Здесь мы описываем процедуру, позволяющую детально проанализировать зависимую от фосфорилирования активацию транскрипционного фактора IRF3. Это достигается за счет комбинации SDS-PAGE с высоким разрешением и native-PAGE, связанного с иммуноблоттингом с использованием нескольких фосфоспецифических антител.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Высокое разрешение метод контроля Фосфорилирование-зависимая активация IRF3
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Транскрипционный фактор IRF3 имеет решающее значение для первой линии защиты от патогенов, в основном за счет интерферона β и экспрессии противовирусных генов. Подробный анализ активации IRF3 необходим для понимания того, как патогены вызывают или уклоняются от врожденного противовирусного ответа. Различные активированные формы IRF3 можно различить на основе их фосфорилирования и статуса мономера в зависимости от димера. Дискриминация in vivo между различными активированными формами IRF3 может быть достигнута путем разделения фосфорилированных форм IRF3 на основе сдвигов их подвижности в SDS-PAGE. Кроме того, уровни мономера и димера IRF3 можно контролировать с помощью неденатурирующего электрофореза. Здесь мы подробно описываем процедуру достижения наивысшего разрешения для получения максимальной информации о статусе активации IRF3. Это достигается за счет комбинации SDS-PAGE с высоким разрешением и native-PAGE, связанного с иммуноблотами, с использованием нескольких общих и фосфоспецифических антител. Эта экспериментальная стратегия представляет собой доступный и чувствительный подход к получению всей необходимой информации для полного анализа фосфорилированной активации IRF3.
Введение
Повсеместно и конструктивно выражается фактором транскрипции интерферон (ИФН) Нормативно-фактор 3 (IRF3) имеет решающее значение для первой линии обороны против патогенов, главным образом, через индукцию IFNβ, но и через индукцию хемокинов (CC мотив) лиганда 5 (CCL5 ) и несколько противовирусных белков, включая IFN-индуцированной белка с tetratricopeptide повторяет IFIT1 / 2/3 1-3. Активация IRF3 сообщается после инфекции с многочисленными вирусами, или воздействия полиинозиновой-полицитидиловая кислоты (поли I: C) или липополисахарида (ЛПС) 4. Важно отметить, что наиболее изученными вирусы эволюционировали механизмы, чтобы уклониться от о....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Примечание: Этот протокол, описанный здесь, используя А549 клетки, инфицированные вирусом Сендай (SeV). Однако протокол для SDS-PAGE и родной странице также работает со всеми типами человека и мыши клеток испытанных до сих пор, особенно миелоидных клеток стимулировали различными IRF3 активирующий стимулов 9,15,19,24,25.
1. Заражение клеток А549
- Поддержание клеток А549 в культуре в 15 см пластины при 37 ° С / 5% CO 2 в 20 мл F12K / Ham среду, содержащую 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки (HI-FBS) и 1% L-глутамина (полный F12K / Ветчина среда).
ПРИМЕЧАНИЕ: Все решения, использ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Рисунок 2 показывает типичную иммуноблот образ IRF3 обнаружен с IRF3 общего антител и IRF3-phosphospecific антител против Ser396 и Ser398 после разрешения ЗЦЕ по высоким разрешением SDS-PAGE. В стимулированных клетках А549, IRF3 определяется двумя полосами 50 и 53 кДа на SDS-PAGE, соответствующей нефосфорилированный (форма I) и hypophosphorylated (форма II) видов IRF3. Воздействие А549 клеток Сев за 3 - 9 ч приводит к зависимости от времени сдвига медленно мигрируют гипе.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Протокол описан здесь состоит из комбинации высокого разрешения SDS-PAGE и родной-PAGE в сочетании с использованием нескольких phosphospecific антител, чтобы отличить мономерный / димерный и phosphoforms I-IV из IRF3. Соответствующее определение этих видов IRF3 важно в полной мере характеризуют активацию IRF3 в определенной настройки. Например, стимуляция ЛПС активированными макрофагами приводит к образованию димеров, Ser396 / 398 фосфорилированного IRF3 который проявляет hypophosphorylated (форма II), но не гиперфосфор.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Благодарности
Авторы благодарят предыдущих и нынешних сотрудников лаборатории за разработку протоколов. Работа была поддержана финансированием Канадского института исследований в области здравоохранения (CIHR) [грант # MOP-130527] и Совета по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады [NSERC-355306-2012]. NG является лауреатом исследовательской кафедры Tier II Canada. AR является студентом учебной программы Исследовательской сети респираторного здоровья от Fonds de la recherche du Québec-Santé (FRQS).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| F12/Ham | Life Technologies | 11765-054 | Тепло в 37 градусов; C ванну перед использованием. |
