Методическая статья

Система впрыска под давлением для исследования Нейрофармакология обработки информации в Awake Behaving макаки Cortex

8.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/53724

⸱

14 марта 2016 г.

 ,  , 
1Cognitive Neuroscience Laboratory, German Primate Center, 2Faculty of Biology and Psychology, Goettingen University

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы показываем инъекцию нейрофармакологических веществ под давлением во время записи одной клетки у бодрствующей макаки в сознании. Эта процедура позволяет проводить фармакологические манипуляции в непосредственной близости от места записи коры головного мозга.

Аннотация

Нисходящая модуляция прямой обработки корковой информации функционально важна для многих когнитивных процессов, включая модуляцию обработки сенсорной информации вниманием. Однако мало что известно о том, какие нейромедиаторные системы участвуют в таких модуляциях. Практический способ решения этого вопроса заключается в сочетании записи одиночных клеток с местными и временными нейрофармакологическими манипуляциями на подходящей животной модели. В данной работе мы демонстрируем методику, сочетающую острую регистрацию одиночных клеток с введением нейрофармакологических агентов в непосредственной близости от регистрирующего электрода. На видео показана подготовка системы впрыска/регистрации давления, включая подготовку вещества, которое будет вводиться. Мы показываем, как макака-резус выполняет задание на визуальное внимание и процедуру одноединичной регистрации с помощью блочных фармакологических манипуляций.

Введение

В корковых и подкорковых областях на активность нейронов влияют различные нейромодуляторы, например ацетилхолин1. Эти модулирующие эффекты на нейронные реакции были описаныв исследованиях in vitro2, а также в электрофизиологических записях у животных, находящихся под наркозом3, и системных фармакологических манипуляциях улюдей4. Тем не менее, точная роль различных нейромодуляторов и участие различных подтипов рецепторов в значительной степени неизвестны. Чтобы измерить влияние специфических нейромодуляторов на активность отдельных нейронов, желательно вызвать временную смену нейромодулятора как можно ближе к записывающему электроду. Кроме того, важно, чтобы эти манипуляции проводились на бодрствующих животных, так как когнитивные функции присутствуют только при отсутствии анестезии. Кроме того, анестезия взаимодействует с холинергической и ГАМКергической системами5,6 и может приводить к изменениям нейронной активности3.

В течение последних десятилетий были разработаны и усовершенствованы два основных метода местной доставки лекарств: ионофорез и инъекция давления. В обоих методах препараты доставляются с помощью микропипеток, изготовленных либо из стекла, либо из стали. При ионофорезе электрический ток регулирует высвобождение препарата7. Кроме того, существует значительный вклад электроосмоса в общее количество выбрасываемых молекул8, коррелируя с диаметром наконечника9 микропипетки, а такжес концентрацией 8 используемого вещества. Ионофорез является мощным инструментом для быстрой и точной манипуляции с небольшими объемами нервной ткани. Для ионтофоретических инъекцийобычно используются многоцилиндровые микропипетки, одна из которых действует как записывающее устройство, а другие — как пипетки для доставки. Ограничением этого метода является то, что можно использовать только заряженные молекулы, что сильно ограничивает выбор лекарств.

Впрыск под давлением использует либо сжатие воздуха, либо механическое давление для выталкивания вещества из микропипетки. С помощью этого метода можно использовать любое растворимое вещество, заряженное или незаряженное, в том числе и крупные молекулы. Метод впрыска под давлением был впервые описан Рейнирсом в 1933 году и усовершенствован в 1950-х годах (обзор см. в Lalley11). В 1980-х годах метод был усовершенствован и теперь позволяет доставлять количества в нанолитре (в основном лидокаин12) в определенную область мозга13 с одновременным выполнением записи на одну клетку. Выброшенный объем обычно контролировали путем наблюдения за движением маркера, такого как мениск в верхней части пипетки13. Инъекция давления была впервые использована в 1990-х годах у бодрствующих животных, как внеклеточно14, так и внутриклеточно15,16. Основываясь на совокупном опыте, полученном в этих исследованиях, теперь стало возможным надежно регистрировать данные из различных структур мозга в сочетании с фармакологическими манипуляциями (см.17 для сравнения последних систем инъекций давления).

Постоянной открытой проблемой для обоих методов доставки лекарств является сложность определения точного объема введенных лекарств. Это еще более сложная задача для экспериментов с бодрствующими, ведущими себя макаками-резусами, где животное выполняет экспериментальную задачу в отдельной комнате. Это можно уменьшить, используя систему с программным управлением, а не полагаясь на визуальный маркер для постоянного мониторинга инъекции.

