Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Высокое разрешение метод контроля Фосфорилирование-зависимая активация IRF3

11.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/53723

⸱

24 января 2016 г.

 ,  ,  , 
1CRCHUM - Research center, Centre Hospitalier de l'Université de Montréal, Université de Montréal, 2Department of Biochemistry and Molecular Medicine, Université de Montréal, 3Faculty of Medicine, Université de Montréal

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы описываем процедуру, позволяющую детально проанализировать зависимую от фосфорилирования активацию транскрипционного фактора IRF3. Это достигается за счет комбинации SDS-PAGE с высоким разрешением и native-PAGE, связанного с иммуноблоттингом с использованием нескольких фосфоспецифических антител.

Аннотация

Транскрипционный фактор IRF3 имеет решающее значение для первой линии защиты от патогенов, в основном за счет интерферона β и экспрессии противовирусных генов. Подробный анализ активации IRF3 необходим для понимания того, как патогены вызывают или уклоняются от врожденного противовирусного ответа. Различные активированные формы IRF3 можно различить на основе их фосфорилирования и статуса мономера в зависимости от димера. Дискриминация in vivo между различными активированными формами IRF3 может быть достигнута путем разделения фосфорилированных форм IRF3 на основе сдвигов их подвижности в SDS-PAGE. Кроме того, уровни мономера и димера IRF3 можно контролировать с помощью неденатурирующего электрофореза. Здесь мы подробно описываем процедуру достижения наивысшего разрешения для получения максимальной информации о статусе активации IRF3. Это достигается за счет комбинации SDS-PAGE с высоким разрешением и native-PAGE, связанного с иммуноблотами, с использованием нескольких общих и фосфоспецифических антител. Эта экспериментальная стратегия представляет собой доступный и чувствительный подход к получению всей необходимой информации для полного анализа фосфорилированной активации IRF3.

Введение

Повсеместно и конструктивно выражается фактором транскрипции интерферон (ИФН) Нормативно-фактор 3 (IRF3) имеет решающее значение для первой линии обороны против патогенов, главным образом, через индукцию IFNβ, но и через индукцию хемокинов (CC мотив) лиганда 5 (CCL5 ) и несколько противовирусных белков, включая IFN-индуцированной белка с tetratricopeptide повторяет IFIT1 / 2/3 1-3. Активация IRF3 сообщается после инфекции с многочисленными вирусами, или воздействия полиинозиновой-полицитидиловая кислоты (поли I: C) или липополисахарида (ЛПС) 4. Важно отметить, что наиболее изученными вирусы эволюционировали механизмы, чтобы уклониться от ответа IRF3-опосредованной, и тем самым избежать хозяина врожденная иммунная защита 5. Таким образом, следить за активацией IRF3 имеет большое значение для понимания молекулярных механизмов врожденного антивирусного защиты хозяина, но и определить стратегию, используемую вирусов, чтобы противодействовать этот ответ.

ЛОР "> Многие опубликованных отчетов, однако обеспечивают лишь ограниченный анализ активации IRF3 исполнении мониторинга индукции IRF3-гена-мишени (IFNB1 и IFIT1) и / или гена люциферазы анализа в сочетании с электрофорезом додецилсульфата полиакриламидном геле с низким разрешением натрия (SDS- СТР) анализ IRF3. Тем не менее, многочисленные биохимические исследования, анализ поведения различных IRF3 мутантов и выяснения IRF3 кристаллической структуры 6-11 способствовали установить, что IRF3 подвергается сложной совокупности последовательных пост-трансляционных модификаций путем фосфорилирования в несколько сайтов. В комплект фосфорилирования, участвующих в активации IRF3, кажется, зависит от стимулов и, скорее всего, от типа клеток. В неинфицированных клеток, IRF3 сосуществует, как нефосфорилированный и hypophosphorylated видов содержащий phosphoresidues, в том числе Thr135 и Ser173, в 1 -198 аа N-терминальная область 6,12-14. Накопление этого hypophosphorylated FОРМ по IRF3 индуцируется стрессом индукторов, факторов роста и агентов, повреждающих ДНК 6. Фосфорилирование Ser / Thr остатков на С-концевой области IRF3 содержащей домен трансактивации срабатывает после активации вирусами, поли I: С или ЛПС в типа клеток зависимым образом 15-17. С-концевой фосфорилирования IRF3 не включает в себя не менее 7 различных phosphoacceptor сайты, организованные в двух основных кластеров, Ser385 / Ser386 и Ser396 / Ser398 / Ser402 / Thr404 / Ser405, что каждый свой вклад в активацию IRF3 через димеризации, ядерной накопления, совместно с CREB связывающий белок (СВР) / P300 коактиваторами, связывания ДНК с IFN чувствительный элемент ответа (ISRE) консенсусные последовательности и трансактивацию генов-мишеней 9,10,17-19. Фосфорилирование Thr390 также думал, внести свой ​​вклад в вирусиндуцированного активации IRF3 20. Масс-спектрометрия анализа IRF3 показали, что Ser386, Thr390, Ser396 и Ser402 остатки непосредственно phosphorylatред ингибитора киназы кВ е (IKKε) / БАК-связывающий киназы 1 (TBK1) киназ 9,10. Фосфорилирование на остатках C-терминал также требуется для прекращения активации IRF3 через polyubiquitination и протеасомного-опосредованной деградации 10. Этот процесс также зависит от фосфорилирования Ser339 в, которое необходимо для вербовки пропильного изомераза Pin1 10,11. IRF3 видов, содержащие, по крайней мере фосфо-Ser339 / 386/396 остатков рассматриваются гиперфосфорилированного формы. Точная последовательность и функции каждого сайта по-прежнему вызывает дискуссии 10,21. Теперь ясно, что активированный IRF3 не представляют однородного состояния, но различные виды активированного проявляющие различные фосфорилирования или димеризации характеристики существуют 10,22.

