 2С).
    4. Используйте мелкие острые щипцы осторожно схватитьD убрать подвергается дыхания ткани, пока мозг и [флуоресцирующий] тела гриба не четко визуализируется.
    5. Используйте ультра-острые щипцы тщательно понять и щепотку нейроэпителиальных ткани, покрывающей мозг, чтобы позволить проникновение в коэлентеразина.
      Примечание: В качестве альтернативы папаин можно использовать для проницаемыми нейроэпителия 9.
    6. С помощью пипетки, вымыть два раза с раствором Рингера для удаления любого мусора от вскрытия и место образца в темный ящик.
    7. Внесите 1 мл раствора Рингера, содержащего 5 мкМ бензил-коэлентеразин в камеру. Закройте окно и позволить инкубации с коэлентеразином при комнатной температуре в течение как минимум 2 ч.

2. изображений

  1. Настроить
    1. Начните системы записи: включить микроскоп, компьютер, фотоаппарат и дренажной системы и установленного комнате экологического контроля до 25 ° C.
    2. Открыть Измерение и программа Automation Explorer на компьютере. Нажмите на “ Устройства и интерфейсы ", а затем дважды нажмите на" NI Motion Devices "и, наконец, щелкните правой кнопкой на" PCI-7334 "и выберите" инициализации устройства ".
    3. Откройте Photon Imager. Создать новую папку и имя первого файла записи. Камера должна достичь -80 ° С перед система будет функционировать.
    4. Настройка перфузии система - добавить KCl, никотин, и раствор Рингера для водоемов и регулировать таким образом, каждое решение разрядов в 2 мл / мин. Промыть раствором Рингера до начала эксперимента.
  2. Подготовка образца
    1. Место установки блока формирования изображения на блюдо горе под микроскопом на увеличении 5X и вставьте перфузии трубки в канал через прокол.
    2. Установите микроскоп флуоресцентный режим, то центр и принести грибные тела (MBS) в центре внимания. Отрегулируйте 20X и повторного-центра и фокуса.
    3. Позиция дренажное устройство дренажной над бассейном, отрегулируйте высоту дренажного шунта так, чтобы кончик просто Абове бассейн, и запустить раствор Рингера для 30 сек, чтобы обеспечить достаточный дренаж.
    4. Потяните вниз щит для герметизации аппарата от света. Использование автоматизированной системы в фотонной тепловизора точной регулировки фокуса и принять ссылка флуоресцентное изображение МБ.
  3. Запись
    1. Регулировка скорости фотонов на необходимую скорость записи (от 50 мс до 1 сек или более). Выберите режим фотонов и открытый затвор. Запись генотип, пол, возраст и номер образца в записи журнала. Отрегулируйте положение коробки ROI более чашечки и клеточных тел (CCB) и медиальной долей нажав на коробках ROI и перетащив удерживая контроль.
    2. Запись базовой около 5 до 10 мин (по желанию).
    3. Применить никотина в течение 1 мин. Примечание запустить / остановить в журнале. Промыть раствором Рингера в течение 5 мин.
    4. Подождите 5 минут для восстановления и подготовки KCl запись журнала и таймер.
    5. Применить KCl в течение 1 мин. Примечание запустить / остановить в журнале. Промыть раствором Рингера в течение 1 мин.
    6. Переключательфлуоресцентного режиме, принять окончательное флуоресцентное изображение и выключите раствор Рингера.
    7. Нажмите "Остановить". Диалоговое окно попросит выключить систему. Выберите "Нет", чтобы продолжить запись.
    8. Открыть щит, дренажная система шаг, переключатель линзовый объектив с 5-кратным, удалить перфузии трубку. Удалить образец / записи блюдо из стадии очистки от 20X объектив, промывки и протирки линз в два раза водой.
    9. Нажмите белую кнопку воспроизведения в верхней части окна программы, чтобы начать следующий запись.