Описанная здесь система является расширением хорошо зарекомендовавшей себя электрофизиологической системы записи (Mini Matrix System) и сочетает в себе инъекционный пипетку с несколькими параллельно ориентированными записывающими электродами на определенных расстояниях в настраиваемой конфигурации. Фармакологическая манипуляция с тканью вблизи регистрирующего электрода возможна с использованием лишь небольшого количества вещества, что обеспечивает быстрое выздоровление и позволяет проводить несколько блоков инъекции и контроля/восстановления в течение ограниченного временного окна, предлагаемого поведенческой задачей животного.

Протокол

Уход за животными и все экспериментальные процедуры были проведены в соответствии с немецким законодательством, регулирующим ухода за животными и утверждается районным правительством Брауншвейг, Нижняя Саксония, Германия.

Примечание: Поскольку эксперимент проводится в естественных условиях, крайне важно для поддержания высоких стандартов гигиены. Всякий раз, когда это возможно, работать в стерильных условиях.

1. Подготовка инъекции / регистрирующей системы

  1. Стерилизацию трубку, которая соединяет микропипетки со шприцем. Используйте самую короткую длину трубы возможно в экспериментальной установке между топливным насосом и электрофизиологические системы записи.
  2. Очистите направляющие трубы системы записи, используя чистящие провода. Окунуть их в стерильной силиконовое масло и кормить их через отдельные направляющие трубки несколько раз.
  3. Вставьте стекло микропипетки кварца в одну направляющую трубку системы записи. Смотрите рисунок 1А.
  4. После фиксации микропипетки всистема записи, приложите стерильную трубку к металлическим штифтом микропипетки. Береги себя; хотя микропипетки фиксируется в системе он может легко сломать при креплении трубки. Используйте две стерильные пинцет для применения одинакового давления на штыре и трубки.
  5. Используйте жидкий клей высшего качества для герметизации стыка между трубой и микропипетки. Подождите, по крайней мере, 3 часа для клея, чтобы затвердеть перед заполнением микропипетки жидкостью.
  6. Вставьте микроэлектродов (например, из кварцевого стекла изоляцией платины вольфрама) в других положениях системы записи до или после вставки микропипетки.

2. Подготовка Вещество

  1. Стерилизовать 1,5 мл микроцентрифужных пробирок для последующего хранения растворов для инъекций с использованием автоклава или другой надежной процедуры.
  2. Взвесить соответствующее вещество скополамин гидрохлорид с получением раствора 5 мл 0,1 М раствора. Растворить в стерильном физиологическом растворе (0,9% NaCl).
  3. В стерильных условиях Iна вытяжным колпаком, профильтровать раствор с помощью шприца фильтр с достаточно большим диаметром пор, например, 0,2 мкм.
  4. Под вытяжкой, Алиготе раствора в объемах , достаточных для одного эксперимента, например, для скополамин, 500 мкл в стерильной 1,5 мл микроцентрифужных трубки. Используйте темные трубы для защиты от света вещество; В качестве альтернативы, обернуть трубы в алюминиевую фольгу. Для скополамин, хранить решение в срок до 14 дней при температуре 4 ° C.

3. Ежедневно Подготовка инъекций / Система записи

Примечание: При установке в системе записи, электроды и микропипетка сохраняются в растворе фермента (Tergazyme, 1% раствор деионизированной водой) между записями. Следующие шаги должны быть выполнены перед каждой записью.