Для обеспечения полного понимания активации IRF3 в ответ на конкретные патогенов, он, таким образом, необходимо спaracterize котором активированных видов индуцируются. Индукция генов-мишеней IRF3, IFNB1 и IFIT1, доказала, чтобы обеспечить надежную считывание для активации IRF3. Тем не менее, мониторинг экспрессии этих генов не различать разных государств активации IRF3. Всесторонний анализ IRF3 состояниях активации в конкретных условиях зависит от детальной характеристики ее фосфорилирования и димеризации статуса 10. Нефосфорилированной (форма I) hypophosphorylated (форма II) и (гиперфосфорилированного формы III и IV), IRF3 формы 6,18,23 может быть успешно решена с помощью ограниченной подвижностью в высоком разрешении анализа SDS-PAGE. Мономерные и димерных видов IRF3 может быть эффективно определены путем анализа родном странице. Эти подходы значительно улучшена при использовании в сочетании с phosphospecific антител, направленных против различных сайтов IRF3 phosphoacceptor.

Стандартные протоколы позволяют плохой разрешениебелки, которые не позволяют эффективное разделение отличие IRF3 фосфорилированными форм. Здесь мы подробно описать процедуру, чтобы добиться самого высокого разрешения для мониторинга индукции различных вирусных активирована видов IRF3 использованием SDS-PAGE, соединенный с родной страницы в сочетании с иммуноблот помощью всего и phosphospecific антител. В естественных условиях дискриминации между различными активирована Формы IRF3 выполняется на основании их подвижности сдвигов, наблюдаемых на SDS-PAGE. Кроме того, IRF3 мономера и димера можно отличить по неденатурирующих электрофореза. Сочетание этих двух дополнительных методов с иммуноблот оказывается доступным и чувствительный подход, чтобы приобрести всю необходимую информацию для полного анализа фосфорилирования-опосредованной активации IRF3.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Примечание: Этот протокол, описанный здесь, используя А549 клетки, инфицированные вирусом Сендай (SeV). Однако протокол для SDS-PAGE и родной странице также работает со всеми типами человека и мыши клеток испытанных до сих пор, особенно миелоидных клеток стимулировали различными IRF3 активирующий стимулов 9,15,19,24,25.

1. Заражение клеток А549

  1. Поддержание клеток А549 в культуре в 15 см пластины при 37 ° С / 5% CO 2 в 20 мл F12K / Ham среду, содержащую 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки (HI-FBS) и 1% L-глутамина (полный F12K / Ветчина среда).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все решения, используемые для культуры и лечения клеток, должны быть стерильными.
  2. В 24 ч до заражения, аспирации среды и промыть клетки с 10 мл дистиллированной фосфатным буферным раствором (D-PBS) при комнатной температуре.
  3. Добавить 1 мл 0,25% раствора трипсина-ЭДТА в каждой пластине для покрытия ячейки и инкубируют при 37 ° С в течение 3 мин.
  4. Остановить инкубацию, как только йе клетки начинают отделяться от пластины мягко нажав пластину с одной стороны. Инактивации трипсина путем добавления 10 мл подогретого полный F12K / Ham среды на тарелку и передать клетки в 15 мл коническую трубку.
  5. Центрифуга при 350 х г в течение 3 мин при комнатной температуре. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 8 мл полной F12K / Ham среде с получением гомогенной суспензии отдельных клеток.
  6. Граф клеток с использованием гемоцитометра. Семенной клеток при плотности 1 х 10 6 клеток на 60 мм чашку в 4 мл предварительно нагретой полного F12K / Ham среды. Инкубировать в течение 20 - 24 ч при 37 ° С / 5% СО 2. После 20 - 24 часов, клетки образуют сливающийся 90% монослоя (это соответствует 1,5 × 10 6 клеток).
  7. Удалить среду и промыть клетки с 2 мл бессывороточной F12K среде Хама / (SFM). Добавить 2 мл свежего SFM на 60 мм пластины.
  8. Разморозить аликвоту вирус Сендай (SeV) (хранить аликвоты при -80 ° С) на льду и вихря кратко.
  9. Развести йе вирус в предварительно нагретой SFM, чтобы получить 60 HAU / 100 мкл. Смешайте с помощью пипетки вверх и вниз мягко и добавить 100 мкл разбавленного вируса на плите, чтобы выполнить инфекции в 40 HAU / 10 6 клеток. Не добавлять вирус в не-инфицированной контрольной чашке.
  10. Инкубируйте клетки в инкубаторе при 37 ° С / 5% СО 2. Перемешивают пластин вручную 3 или 4 раза, или с помощью автоматического орбитальный шейкер или помещен качалку непосредственно в инкубаторе, в течение первого часа инфекции.
  11. В 2 ч после инфекции, добавляют 2 мл F12K / Ham среде, содержащей 20% FBS HI-чтобы получить конечную концентрацию 10% HI-FBS.
  12. Инкубируйте клетки в инкубаторе при 37 ° C / 5% CO 2 в течение дополнительного 1, 4 и 7 ч, чтобы достичь общего времени инфекция 3, 6 и 9 часов, соответственно. На каждом из этих временных точек, перейдите к шагу 2.1.