3. Анализ и видео Создание

  1. Извлечение значения фотонов
    1. Откройте программу анализа фотонов (например, Фотон просмотра) и открыть файл электронной таблицы первый образец.
    2. Выберите вкладку управления дисплеем. Выберите ROI, нажав на области, удерживая контроль. Отрегулируйте размер, ориентацию и форму регионах, представляющих интерес, чтобы охватить GFP подсветкой CCB и медиальной долей.
    3. Добавить добавлениеаль ROI, нажав "Определить рентабельность инвестиций" и перетаскивая на экране, чтобы создать новую ROI.
    4. Выберите вкладку "Кино", чтобы играть фотонов видео. Отрегулируйте ширину "сек" и "шаги ТРЦ" по желанию. Отрегулируйте расположение ROI по мере необходимости.
    5. Выберите представительства скриншоты GFP флуоресценции, никотина и ответ KCl ответ. Земледелие скриншоты и паста изображения в презентации слайд для последующего анализа и сравнения.
    6. Отрегулируйте как "ширина сек" и "сек шаг" к скорости записи в секундах. Выберите длину анализа, перемещая серые маркеры на верхней панели, чтобы кронштейн регионе до начала стимула и сразу после окончания реакции.
    7. Выберите "Приостановить Просмотры играя" нажмите "<< REW" и нажмите "PLAY>". Выберите вкладку "Граф Оценить Chart" и отрегулируйте единиц по желанию и цвета линии в соответствии с цветом ROI.
    8. Когда анализ завершенНажмите "Экспорт граф скорость передачи данных". Выберите скриншоты комбинированного звукозаписей CCB и медиальной доли интересующей области от каждой стороны. Земледелие скриншоты и паста изображения в слайд с изображением реагирования. Этот слайд будет позже использоваться в конечном счете.
  2. Пример Анализ: один метод анализа извлеченных данных фотонов подробно
    1. Откройте файлы электронных таблиц в "скорость счета экспорт" папку.
    2. Переформатировать ячеек первого столбца помечены время, чтобы показать время в час и минут.
    3. Ссылки на соответствующий слайд для образца. Удалить все значения, кроме колонн на время и два представительства РИ.
    4. Определить никотина стимуляции время начала - доступны в файле журнала входа в главный папке- удалить дополнительные данные до начала или выделить значение.
    5. Найти высокий / пиковое значение для обоих CCB и медиальной доли и марки / подсветки.
    6. Определить начало отклика и время окончания иБКК и медиальная лопасть, создавая оценку, используя временную точку из соответствующих графике ответа на слайде и выберите фактическое значение по изменению значений в близости к этим пунктам. Выделите область между этими точками как в БКК и средних долях. В качестве альтернативы, используйте макрос 9.
    7. Смешайте все образцы одной экспериментальной группе на новую электронную таблицу.
    8. Выравнивание на пике путем определения значения строка для каждой пикового значения CCB. Вычтите более низкие значения от самого высокого значения строки, чтобы определить приблизительное значение строки, где что выборочные данные должны быть переписано в. Убедитесь, что все пиковые значения выравниваются.
    9. Скопируйте лист два раза и удалить либо медиальной колонки лепестков или CCB столбцы создание страницы только CCB или медиальных значений лепестков.
    10. Удалить данные после все ответы CCB закончились. Создать четыре строки помечены Всего Фотоны, длина ответа (длительность), максимальная амплитуда и реагирования Latency. Скопируйте и вставьте этот раз ниже оригинала.
    11. Используйте функцию СУММ для определения общих фотоны во ответ. Используйте функцию COUNT для определения длины ответа. Скопируйте и связать высокую стоимость ячейки для определения пикового значения амплитуды. Использование функции COUNT - выбрать из начала перфузии никотина до начала реакции - для определения реакции задержки.
    12. Копирование значения с помощью функции связывания и размножаться (все, кроме пиковой амплитуды) по скорости записи в секундах.
    13. Бар / коробка графики могут быть созданы для расчетных параметров, таких как фотоны, Всего пиковой амплитуды и длины реагирования, при желании (напр .: рис 5B, C, D).
    14. В столбце после сырого ответ фотонов данные, в среднем сырые баллы данных для каждого момента времени с использованием функции усреднения. При желании следовать с колонки, определяющего стандартную ошибку среднего (SEM), для каждого из усредненных значений фотонов в момент времени.
    15. Используйте среднюю колонку построить среднюю Profil ответе [График] для образца БКК группы. Для этого выберите столбец с указанием времени, как значения по оси Х и колонки средних значений фотонов как у оси и, наконец, выберите инструмент создания графа рассеивания.
    16. Повторите эту процедуру анализа с данными медиальных лепестков.
  3. Создание изображений для видео
    1. Открыть для просмотра фотонов.
    2. Выберите вкладку управления дисплеем. Нажмите на ROI, удерживая контроль, чтобы выбрать, удалить и / или минимизации его.
    3. Измените ширину ", ТРЦ" (время накопления), а требуется определить содержание каждого кадра.
    4. Изменить "сек шаг", чтобы определить перекрытие каждого кадра.
    5. Выберите "вид экспорта, играя" нажмите кнопку "<< REW", затем "PLAY>". Изображения для видео будет экспортироваться в папку "вид экспорта" в серии .png файлов.
  4. Использование Virtual Dub, чтобы видео: один метод для видео Создание подробная
    1. Создайте новую папку с именем "Обменяй свои PlayMoney" в папке, содержащей вид экспорта изображения.
    2. Принесите сценарий (renommer.VBS) в папке изображений.
    3. Двойной щелчок по renommer.VBS бежать.
    4. Изображения будут автоматически переименована численно и скопировать в папку "Обменяй свои PlayMoney".
    5. Открыть virtualdub.exe.
    6. Выберите открытый видео файл - выберите первое изображение (последующие изображения будут автоматически загружать).
    7. Выберите видео - выберите частоту кадров отрегулировать по желанию.
    8. Выберите видео - выберите сжатия выберите Cinepak Codec радиусом.
    9. В файле выберите Сохранить как AVI видео будет создана автоматически.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Слияние GFP в акворина позволяет визуализировать нашу область интереса до биолюминесценции визуализации с помощью возбуждения GFP в люминесцентной режиме на микроскопе (3А, 4А, 6А, 6E). Один из самых простых способов, чтобы стимулировать грибовидные тела через активизацией ионотропных никотиновых рецепторов ацетилхолина. Хотя ацетилхолин эндогенным лигандом этого рецептора мы обнаружили, что никотин производит более воспроизводимые реакции в грибных тел. Это отчасти потому, что они специально выразить н...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Недавно разработанный биолюминесцентного основе GFP-экворин Представленный здесь подход позволяет в естественных условиях функциональной записи Ca 2+-активности в различных нейронов, а также, при желании, в другой вид клеток, таких как почки звездчатых клеток, как сообщается в Кабреро др. 2013 5.