  1. Соберите трубку вещества для инъекций. Позвольте ему достичь RT, если в холодильнике.
  2. Снимите систему впрыска / записи из ферментного раствора и прополоскать электродыи микропипетка деионизированной водой, чтобы очистить полностью ферментного раствора.
  3. Снимите переднюю крышку системы записи для того, чтобы визуально проверить уплотнение между микропипетки и трубкой.
  4. Нанесите стерильную силиконовое масло в зазор направляющей трубы (смотри рисунок 1А) и кончиков электродов и микропипетки для того , чтобы смазывать систему для плавного движения.
  5. Проверьте кончики электродов и микропипетки с помощью микроскопа, чтобы гарантировать, что они не повреждены. Align электроды и микропипетки под микроскопом так, чтобы они выходили из направляющих труб с одинаковой длины. Гнать их в направляющие трубки, останавливаясь, как только они больше не будут видны. Это определяется как положение электрода нулевой. Установите глубину электродов и микропипетки до 0 в программном обеспечении.
  6. Заполните стерильный шприц стерильным физиологическим раствором и вставить иглу в трубку, следя за тем, чтобы не проколоть стенку трубы. Привод микропипетки из направляющей трубки для Visuаль контроль потока вещества.
  7. Промывка по меньшей мере, 2 мл стерильного физиологического раствора через трубку и микропипетки чтобы убедиться в отсутствии воздуха остается в шприце или в трубке. Не наносите слишком большое давление на поршень шприца. Убедитесь, что соединение между трубкой и микропипетки запечатан. Если утечка видна, повторно клеить стык (этап 1.5) и отложить запись.
  8. Заполните новый стерильный шприц с раствором для инъекций и обмен его со стволом солевого шприца, то есть, держать иглу солевом заполненного шприца в трубке. Убедитесь, что воздух не передается в систему. Это лучше всего достигается путем заполнения иглодержатель с физиологическим раствором после удаления заполненные физиологическим раствором ствол.
  9. Промыть систему с 250 мкл раствора для инъекций, для того, чтобы полностью удалить физиологический раствор из трубки.
  10. С помощью программного обеспечения управления двигателем, убирается электроды и микропипетки в guidetubesto глубину, по меньшей мере -500 мкм.
    11. Нижняя направляющая труба кольцо (рис 1А) к нижней части направляющих труб для поддержания их фиксированное относительное положение.
  11. Очистите основание системы с этанолом, в частности, где он будет касаться записи камеры обезьяны.
  12. Закройте систему записи, заменив переднюю крышку и затянув винты.

4. Проверка системы впрыска топлива

Примечание: Несмотря на то, что компания калибрует систему, рекомендуется проверять выброшенного объемы с материалами, используемыми в экспериментальной установке (пробирки, шприцы и т.д.).

  1. Подготовьте систему, как описано в шаге 3, сохраняя электроды и микропипетки вытягивается из направляющих труб. На глубину по меньшей мере, 7000 мкм, рекомендуется, чтобы избежать потери объема измерений из-за адгезии вдоль внешней поверхности микропипетки и электродов.
  2. Установите систему записи в положении она будет использоваться в ходе эксперимента и поставить СиринGE в микроинъекции насос. Закрепите шприц на месте , используя резиновую ленту и регулируемую ручку (рис 1А). Сдвиньте подвижную часть насоса, пока она не встанет на место за поршень шприца.
  3. Использование программно-управляемый блок двигателя, вытолкнуть объем достаточно большой , чтобы быть точно измерено, например., 1000 п. Предпочтительно использовать один шаг, чтобы извлечь общий объем для того, чтобы избежать эффектов под действием капиллярных сил вдоль поверхности микропипетки. Очень низкая скорость (1 нл / с) также может привести к этому эффекту во время процедуры проверки.
  4. Собирают общий объем в контейнере, помещенных под микропипетки, или необходимо тщательно собрать выброшенный капли непосредственно от кончика микропипетки. Расчетный объем выбрасываемого с помощью пипетки или путем взвешивания с точностью масштаба.
  5. Повторите эту процедуру несколько раз, чтобы подтвердить измерения.

5. Острые Recordings

  1. Установите положение хусистемы записи. Это определяет точку, в которой направляющие трубки достичь твердой мозговой оболочки в пределах хронически имплантированного записи камеры. Убедитесь, что направляющие трубы убираются полностью (направляющей трубки г положение 0).
  2. Привести систему записи в исходное положение и поместите шприц в микроинъекции насосе. Закрепите шприц на месте , используя резиновую ленту и регулируемую ручку (рис 1А). Сдвиньте подвижную часть насоса, пока она не встанет на место за поршень шприца. Если капля вещества видна на кончике направляющих труб, тщательно удалить его с помощью стерильной ватным тампоном.
  3. Подготовьте животное для записи в соответствии с процедурой лаборатории (см 18 к примеру руководящих принципов).
  4. Надежно установите систему записи на записи камеры обезьяны.
  5. Медленно вручную опустить направляющие трубки в записи камеру, пока твердая мозговая оболочка не будет достигнуто, то привод электродов с помощью сотрудничества двигателяПрограммное обеспечение управляете.
  6. Поскольку это не представляется возможным измерить сопротивление микропипетки, первый привод с электродами и регулярно проверять их импедансы на разных глубинах. После проникновения ТМО успешно выполнена без повреждения электродов, заранее микропипетки.
  7. Привод электродов и микропипетки на глубину электрод-мишень, на которой область мозга, представляющая интерес, как ожидается, будет найден. Медленно электрод, пока не будет достаточно близко, чтобы записать деятельность одного блока, о чем свидетельствует хорошее отношение сигнал-шум в записываемый сигнал. Важно отметить, что положение записи электрода и микропипетки на той же глубине, чтобы обеспечить минимальное расстояние между электродом и микропипетки.
    1. Если это возможно, держать электроды и микропипетки на этой глубине в течение всей записи. Тем не менее, если единственный способ сохранить качество сигнала записанной ячейки для перемещения электродов, а затем привод электродов и микропипеткиодновременно для поддержания расстояния между ними.