2. Подготовка всей клеточные экстракты (ЗЦЕ)

  1. Снимите инфекции среду. Сбора клеток путем соскабливания в 1 млледяной D-PBS и передачи клеточной суспензии в предварительно охлажденной 1,5 мл центрифужную пробирку.
  2. Гранул клетки центрифугированием при 16000 х г при 4 ° С в течение 20 сек и тщательно декантируют все следы D-PBS.
    Примечание: На этом этапе, осадок клеток может быть непосредственно подвергают экстракции белка или быстро замораживали в жидком азоте или с сухим льдом / этанол бане и хранили при -80 ° С до лизиса.
  3. Подготовка лизирующего буфера, содержащего 50 мМ HEPES, рН 7,4, 150 мМ NaCl, 5 мМ ЭДТА, 10% глицерина и 1% Nonidet P-40 в деионизированной воде (DDH 2 O). Extemporarily добавить протеазу (1 мкг / мл лейпептина и 2 мкг / мл апротинина) и ингибиторы фосфатазы (5 мМ фторида натрия, 1 мМ ортованадата активирована натрия, 2 мМ п-нитрофенил фосфата и 10 мМ β-глицерофосфата, рН 7,5).
    Примечание: Буфер для лизиса без ингибиторов можно хранить при температуре 4 ° С. Конкретный протокол для активации ортованадат натрия описано в Таблице специфических реагентов / оборудовант.
  4. Ресуспендируют осадок клеток в 70 мкл буфера для лизиса. Обычно концентрация лизат будет около 2 мкг / мкл.
  5. Инкубируют на льду в течение 20 мин. Вспышка заморозить лизат по инкубации в бане с жидким азотом в течение 15 сек. Разморозить лизат при КТ, пока она не будет полностью расплавлены и вихрь в течение 10 сек. Повторите замораживания / оттаивания / Vortex цикл 3 раза.
    1. Кроме того, выполнение морозильной шаг в смеси этанол / сухой лед в течение 1 мин.
  6. Центрифуга при 16000 х г при 4 ° С в течение 20 мин. Передача супернатант (соответствующий WCE) к новой предварительно охлажденной 1,5 мл центрифужную пробирку. Держите WCE на льду во все времена.
  7. Количественно белки, используя любой белок процедуру количественного совместимый с буфером для лизиса, таких как Брэдфорд основе анализа белков 26.