Изменения, устранения неисправностей, дополнительные компоненты, и критические шаги

Дрозофи...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы в долгу перед Э. Карплюсом из Sciences Wares, США, за его драгоценную и полезную помощь и советы. Мы благодарим Э. Карбогнина, А. Авет-Рошекса, М. Мурму,. Паво, Д. Миноччи, Г. Винатье, Ж. Стиннакре за их вклад в развитие и совершенствование этой техники. Мы также благодарим Б. Пфайффера и Г. Рубина, Janelia Farm, H.H.M.I., Ashburn, США, за линейку pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BP. Эта работа была поддержана стипендией Шатобриана, посольством Франции в Вашингтоне, США А. Ларку, Национальным научным фондом (IOS 1352882) Т. Китамото, а также французскими ANR (ANR-05-NEUR-009 Drosaequorin, 2005 и FlyBrainImaging, 2011), Региональным советом Иль-де Франс (NeRF и DIM), IFR-144, Программой интерфейса Physique-Chimie-Biologie Программы CNRS (2009). и CNRS, Франция JR Martin.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
NaClSigma-AldrichS3014
CaCl2Merck1023911000
HEPESSigma-Aldrich7365-45-9
KClprolabo26 764.298normapur
MgCl2prolabo25 108.295normapur
сахарозаSigma-AldrichS0389
НикотинSigma-AldrichN3876
АТФSigma-AldrichA2383Аденозин 5′-трифосфат динатриевая соль гидрат
бензил-целомтеразинаProlume, nanolight Cat #301 Coelenterazine hhttp://www.prolume.com/
стоматологический клей3M ESPE™46954Силиконовый клей Protemp IV
3M ESPE&торговля;36958Express 2 Regular Body Quick
Tape3M Scotch122s3M Scotch Magic Tape
наконечники для пипетокCorning Incorporated4868100-1,000 &; l Univesal Pipette
Tip камера и держатель (ступень)
инкубационная коробкаработы
ручные щипцы (No 5)Fine Science Tools11252-00Микрорассекающие щипцы
изогнутые щипцыSigma-AldrichF4142Микрорассекающие щипцы
аппликатор клея Ручная работа 
ножFine Science Tools10316-145 мм Глубина 15° колющий
EM-CCD камера AndorDU-897E-CS0-#BViXon (охлажденный до -80 градусов; C)
МикроскопNikonEclipse-E800
иммерсионный объективNikon20X Fluor .5w
диссекционный микроскоп с флуоресценциейLeica MZ Fl IIILeica Dissection Scope и люминесцентная лампа
плотный темный ящикScience WaresИзготовлен на заказ Science Wares
перистальтический насос Трубка GilsonMinipuls 2
Fisher Scientificзависит от толщиныTygon R3603, система перфузионной обработки St-Gobain
Warner64-0135  ( VC-66CS)Система управления перфузионным клапаном, в комплекте, с пережимными клапанами, 6-канальными
регуляторами перфузииLeventon201108исследователем измерения и автоматизации Dosi-flow 3
Sciences Wares & National InstrumentsН/Дпрограммное обеспечение http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380
фотонным формирователем изображений Научные товары и National InstrumentsН/Дпрограммное обеспечение http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380
просмотрщиком фотоновScience Wares & National InstumentsН/Дпрограммное обеспечение http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380
ExcelMicrosoft Н/Дпрограммное обеспечение https://www.microsoft.com
виртуальном дубляжеоткрытого доступа Н/Дпрограммное обеспечение http://virtualdub.sourceforge.net/
UAS-GA2Martin et al., 2007, Ref. 1 Н/ДНет акций {в настоящее время} в открытом доступе 
pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BP   Б. Пфайффер, Janelia Farms, Эшберн, США.(STOCK #1117340)pfeifferb@janelia.hhmi.org
P2X2Lima and Misenboeck, Ref. 11 Н/ДНет акций {в настоящее время} в открытом доступе 
OK107Блумингтон стоковый центр854http://flystocks.bio.indiana.edu/
ручной