6. Пространственное Внимание Задача

  1. В серии испытаний, присутствующих двух движущихся моделей точка на экране, один расположен в пределах рецептивного поля записанного нейроном и другой вне его, вместе с центрально представленной точки фиксации , что животное должно foveate на протяжении каждого испытания 19, 20.
    Примечание: обезьяна обучена реагировать на изменение направления в подают реплики точечного рисунка (целевое событие), игнорируя при этом каких - либо изменений направления в другой точечного растра, и вознаграждается с каплей жидкости для каждого успешного завершения судебного процесса 19, 20. В качестве сенсорной контрольной группы , обезьяна должна сообщить об изменении яркости точки фиксации, игнорируя при этом обе подвижные узоры точки (рисунок 2 для более подробного описания задачи).

7. Фармакологическая Манипуляция во время записи

Примечание: В то время как обезьяна выполняет задачу, вводят вещество в поблочно образом. Определены три последовательных блоков: управления, который действует в качестве основы; инъекции, в течение которого вещество выбрасывается; и восстановление, в течение которой клетки мишенью инъекционной возвращение к исходному.

  1. Во время блока инъекции, вводят предварительно определенного количества вещества через регулярные промежутки времени , например., 2 NL каждую минуту со скоростью 2 л / с. Для этого примера, использование скополамина гидрохлорид. Процесс впрыска управляется с помощью программного обеспечения, которое обеспечивает различные варианты. Например, можно использовать ступенчатую функцию, чтобы определить объем впрыска, и нажмите кнопку инъекции каждую минуту по часам программного обеспечения записи.
    Примечание: Точная длительность блока впрыска является веществом и эксперимента зависит, например, для использования скополамин 2 NL инъекции каждую минуту в течение 10 мин (20 нл в общей сложности).. Предпочтительно, чтобы не наступать электроды и микропипетка Дуринг блок инъекции.
  2. Обратите внимание на время и судебный процесс, в течение которого вещество впрыскивании глубину электродов и микропипетки, а также количество выброшенного вещества.
  3. Выполните блок впрыска с блоком восстановления, в котором не впрыскивают ни одно вещество. Длительность блока восстановления является вещество конкретным и должно быть определено в предварительных тестах. Монитор и не поддерживать качество записи выбранных отдельных единиц до конца блока восстановления.
  4. Повторите три блока до тех пор, пока качество записи и мотивация обезьяны позволяют.

8. Процедуры после записи

  1. После записи данных, убирается электроды и микропипетки в направляющих труб, а затем вручную убирается направляющих труб. Удалить систему записи из записи камеры обезьяны. Отпустите шприц из топливного насоса высокого давления и переноса системы в области подготовки для очистки.
  2. Ручка животное( в том числе очистку камеры 18 записи) в соответствии со стандартными процедурами лаборатории и вернуть его в жилищном объекте.
  3. Промыть наружную поверхность направляющих труб с перекисью водорода (3%), а затем деионизированной водой. Привод электродов и микропипетка из направляющих труб, полоскание перекисью водорода, а затем деионизированной воды.
  4. Заменить ствол шприца с бочонком шприца, заполненного стерильным физиологическим раствором, держа иглу в трубке. Промыть пробирку и микропипетки с 1-2 мл физиологического раствора. После промывки, снимите ствол и заполнить его с воздухом. Заново ствол в иглу и высушить трубку и микропипетки изнутри, осторожно толкая воздух через.
  5. Хранить направляющие трубы, расширенные электроды и микропипетки, погружали в раствор фермента, чтобы избежать высыхания, а также, чтобы обеспечить распад органического материала.

Результаты

На рисунке 2 представлена ​​пространственная задача внимание обезьяны выполняться во время процесса инъекции проводили. Обезьяна была обучена для участия либо стимула, расположенного в пределах рецептивного поля записанного нейроне (участие в), стимул, расположенный за пределами рецептивного поля (участие отказа) или точки фиксации (присутствовать-FIX). Эти условия позволяют сравнение активности нейронов в различных состояниях сосредоточения внимания.