3. Постановление ЗЦЕ высокого разрешени SDS-PAGE

  1. Подготовьте три денатурирующих электрофореза гели.
    1. Для обнаруженияIRF3 формы, залить двумя гели минимум 16 см длины с гелем разделения состоит из 7,5% акриламида / бис-акриламида (37,5: 1), 375 мМ Трис-HCl, рН 8,8 (РТ), 0,1% додецилсульфата натрия (SDS ), 1% персульфата аммония и 0,1% TEMED в DDH 2 O и концентрирующий гель, состоящий из 4% акриламида, 62,5 мМ Трис-HCl рН 6,8 (РТ), 0,05% ДСН, 1% персульфата аммония и 0,1% TEMED в DDH 2 О.
      Внимание! Акриламид, тетраметилендиамин и SDS токсичны и / или являются раздражителями. Носите защитные перчатки и манипулировать под вытяжкой.
    2. Для обнаружения SEV белков, залить одним гель минимум 8,5 см длины с характеристиками, аналогичными характеристикам геля, описанного в 3.1.1, за исключением того, что гель содержит разделение 12% акриламид.
  2. Денатурации WCE, полученного на стадии 2.6, добавив 1: 4 (об / об) 5x буфера для загрузки (125 мМ Трис-HCl рН 6,8 (РТ), 10% SDS, 20% (P / V), глицерин, 0,0005% бромфенол синий и 25% β-меркаптоэтанола в DDH 2 O) с последующим нагреванием при 100 °С в течение 10 мин. Быстрый спин трубы, чтобы сбить конденсата, который формирует в крышке.
    Внимание! β-меркаптоэтанол токсичен при вдыхании. Носите защитные перчатки и манипулировать под вытяжкой.
  3. Установите гели в миграционной аппарата. Заполните верхнюю и нижнюю камеры с рабочим буфером, содержащим 25 мМ Трис-Base, 0,1% SDS и 192 мМ глицина в дистиллированной воде (DH 2 O).
  4. Нагрузка 14 мкл стандарта молекулярного веса в одну лунку каждого 16 см геля и 7 мкл стандарта молекулярного веса в одну лунку 8,5 см геля. Нагрузка 30 мкг денатурированной WCE (полученного, как описано на стадии 3.2) в лунке из двух гелей, полученных на шаге 3.1.1 для обнаружения IRF3 формы. Нагрузка 8 - 10 мкг денатурированной WCE (полученного, как описано на стадии 3.2) в лунке на геле, полученного на стадии 3.1.2 для анализа SeV.
  5. Запуск гели при 30 постоянного тока до мА миграция фронт не достигнет дна геля.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Миграция как правило, длится приближенииДЕТАЛЬ 3 ч в течение 16 см геля и 45 мин для 8,5 см геля.
  6. Приступить к передаче на нитроцеллюлозные мембраны (шаг 5).

4. Анализ IRF3 димеризации по родной-PAGE

Примечание: Этот метод первоначально был описан группой доктора Т. Фуджита 27.

  1. Подготовьте верхние (-) и нижнюю (+) камеры электрофореза буферы. Верхняя буферная камера состоит из 25 мМ Трис-HCl рН 8,4 (РТ), 192 мМ глицина и 1% дезоксихолат натрия (DOC) в DDH 2 O. Нижняя буферная камера содержит 25 мМ Трис-HCl рН 8,4 (RT) и 192 мм глицина в DDh 2 O.
    Примечание: Верхние и нижние электрофореза буферы камеры можно хранить при температуре 4 ° С до использования. Тем не менее, убедитесь, что они предварительно нагревают до комнатной температуры перед выполнением электрофореза.
  2. Налейте неденатурирующих разрешающую гель минимуму длины 8,5 см, содержащей 7,5% акриламида / бис-акриламид (37,5: 1), 375 мМ Трис-HCl, рН 8,8 (РТ), 1% патроновnium персульфат и 0,1% TEMED в DDh 2 O.
  3. Предварительно запустить гель при постоянном 40 мА в течение 30 мин на льду. Нажмите бега аппарат в лед примерно до уровня нижней камеры буфер для электрофореза. Важно, что гель не в лед.
  4. Во время предварительной перспективе, смешать WCE хранили на льду с 2x родной-PAGE загрузки буфера 1: 1 (объем / объем), содержащий 125 мМ Трис-HCl рН 6,8 (РТ), 30% глицерина и 0,1% бромфенолового синего в DDH 2 O.
  5. Нагрузка 8 - 10 мкг WCE (полученного, как описано на стадии 4.4) непосредственно в конце предварительной перспективе.
  6. Запуск гель при 25 постоянного тока на мА льда, как описано выше для предварительной перспективе, пока миграция фронт не достигнет дна геля (примерно 40 мин).