| Фетальная бычья сыворотка | Life Technologies | 12483-020 | |
| L-глутамин | Life Technologies | 25030-081 | |
| D-PBS | Life Technologies | 14190-144 | Для клеточной культуры. |
| Трипсин/ЭДТА 0,25% | Life Technologies | 25200-072 | |
| Штамм вируса Сендай Cantell Чарльз | Ривер Лаборатории | 600503 | |
| Hepes | Bioshop | HEP001 | |
| Хлорид натрия (NaCl) | Bioshop | SOD001.5 | |
| EDTA | Bioshop | EDT001 | |
| Глицерин | Биошоп | GLY001.1 | Разрежьте конечность кончика и медленно отпишьте пипеткой, так как он очень толстый. |
| IGEPAL CA-630 | Sigma-Aldrich | I7771 | Зарегистрированная торговая марка, соответствующая октилфенокси поли(этиленокси)этанолу (Nonidet P-40) моющему средству |
| Leupeptin | Bioshop | LEU001 | |
| Aprotinin | Bioshop | APR600.25 | |
| Фторид натрия | Sigma-Aldrich | 201154 | |
| ортванадат натрия | MP Biomedicals | 159664 | активации ортованадата натрия 0,2 М: 1) Равномерное повышение pH до 10,0 с использованием либо 1 N NaOH, либо 1 N HCl. Начальный pH раствора ортотованадата натрия может варьироваться в зависимости от большого количества химических веществ. 2) Раствор желтый при pH 10,0. 3) Отварить до бесцветности. 5) Доведите pH до 10,0 и повторяйте шаги 3-4 до тех пор, пока раствор не останется бесцветным и не стабилизируется при 10,0. Храните активированные аликвоты ортованадата натрия при температуре -20°С. |
| -нитрофенилфосфат динатриевая соль гексагидрат | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| бета-глицерофосфат | Sigma-Aldrich | G6376 | |
| Реагент для анализа белка Bio-Rad | Био-Рад | 500-0006 | Цитотоксических |
| Акриламид/бис-акриламид (37,5 : 1) 40% | Bioshop | ACR005 | Цитотоксических |
| Tris-Base | Bioshop | DEO701 | |
| Соляная кислота (HCl) | LabChem | LC15320-4 | Работа под вытяжным шкафом. Токсичен и раздражает. |
| Додецилсульфат натрия (SDS) | Bioshop | SDS001.1 | раздражитель. |
| Амониум персульфат | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| TEMED | Invitrogen | 15524-010 | Токсичен и раздражает. |
| Бромофенол синий | Fisher Scientific | B392-5 | |
| Бета-меркаптоэтанол | Sigma-Aldrich | M6250 | Работа под вытяжным шкафом. Токсичен для нервной системы, слизистых оболочек. Может быть токсичен для верхних дыхательных путей, глаз, центральной нервной системы. |
| Глицин | Bioshop | GLN001.5 | |
| Дезоксихолат натрия | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| Гидроксид натрия (NaOH) | Bioshop | SHY700 | раздражитель. |
| Нитроцеллюлозная мембрана (0,45 мм) | Bio-Rad | 162-0115 | |
| Уксусная кислота ледниковый | Bioshop | ACE222.4 | Работа под вытяжным шкафом. Токсичный, раздражающий и легковоспламеняющийся. |
| Красный понсо | Sigma-Aldrich | P3504 | |
| Хлорид калия (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | Для PBS состав для иммуноблоттинга. |
| Na2HPO4 | Bioshop | SPD307.5 | Для состава PBS для иммуноблоттинга. |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | Для PBS состав для иммуноблоттинга. |
| Бычий сывороточный альбумин | Sigma-Aldrich | A7906 | Для PBS-T-BSA состав для иммуноблоттинга. |
| Обезжиренное сухое молоко | Carnation | ||
| Poly сорбат 20 (Tween) | MP Biomedicals | 103168 | Разрежьте конечность наконечника и медленно пипетывайте, так как он очень толстый. |
| Anti-IRF-3-P-Ser386 | IBL-America | 18783 | Хранить при -20 oC. Избегайте замерзания/оттаивания. |
| Anti-IRF-3-P-Ser396 | Home made<>sup19 | Store аликвотируется при -80 oC. Избегайте замораживания/размораживания. | |
| Фосфо-IRF-3 (Ser396) (4D4G) | Технология клеточной сигнализации | 4947s | хранится при -20 oC. |
| Anti-IRF-3-P-Ser398 | Home made<>sup15 | Store аликвотируется при -80 oC. Избегайте замораживания/размораживания. | |
| Anti-IRF-3-full length | Actif motif | 39033 | Хранить при -80 oC. Избегайте замораживания/размораживания. |
| Anti-IRF3-NES | IBL-America | 18781 | Store aliquoted at -20 oC. |
| Western Lightning Chemiluminescence Reagent Plus | Perkin-Elmer Life Sciences | NEL104001EA | |
| LAS4000mini CCD камера | GE healthcare | ||
| SDS-PAGE Стандарты молекулярной массы, широкий диапазон | Bio-Rad | 161-0317 | Хранение при -20 oC. |
Ссылки
- Juang, Y. T., et al. Primary activation of interferon A and interferon B gene transcription by interferon regulatory factory-3. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (17), 9837-9842 (1998).
- Lin, R., Hiscott, J.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