На рисунке 3 показана пери-стимул времени гистограмма образца нейрон в эксперименте с использованием скополамин мускариновый холинергической антагонист. График демонстрирует подавление реакции во время инъекции скополамина по сравнению с отсутствием инъекции, когда паттерн движется в выделенном направлении клетки представлена ​​внутри рецептивного поля нейрона и принимают участие животного. Две первые пики представляют собой нейрон9; s ответ на балансовые и смещение пространственного реплике, которая появляется внутри его рецептивного поля. За этим следует ответ на движущийся узор, который появляется на экране 500 мс после того, как кий начала. Серая заштрихованная область изображает период анализа, используемый для расчета средней скорости стрельбы для каждого испытания. Зеленая зона подчеркивает угнетающее влияние инъекции скополамина на скорость стрельбы клетки. Темно-зеленая зона показывает подавление в течение периода анализа.

На фиг.4А показан эффект скополамина на частоте возбуждения образца нейрон в каждом из трех условий сосредоточения внимания. Скорость нейрона стрельбы для двух пространственных условий внимания (внимание внутри или снаружи рецептивного поля нейрона записи), а также для чувственного состояния (внимание на точки фиксации) упал вскоре после первой инъекции блока впрыска (серый затененном находятсяа) и в течение блока восстановления увеличивается после задержки на том же уровне, как и до инъекции.

На фиг.4В показан управление записью из второго образца нейрон , в котором вводился физиологический раствор (0,9% NaCl), используя тот же протокол, для инъекции скополамина. Во время инъекции блок не наблюдалось каких-либо изменений в скорости стрельбы нейрона по сравнению с блоком управления.

figure-results-1
Рисунок 1. Набор вверх используется для фармакологической манипуляции во время записи. (А) Изображен микроинъекции насос и электрофизиологические систему записи , оборудованный электродами и микропипетки. Разрыв guidetube, в которой силиконовое масло вводится для смазки электродов и микропипетки, показан в увеличенном виде. (B) показан пример микропипетки (выше)и записывающий электрод (ниже). Для сравнения размера, евроцент (диаметр 16 мм). Помещается под Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-2
Рисунок 2. Конструкция задач для руководства пространственного внимания. Обезьяны были обучены , чтобы обнаружить изменение направления движения в точечного растра подают реплики. Кий был либо в пределах рецептивного поля нейрона (участие в), как показано на рисунке, или за ее пределами (участие в отъезде). В качестве сенсорного управления, обезьяна была обучена , чтобы обнаружить изменение яркости точки фиксации (присутствовать-фикс). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

< IMG Alt = "Рисунок 3" SRC = "/ файлы / ftp_upload / 53724 / 53724fig3.jpg" />
Рисунок 3. Влияние антагониста скополамин на скорость стрельбы. Пери-раздражитель времени гистограмма для образца нейрон показан для-в посещают состоянии (внимание внутри рецептивного поля записанного нейрон) во время блока впрыска и во время контрольного блока. Ось х показывает время в миллисекундах после кия начала и оси у показана скорость стрельбы в шипы / сек. Серая зона изображает период анализа (300-800 мс после начала стимула), используемый для расчета скорости стрельбы проб усредняется. Зеленая заштрихованная область показывает подавление в скорости через двух условий стрельбы. Темно - зеленый цвет подчеркивает подавление в течение периода анализа. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Iles / ftp_upload / 53724 / 53724fig4.jpg "/>
Рисунок 4. Влияние скополамина и физиологического раствора на скорость стрельбы. (A) Антагонист инъекции скополамин. Проба усредненный скорострельность ячейки образца на рисунке 3 по ходу эксперимента показан на предпочтительный стимул для всех трех условий сосредоточения внимания. Ось х показывает время начала пробное в течение нескольких минут, а ось ординат показывает скорость стрельбы аппарата в спайки в секунду. Символы ( figure-results-3 участие в, figure-results-4 присутствовать-FIX, figure-results-5 присутствовать на выход) представляют скорость стрельбы нейрона в течение периода анализа в каждом успешно проведены испытания и горизонтальные линии (сплошная линия: участие в, пунктирная линия: присутствовать-FIX, прерывистая линия: присутствовать на выход) показывают среднюю скорость стрельбы для три различных экспериментальных блocks (контроль, инъекции, восстановление). Серая заштрихованная область показывает блок впрыска, начиная с первой инъекции и заканчивая 1 мин после последней инъекции. Во время инъекции блок 2 нл 0,1 мольного скополамина вводили каждую минуту со скоростью на инъекционном 2 л / с. (В) Физиологический раствор для инъекций. Стрельбы скорость клеточного образца за ходом контрольного эксперимента показан на предпочтительный стимул для всех трех условий сосредоточения внимания. Серый затененной области визуализирует блок инъекции физиологического раствора. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Обсуждение

Здесь мы подробно показано, как выполнить надежные и точные инъекции и высокое качество записи одноклеточных с "вне-шельф" впрыска под давлением системы. В то время как этот способ доставки лекарственных средств ранее использовалось в себя обезьян (обзор в 17), система , представленная здесь , имеет преимущества, рассмотренные ниже.