5. Иммуноблот Анализ IRF3 видов

  1. Подготовка буфера передачи, содержащий 25 мМ Трис-Base и 192 мМ глицина в DDh 2 O. Охладить буфер передачи при 4 ° С до использования.
  2. Влажные три части нитроцеллюлозную мембрану сократить до размера чуть больше, чем гели в пластиковые / стекла коробке, содержащей буфер передачи. Укажите ориентацию мембраны за счет сокращения один угол. Буфер передачи может быть повторно использован в 3 раза. Хранить буфер при 4 ° С между видами.
  3. Uncast гели (SDS-PAGE и родной-PAGE) и сократить один угол каждой геля для правильной ориентации.
    1. Для родной-PAGE, инкубировать гель при комнатной температуре при осторожном перемешивании в течение по крайней мере 30 мин в управлении SDS-PAGE буфера, чтобы удалить DOC перед передачей в буфер передачи.
  4. Инкубируйте гели (SDS-PAGE и родной-страницы) в буфере передачи для 5 - 10 мин.
  5. Установите бутерброд передачи за геля в кассете передачи с мембраной в сторону положительного электрода (пена колодки / бумажный фильтр / мембрану / гель / бумажный фильтр / пены колодки). Будьте осторожны, чтобы удалить все пузырьки между слоями сэндвича.
  6. Выполните передачу в качестве рекомендуемых бу производителя для передачи аппарата, используемого.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все инкубации и моет в следующих шагах на качалке или орбитальной качалке платформы.
  7. В конце времени передачи, инкубировать мембраны в течение 15 мин в фиксирующем растворе, содержащем 7% уксусной кислоты, 40% этанола и 3% глицерина в DDH 2 O. Вымойте мембраны 3x 5 мин в PBS (137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 10,2 мМ Na 2 HPO 4 и 1,8 мм KH 2 PO 4 в дН 2 O).
    Внимание! Уксусная кислота является токсичным, раздражающим и воспламеняется. Носите защитные перчатки и манипулировать под вытяжкой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Решение фиксация могут быть использованы несколько раз.
  8. Для мембраны родной-PAGE перейдем непосредственно к шагу 5.11.
  9. Промыть три мембраны SDS-PAGE быстро в дН 2 O перед инкубацией их в течение 1 мин в красном пунцовый раствора, содержащего 6,57 мМ красный пунцовый и 1% уксусной кислоты в DDH 2 O.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Красный раствор пунцовый может быть г eused несколько раз.
  10. Промыть мембран в дН 2 O, пока фон не достаточно, чтобы увидеть белый белковых полос, окрашенных в красный цвет. Обратите внимание на маркеры с карандашом и вырезать лишнюю мембрану вокруг белков. Destain мембраны путем инкубации в течение 5 мин в PBS при перемешивании.
  11. Инкубируйте мембраны в течение 1 ч при комнатной температуре или O / N при 4 ° С в блокирующем растворе (PBS, содержащий 0,05% Tween 20 и 5% обезжиренного сухого молока (PBS-T-молоко). Промывка мембран 3x 5 мин в PBS-T.
    Примечание: для стирки PBS-T не является обязательным, и только строго необходимо при применении антител разводили в PBS-T, содержащем 5% бычий сывороточный альбумин (PBS-T-BSA) (фиг.1 и таблица 1) на следующем шаге.
  12. Инкубируйте четыре мембраны (из SDS-PAGE и родной-PAGE) с первичными антителами в соответствии с последовательно, изображенной на рисунке 1 и в таблице 1. Выполнение 5x 5 мин моет в PBS-T.
"> figure-protocol-1
Рисунок 1. Последовательность Иммуноблот анализов. Схема описывает отдельные SDS-PAGE и родной-PAGE гели, необходимые для обнаружения различных IRF3 фосфорилированные и мономерные / димерных форм. Удельный порядок антител, применяемых к мембране в результате каждого геля в порядке, иммуноблот описано. Следует отметить, что анти-актина антитела используют первым обеспечения равного загрузку образцов перед нанесением любых других специфических антител. Альтернативный последовательность, с анти-актина антител применяются после анти-фосфо-IRF3 антител, тоже работает. Зачистки используется между анти-актин и анти-SEV антител, или между анти-фосфо-IRF3 и анти-IRF3 антител из-за перекрытия размер сигналов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Первичные антитела Разведение Буфер для разведения Инкубация Вторичные антитела Комментарии
Антиактиновые 1/10000 PBS-T-БСА 15 мин при комнатной температуре Анти-мышь Используйте после SDS-PAGE
Разбавленные antibodyies могут быть повторно использованы несколько раз при хранении при 4 ° С в присутствии 0,02% азид натрия.
Анти-IRF3-Р-Ser386 1/200 PBS-T-БСА O / N при 4 ° С Анти-кроличий Используйте после Native-ПААГ.
Не рекомендуется повторно использовать разбавленный антитела
Анти-IRF3-Р-Ser396 1/10000 PBS-T-БСА O / N при 4 ° С Анти-кролик Использование после SDS-PAGE.
Не рекомендуется повторно использовать разбавленный антитела анти-IRF3-П-396 также доступна с клеточной сигнализации. Оптимальное разбавление определяется как 1/1000 для этого антитела, но может изменяться между партиями.
Анти-IRF3-Р-Ser398 1/10000 PBS-T-БСА O / N при 4 ° С Анти-кроличий Использование после SDS-PAGE. Не рекомендуется повторно использовать разбавленный антитела
Анти-IRF3 полная длина 1/7500 PBS-T-молоко 3 ч при комнатной температуре Анти-кроличий Использование после SDS-PAGE. Анти-IRF3 полноразмерное антитело может быть использован после родном-PAGE, но это менее чувствительны, чтобы обнаружить мономер. Разбавленные антитела могут быть использованы несколько раз при хранении при 4 ° С в присутствии 0,02% азид натрия.
Анти-IRF3-СВS 0,5 мкг / мл PBS-T-молоко 3 ч при комнатной температуре Анти-кроличий Используйте после Native-ПААГ. Разбавленные antibodyies могут быть повторно использованы несколько раз при хранении при 4 ° С в присутствии 0,02% азид натрия.
Анти-SeV 1/14000 PBS-T-БСА 3 ч при комнатной температуре Анти-кроличий Использование после SDS-PAGE. Разбавленные antibodyies могут быть повторно использованы несколько раз при хранении при 4 ° С в присутствии 0,02% азид натрия.
Примечание: Разведение и буфер, используемый для HRP-антител в сочетании вторичных должны быть оптимизированы как это варьируется от одной компании к другой.