Ссылки

  1. Martin, J. -R. In vivo brain imaging: fluorescence or bioluminescence, which to choose. J Neurogenet. 22 (3), 285-307 (2008).
  2. Shimomura, O., Johnson, F. H. Peroxidized coelenterazine, the active group in the photoprotein aequorin. Proc Natl Acad Sci USA. 75 (6), 2611-2615 (1978).
  3. Shimomura, O., Johnson, F. H., Saiga, Y. Further data on the bioluminescent protein, aequorin. J. Cell. Comp. Physiol. 62 (1), 1-8 (1963).
  4. Baubet, V., et al. Chimeric green fluorescent protein-aequorin as bioluminescent Ca2+ reporters at the single-cell level. Proc Natl Acad Sci USA. 97 (13), 7260-7265 (2000).
  5. Cabrero, P., Richmond, L., Nitabach, M., Davies, S. A., Dow, J. A. T. A biogenic amine and a neuropeptide act identically: tyramine signals through calcium in Drosophila tubule stellate cells. Proc. Biol. Sci. 280 (1757), 20122943(2013).
  6. Leclerc, C., Webb, S. E., Daguzan, C., Moreau, M., Miller, A. L. Imaging patterns of calcium transients during neural induction in Xenopus laevis embryos. J. Cell Sci. 113 (19), 3519-3529 (2000).
  7. Martin, J. -R., Rogers, K. L., Chagneau, C., Brûlet, P. In vivo bioluminescence imaging of Ca2+ signalling in the brain of Drosophila. PLoS One. 2 (3), e275(2007).
  8. Murmu, M. S., Stinnakre, J., Martin, J. -R. Presynaptic Ca2+ stores contribute to odor-induced responses in Drosophila olfactory receptor neurons. J. Exp. Biol. 213 (24), 4163-4173 (2010).
  9. Murmu, M. S., Stinnakre, J., Réal, E., Martin, J. -R. Calcium-stores mediate adaptation in axon terminals of Olfactory Receptor Neurons in Drosophila. BMC Neurosci. 12, 105(2011).
  10. Pavot, P., Carbognin, E., Martin, J. -R. PKA and cAMP/CNG channels independently regulate the cholinergic Ca2+-response of Drosophila mushroom body neurons. eNeuro. 2 (2), 0054-0068 (2015).
  11. Minocci, D., Carbognin, E., Murmu, M. S., Martin, J. -R. In vivo functional calcium imaging of induced or spontaneous activity in the fly brain using a GFP-apoaequorin-based bioluminescent approach. BBA-Mol Cell Res. 1833 (7), 1632-1640 (2013).
  12. Lima, S. Q., Miesenböck, G. Remote control of behavior through genetically targeted photostimulation of neurons. Cell. 121 (1), 141-152 (2005).
  13. Shimomura, O., Musicki, B., Kishi, Y., Inouye, S. Light-emitting properties of recombinant semisynthetic aequorins and recombinant fluorescein-conjugated aequorin for measuring cellular calcium. Cell Calcium. 14 (5), 373-378 (1993).
  14. Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling. Nat Rev Mol Cell Bio. 4 (7), 517-529 (2003).
  15. Fiala, A., Spall, T. In vivo calcium imaging of brain activity in Drosophila by transgenic cameleon expression. Sci STKE. 2003 (174), PL6(2003).
  16. Wang, J. W., Wong, A. M., Flores, J., Vosshall, L. B., Axel, R. Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain. Cell. 112 (2), 271-282 (2003).
  17. Wilson, R. I., Turner, G. C., Laurent, G. Transformation of Olfactory Representations in the Drosophila Antennal Lobe. Science. 303 (5656), 366-370 (2004).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Drosophila
В Vivo Функциональное мозга изображений подход, основанный на Биолюминесцентный кальция Индикатор GFP-акворина
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.