Как показано на фиг.4А, система , описанная здесь , может обеспечить стабильное измерение одной нейронной активности с использованием и без фармакологических инъекций в непосредственной близости от места записи. Как показано на фиг.4В, инъекция контрольного вещества, физиологический раствор, не приводило к изменению скорострельность. Этот контроль показывает, что сам процесс инъекции не оказывает ощутимого влияния на свойства теплотехнической записанных нейронов.

Пространственная конфигурация нейроне, записи электрода и микропипетки имеет решающее значение значение в этих экспериментах. Хотя точное измерение их относительных позиций в ткани во время записи не представляется возможным, мы можем рассмотреть и контроль за возможными источниками дисперсии. Во-первых, во время инъекции объема существует риск того, что нейрон интерес может быть смещен в сторону от регистрирующего электрода, влияя на стабильность записанных сигналов. По этой причине целесообразно сравнить скорострельность до и после блока впрыска для проверки стабильности сигнала. Во- вторых, конфигурация направляющей трубки системы регистрации определяет расстояние между электродами и микропипетки (например., 305 мкм в концентрической системе 3-канала , используемого в этом эксперименте). Поскольку система обеспечивает точное управление положением для глубины электродов и микропипетки в ткани, то расстояние между ними может быть сведено к минимуму путем тщательного калибровки относительную глубину до начала записи (этап 3.5), и держать их в общей глубине во время записи.

лор "> Потенциальные ограничения
В дополнение к в доме контроля качества со стороны производителя, система должна быть подтверждена в лабораторных условиях, в качестве различных марок труб, шприцы и т.д. могут быть использованы и может привести к различиям в выбрасываемых объемов. Хотя система может быть использована для введения очень малых объемах, как в эксперименте, показанном здесь, это ниже минимального объема, который может быть проверен из-за практических ограничений измерения в нормальных лабораторных условиях. Тем не менее, большие объемы нагнетательных можно использовать для вывода соотношения между программируемыми параметрами объема и объема, выброшенного аппаратными средствами. Если используются прозрачные трубки, дополнительный визуальный контроль процесса впрыска возможно путем измерения смещения визуального маркера.

Вставка микропипетки в систему является более сложным, чем для вставки электродных, как диаметр микропипетки немного больше, и материал более хрупким. К тому же,присоединение трубки к контакту микропипетки является сложной задачей, поскольку это влечет за собой высокий риск разрыва верхней части микропипетки. Тем не менее, время жизни успешно загружен микропипетки несколько месяцев, даже при ежедневном использовании.

На практике мы еще не сталкивались с засорение в системе впрыска во время очистки после записи системы. Тем не менее, ни один "онлайн" проверка не возможно, и существует риск того, что физическое закупорка (например, ткани на кончике микропипетки), может предотвратить инъекции вещества. Поэтому было бы целесообразно проанализировать данные консервативно, в том числе таких, как только те клетки, в дальнейшем анализе, которые показывают значительные изменения в стрельбе скорости между контрольными и нагнетательных блоков эксперимента.

Несмотря на их малый диаметр, микроэлектродов и пипеток сместит ткани головного мозга и может вызвать некоторые местные повреждения тканей. Это может быть сведено к минимуму с помощью вручную позиционированием иглы ВЭС-е направляющие трубки непосредственно над твердой мозговой оболочки. Электроды затем проникают в твердую мозговую оболочку и их нетронутость выводится путем измерения их импедансы онлайн. После этого микропипетка вставляется. При использовании этого подхода, регулярное удаление ткани над твердой мозговой оболочки, рекомендуется, чтобы дополнительно уменьшить риск электрода или пипетка поломки.