Таблица 1. Технические характеристики антител используются в порядке Иммуноблоттинг.

  1. Инкубируйте мембраны с пероксидазой хрена (HRР) -conjugated вторичных антител, как описано в рисунке 1 и в таблице 1. Промывка мембран 5x 5 мин в PBS-T, а затем 2 раза 5 мин в PBS, чтобы полностью удалить следы Tween.
  2. Инкубируйте мембраны в течение 1 мин в объеме усиленной хемилюминесценции реагента, достаточное для полного покрытия мембраны. Высушите мембраны, используя фильтровальную бумагу.
  3. Поместите мембраны в анализаторе люминесцентных изображений для визуализации иммунореактивных полос.
    1. В качестве альтернативы, выполните обнаружение иммунореактивными диапазонах чувствительные рентгеновских пленок.
  4. Вымойте мембраны 3x 5 мин в PBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе мембраны могут быть сухими. Однако, если требуется дальнейшее зачистки, то лучше выполнить отпарной перед сушкой мембрану. Мембраны также могут быть сохранены на короткий срок в PBS.
  5. Для мембран, которые не требуют зачистки между инкубации с антителами (см рисунок 1) приступить непосредственно к этапу5.20.
  6. При снятии требуется между антителами (см Рисунок 1), инкубируют мембраны в предварительно нагретом извлекающего раствора, содержащего 2% SDS, 62,5 мМ Трис-HCl рН 6,8 (RT) и 0,7% бета-меркаптоэтанол в DDH 2 O при 50 ° С 20 мин при регулярном помешивании. Вымойте мембраны 3x 5 мин в PBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Агитация во время процедуры зачистки является ключевым. Разборка может быть выполнена в гибридизации печи. В качестве альтернативы, зачистки может быть выполнена с использованием мембран запечатанные в пластиковые мешки и погружали в ванну с водой. В этом случае важно, чтобы перемешивать мембран 4 - 5 раз в течение инкубации.
  7. Инкубируйте мембраны в течение 1 ч при комнатной температуре или O / N при 4 ° С в PBS-T-молока.
  8. Повторите шаги 5.12 5.16 согласно фиг.1.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Рисунок 2 показывает типичную иммуноблот образ IRF3 обнаружен с IRF3 общего антител и IRF3-phosphospecific антител против Ser396 и Ser398 после разрешения ЗЦЕ по высоким разрешением SDS-PAGE. В стимулированных клетках А549, IRF3 определяется двумя полосами 50 и 53 кДа на SDS-PAGE, соответствующей нефосфорилированный (форма I) и hypophosphorylated (форма II) видов IRF3. Воздействие А549 клеток Сев за 3 - 9 ч приводит к зависимости от времени сдвига медленно мигрируют гипе...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Протокол описан здесь состоит из комбинации высокого разрешения SDS-PAGE и родной-PAGE в сочетании с использованием нескольких phosphospecific антител, чтобы отличить мономерный / димерный и phosphoforms I-IV из IRF3. Соответствующее определение этих видов IRF3 важно в полной мере характеризуют активацию IRF3 в определенной настройки. Например, стимуляция ЛПС активированными макрофагами приводит к образованию димеров, Ser396 / 398 фосфорилированного IRF3 который проявляет hypophosphorylated (форма II), но не гиперфосфор...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Авторы благодарят предыдущих и нынешних сотрудников лаборатории за разработку протоколов. Работа была поддержана финансированием Канадского института исследований в области здравоохранения (CIHR) [грант # MOP-130527] и Совета по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады [NSERC-355306-2012]. NG является лауреатом исследовательской кафедры Tier II Canada. AR является студентом учебной программы Исследовательской сети респираторного здоровья от Fonds de la recherche du Québec-Santé (FRQS).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