Сравнение с альтернативными методами
Система, используемая здесь, показывает явные преимущества по сравнению с другими системами впрыска под давлением. Одним сильным преимуществом является диаметр микропипетки (приблизительно 100 мкм), что в два раза меньше других доступных зондов 17 и , следовательно , сводит к минимуму повреждение нервной ткани. В отличие от предыдущих конструкций, текущая система использует пространственно разнесены записи электрода и микропипетки. Хотя другие системы обеспечивают меньшее расстояние между электродом и пипетку, система, описанная здесь, позволяет независимые изменения глубины электродов и пипетку, таким образом пермипеременные относительные к раб расстояния в пределах сеанса записи. Важно отметить, что никаких компромиссов в отношении качества записи не должно быть сделано, поскольку система впрыска является продолжением установленного записывающего устройства. В то время как только один микропипетка и, таким образом, одно вещество используется в данном протоколе, можно вводить несколько веществ в пределах одной экспериментальной процедуры. Для достижения этой цели несколько микропипетки может быть ввинчен в отдельные направляющие трубки и подключены к шприцам, смонтированных в отдельных насосов впрыска. И, наконец, управление системой легко, так как только одна компьютерная программа необходима для продвижения электродов и микропипетки, а также для выполнения инъекции давления в ходе эксперимента.

Сравнивая давление впрыска для ионофореза, есть относительные преимущества и недостатки. Например, давление впрыска требует больших объемов, чтобы вводить в ткани, чем ионофорез, тем самым увеличивая риск нейронного смещения. Ток протоCol используются объемы в диапазоне Н.Л., и мы редко испытывали заметные изменения в качестве сигнала проведено заносимое клетки. Система также позволяет большие объемы для инъекций, который является потенциально полезным для поведенческих манипуляций, но может повлиять на стабильность нейронного записи. Явным преимуществом впрыска давления над ионофореза является большее разнообразие годные к употреблению веществ, так как не требуется использовать заряженные вещества. Однако значения рН должны быть проверены и сопоставлены между экспериментальными и контрольными веществами (например., Физиологический раствор).

Может возникнуть вопрос, почему использовать устоявшееся метод инъекции давления вместо новых методов, таких как оптогенетика для манипулирования нейронной активности. Хотя хорошо известно у грызунов, оптогенетика еще не достоверно установлено в макак-резусов. В частности, пока не позволяет локальную манипуляцию клеток селективным для определенного типа нейромедиаторов. В более долгосрочной перспективе, мы видим,большой потенциал для сочетания преимуществ фармакологических манипуляций с преимуществами optogentic манипуляций в выяснении нейронную основу когнитивных функций.

Здесь мы показали, как давление впрыска может быть использован для его фармакологически манипулировать локально ограниченную область в мозге бодрствования, ведут себя макак-резус. Мы надеемся, что этот метод вдохновляет других ученых исследовать neuromodulatory вклад в динамику активности нейронов.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантами Deutsche Forschungsgemeinschaft через Научно-исследовательский центр "Collaborative 889 клеточных механизмов сенсорной обработки" на ST (Project C04). Мы благодарим Сина ПЛЮМЕР, Леонора Burchardt, Дирк Prüsse, Клаус Heisig и Ralf Brockhausen для технического и животных, связанных с поддержкой и наших соавторов в стволовой клетки группы немецкого Центра примата, д-р Катарина Debowski и Анны Magerhans, для оказания технической помощи в процесс фильтрации.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
(-)-Скополамина гидрохлоридSigma-Aldrich55-16-3Mr 339,81 г/моль
NaCl 0,9% B. Braun Melsungen AG30798705мл 
Terg-a-zymeSigma-AldrichZ273287фермент отпугивающий
Перекись водородаRothИспользуется в 3% растворе с деионизированной водой
ЭтанолChemie-Vertieb Hannover10464270%
деионизированной воды
Injekt 40 DuoB. Braun Melsungen AG9166432VШприц и игла 
Пробирки для микроцентрифуг Eppendorf Safe-Lock, янтарьEppendorf0030 120.1911,5ml 
Кварцевая микропипеткаThomas Recording
Записывающий электродThomas Recordingэлектрод из кварцевого/платино-вольфрамового волокна; значение импеданса 1-2 MΩ   и 0,3-0,5 MΩ
PharmedBPT-SchlauchSaint-Gobain Performance Plastics 3702003  Размер: 0,25 x 2,05 мм (Вес: 0,9 мм)
Loctite 401Henkel233641Суперклей
Силиконовое маслоThomas RecordingM-1000
Minisart RC15Sartorius17761----------RШприцевой фильтр
Многоканальная система микровпрыскаThomas Recordingмногоканальный микроэлектродный манипулятор» Система «Экхорн» оснащен микроэлектродами и микропипетками, а также прецизионным многоканальным микроинжекционным насосом
McLabдляуправления предъявлением стимулов