F12/HamLife Technologies11765-054Тепло в 37 градусов; C ванну перед использованием.
Фетальная бычья сывороткаLife Technologies12483-020
L-глутаминLife Technologies25030-081
D-PBSLife Technologies14190-144Для клеточной культуры.
Трипсин/ЭДТА 0,25%Life Technologies25200-072
Штамм вируса Сендай Cantell ЧарльзРивер Лаборатории600503
HepesBioshopHEP001
Хлорид натрия (NaCl)BioshopSOD001.5
EDTABioshopEDT001
ГлицеринБиошопGLY001.1Разрежьте конечность кончика и медленно отпишьте пипеткой, так как он очень толстый.
IGEPAL CA-630Sigma-AldrichI7771Зарегистрированная торговая марка, соответствующая октилфенокси поли(этиленокси)этанолу (Nonidet P-40) моющему средству
LeupeptinBioshopLEU001
AprotininBioshopAPR600.25 
Фторид натрияSigma-Aldrich201154
ортванадат натрияMP Biomedicals159664активации ортованадата натрия 0,2 М: 1) Равномерное повышение pH до 10,0 с использованием либо 1 N NaOH, либо 1 N HCl. Начальный pH раствора ортотованадата натрия может варьироваться в зависимости от большого количества химических веществ. 2) Раствор желтый при pH 10,0. 3) Отварить до бесцветности. 5) Доведите pH до 10,0 и повторяйте шаги 3-4 до тех пор, пока раствор не останется бесцветным и не стабилизируется при 10,0. Храните активированные аликвоты ортованадата натрия при температуре -20°С.
-нитрофенилфосфат динатриевая соль гексагидратSigma-AldrichP1585
бета-глицерофосфатSigma-AldrichG6376 
Реагент для анализа белка Bio-Rad Био-Рад500-0006 Цитотоксических
Акриламид/бис-акриламид (37,5 : 1) 40%BioshopACR005 Цитотоксических
Tris-BaseBioshopDEO701
Соляная кислота (HCl)LabChemLC15320-4 Работа под вытяжным шкафом. Токсичен и раздражает.
Додецилсульфат натрия (SDS)BioshopSDS001.1 раздражитель.
Амониум персульфатSigma-AldrichA3678
TEMEDInvitrogen15524-010Токсичен и раздражает.
Бромофенол синийFisher ScientificB392-5
Бета-меркаптоэтанолSigma-AldrichM6250Работа под вытяжным шкафом. Токсичен для нервной системы, слизистых оболочек. Может быть токсичен для верхних дыхательных путей, глаз, центральной нервной системы.
ГлицинBioshopGLN001.5
Дезоксихолат натрияSigma-AldrichD6750
Гидроксид натрия (NaOH)BioshopSHY700 раздражитель.
Нитроцеллюлозная мембрана (0,45 мм)Bio-Rad162-0115
Уксусная кислота ледниковыйBioshopACE222.4Работа под вытяжным шкафом. Токсичный, раздражающий и легковоспламеняющийся.
Красный понсоSigma-AldrichP3504   
Хлорид калия (KCl)Sigma-AldrichP3911 Для PBS состав для иммуноблоттинга.
Na2HPO4BioshopSPD307.5Для состава PBS для иммуноблоттинга.
KH2PO4Sigma-AldrichP0662 Для PBS состав для иммуноблоттинга.
Бычий сывороточный альбуминSigma-AldrichA7906Для PBS-T-BSA состав для иммуноблоттинга.
Обезжиренное сухое молокоCarnation
Poly сорбат 20 (Tween)MP Biomedicals103168Разрежьте конечность наконечника и медленно пипетывайте, так как он очень толстый.
Anti-IRF-3-P-Ser386IBL-America18783Хранить при -20 oC. Избегайте замерзания/оттаивания.
Anti-IRF-3-P-Ser396Home made<>sup19Store аликвотируется при -80 oC. Избегайте замораживания/размораживания.
Фосфо-IRF-3 (Ser396) (4D4G)Технология клеточной сигнализации4947sхранится при -20 oC.
Anti-IRF-3-P-Ser398Home made<>sup15Store аликвотируется при -80 oC. Избегайте замораживания/размораживания.
Anti-IRF-3-full lengthActif motif39033Хранить при -80 oC. Избегайте замораживания/размораживания.
Anti-IRF3-NESIBL-America18781Store aliquoted at -20 oC.
Western Lightning Chemiluminescence Reagent PlusPerkin-Elmer Life SciencesNEL104001EA
LAS4000mini CCD камераGE healthcare
SDS-PAGE Стандарты молекулярной массы, широкий диапазонBio-Rad161-0317Хранение при -20 oC.
,

Ссылки

  1. Juang, Y. T., et al. Primary activation of interferon A and interferon B gene transcription by interferon regulatory factory-3. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (17), 9837-9842 (1998).
  2. Lin, R., Hiscott, J. A role for casein kinase II phosphorylation in the regulation of IRF-1 transcriptional activity. Mol Cell Biochem. 191 (1-2), 169-180 (1999).
  3. Grandvaux, N., et al. Transcriptional profiling of interferon regulatory factor 3 target genes: direct involvement in the regulation of interferon-stimulated genes. J Virol. 76 (11), 5532-5539 (2002).
  4. Thompson, M. R., Kaminski, J. J., Kurt-Jones, E. A., Fitzgerald, K. A. Pattern recognition receptors and the innate immune response to viral infection. Viruses. 3 (6), 920-940 (2011).
  5. Grandvaux, N., tenOever, B. R., Servant, M. J., Hiscott, J. The interferon antiviral response: from viral invasion to evasion. Curr Opin Infect Dis. 15 (3), 259-267 (2002).
  6. Servant, M. J., et al. Identification of Distinct Signaling Pathways Leading to the Phosphorylation of Interferon Regulatory Factor 3. J Biol Chem. 276 (1), 355-363 (2001).
  7. Qin, B. Y., et al. Crystal structure of IRF-3 reveals mechanism of autoinhibition and virus-induced phosphoactivation. Nat Struct Biol. 10 (11), 913-921 (2003).
  8. Takahasi, K., et al. X-ray crystal structure of IRF-3 and its functional implications. Nat Struct Biol. 10 (11), 922-927 (2003).
  9. Mori, M., et al. Identification of Ser-386 of interferon regulatory factor 3 as critical target for inducible phosphorylation that determines activation. J Biol Chem. 279 (11), 9698-9702 (2004).
  10. Clement, J. F., et al. Phosphorylation of IRF-3 on Ser 339 generates a hyperactive form of IRF-3 through regulation of dimerization and CBP association. J Virol. 82 (8), 3984-3996 (2008).
  11. Saitoh, T., et al. Negative regulation of interferon-regulatory factor 3-dependent innate antiviral response by the prolyl isomerase Pin1. Nat Immunol. 7 (6), 598-605 (2006).
  12. Wathelet, M. G., et al. Virus infection induces the assembly of coordinately activated transcription factors on the IFN-beta enhancer in vivo. Mol Cell. 1 (4), 507-518 (1998).
  13. Karpova, A. Y., Trost, M., Murray, J. M., Cantley, L. C., Howley, P. M. Interferon regulatory factor-3 is an in vivo target of DNA-PK. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (5), 2818-2823 (2002).
  14. Zhang, B., et al. The TAK1-JNK cascade is required for IRF3 function in the innate immune response. Cell Res. 19 (4), 412-428 (2009).
  15. Solis, M., et al. Involvement of TBK1 and IKKepsilon in lipopolysaccharide-induced activation of the interferon response in primary human macrophages. Eur J Immunol. 37 (2), 528-539 (2007).
  16. Soucy-Faulkner, A., et al. Requirement of NOX2 and reactive oxygen species for efficient RIG-I-mediated antiviral response through regulation of MAVS expression. PLoS Pathog. 6 (6), e1000930(2010).
  17. Lin, R., Heylbroeck, C., Pitha, P. M., Hiscott, J. Virus-dependent phosphorylation of the IRF-3 transcription factor regulates nuclear translocation, transactivation potential, and proteasome-mediated degradation. Mol Cell Biol. 18 (5), 2986-2996 (1998).
  18. Yoneyama, M., et al. Direct triggering of the type I interferon system by virus infection: activation of a transcription factor complex containing IRF-3 and CBP/p300. EMBO J. 17 (4), 1087-1095 (1998).
  19. Servant, M. J., et al. Identification of the minimal phosphoacceptor site required for in vivo activation of interferon regulatory factor 3 in response to virus and double-stranded RNA. J Biol Chem. 278 (11), 9441-9447 (2003).
  20. Bergstroem, B., et al. Identification of a novel in vivo virus-targeted phosphorylation site in interferon regulatory factor-3 (IRF3). J Biol Chem. 285 (32), 24904-24914 (2010).
  21. Takahasi, K., et al. Ser386 phosphorylation of transcription factor IRF-3 induces dimerization and association with CBP/p300 without overall conformational change. Genes Cells. 15 (8), 901-910 (2010).
  22. Noyce, R. S., Collins, S. E., Mossman, K. L. Differential modification of interferon regulatory factor 3 following virus particle entry. J Virol. 83 (9), 4013-4022 (2009).
  23. McCoy, C. E., Carpenter, S., Palsson-McDermott, E. M., Gearing, L. J., O'Neill, L. A. Glucocorticoids inhibit IRF3 phosphorylation in response to Toll-like receptor-3 and -4 by targeting TBK1 activation. J Biol Chem. 283 (21), 14277-14285 (2008).
  24. Oliere, S., et al. HTLV-1 evades type I interferon antiviral signaling by inducing the suppressor of cytokine signaling 1 (SOCS1). PLoS Pathog. 6 (11), e1001177(2010).
  25. Kato, H., et al. Cell type-specific involvement of RIG-I in antiviral response. Immunity. 23 (1), 19-28 (2005).
  26. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  27. Iwamura, T., et al. Induction of IRF-3/-7 kinase and NF-kappaB in response to double-stranded RNA and virus infection: common and unique pathways. Genes Cells. 6 (4), 375-388 (2001).
  28. tenOever, B. R., Servant, M. J., Grandvaux, N., Lin, R., Hiscott, J. Recognition of the measles virus nucleocapsid as a mechanism of IRF-3 activation. J Virol. 76 (8), 3659-3669 (2002).
  29. Bibeau-Poirier, A., et al. Involvement of the I{kappa}B Kinase (IKK)-Related Kinases Tank-Binding Kinase 1/IKKi and Cullin-Based Ubiquitin Ligases in IFN Regulatory Factor-3 Degradation. J Immunol. 177 (8), 5059-5067 (2006).
  30. Grandvaux, N., et al. Sustained Activation of Interferon Regulatory Factor 3 during Infection by Paramyxoviruses Requires MDA5. J Innate Immun. 6 (5), 650-662 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

IRF3SDS PAGENative PAGE
Высокое разрешение метод контроля Фосфорилирование-зависимая активация IRF3
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.