Ссылки

  1. Noudoost, B., Moore, T. The role of neuromodulators in selective attention. Trends Cogn Sci. 15 (12), 585-591 (2011).
  2. Jochems, A., Reboreda, A., Hasselmo, M., Yoshida, M. Cholinergic receptor activation supports persistent firing in layer III neurons in the medial entorhinal cortex. Behav Brain Res. 254, 108-115 (2013).
  3. Thiele, A., Herrero, J. L., Distler, C., Hoffmann, K. P. Contribution of cholinergic and GABAergic mechanisms to direction tuning, discriminability, response reliability, and neuronal rate correlations in macaque middle temporal area. J Neurosci. 32 (47), 16602-16615 (2012).
  4. Thienel, R., et al. Muscarinic antagonist effects on executive control of attention. Int J Neuropsychopharmacol. 12 (10), 1307-1317 (2009).
  5. Anthony, B. L., Dennison, R. L., Aronstam, R. S. Disruption of muscarinic receptor-G protein coupling is a general property of liquid volatile anesthetics. Neurosci Lett. 99 (1-2), 191-196 (1989).
  6. Yamakura, T., Bertaccini, E., Trudell, J. R., Harris, R. A. Anesthetics and ion channels: molecular models and sites of action. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 41, 23-51 (2001).
  7. Herr, N. R., Wightman, R. M. Improved techniques for examining rapid dopamine signaling with iontophoresis. Front Biosci. 5, 249-257 (2013).
  8. Bevan, P., Bradshaw, C. M., Pun, R. Y., Slater, N. T., Szabadi, E. The relative contribution of iontophoresis and electro-osmosis to the electrophoretic release of noradrenaline from multi barrelled micropipettes [proceedings]. Br J Pharmacol. 67 (3), 478-479 (1979).
  9. Herr, N. R., Kile, B. M., Carelli, R. M., Wightman, R. M. Electroosmotic flow and its contribution to iontophoretic delivery. Anal Chem. 80, 8635-8641 (2008).
  10. Thiele, A., Delicato, L. S., Roberts, M. J., Gieselmann, M. A. A novel electrode-pipette design for simultaneous recording of extracellular spikes and iontophoretic drug application in awake behaving monkeys. J Neurosci Meth. 158 (2-4), 207-211 (2006).
  11. Lalley, P. M. Microiontophoresis and Pressure Ejection: Modern Techniques in Neuroscience. Johansson, H., Windhorst, U. , 193-209 (1999).
  12. Malpeli, J. G., Schiller, P. H. A method of reversible inactivation of small regions of brain tissue. J Neurosci Meth. 1 (2), 145-159 (1979).
  13. Malpeli, J. G. Reversible inactivation of subcortical sites by drug injection. J Neurosci Meth. 86 (2), 119-128 (1999).
  14. Dias, E. C., Segraves, M. A. A pressure system for the microinjection of substances into the brain of awake monkeys. J Neurosci Meth. 72 (1), 43-47 (1997).
  15. Szente, M. B., Baranyi, A., Woody, C. D. Effects of protein kinase C inhibitor H-7on membrane properties and synaptic responses of neocortical neurons of awake cats. Brain Res. 506 (2), 281-286 (1990).
  16. Woody, C. D., Bartfai, T., Gruen, E., Nairn, A. lntracellular injection of cGMP-dependent protein kinase results in increased input resistance in neurons of the mammalian motor cortex. Brain Res. 386 (1-2), 379-385 (1986).
  17. Noudoost, B., Moore, T. A reliable microinjectrode system for use in behaving monkeys. J Neurosci Meth. 194 (2), 218-223 (2011).
  18. Association of Primate Veterinarians. Cranial Implant Care Guidelines for Nonhuman Primates in Biomedical Research. , Available from: http://www.primatevets.org/Content/files/Public/education/Cranial%20Implant%20Care%20Guidelines.pdf (2015).
  19. Treue, S., Martinez-Trujillo, J. C. Feature-based attention influences motion processing gain in macaque visual cortex. Nature. 399, 575-579 (1999).
  20. Martinez-Trujillo, J. C., Treue, S. Feature-based attention increases the selectivity of population responses in primate visual cortex. Curr Biol. 14 (9), 744-751 (2004).

Перепечатки и разрешения

Теги

Нейрофармакологическое воздействиерегистрация активности одиночных нейроновбодрствующая обезьяна в поведенческом экспериментеобработка информации в коре головного мозгазадача на зрительное вниманиеприготовление микропипетоквыравнивание направляющей трубкипротокол введения препаратапроверка импеданса электродов
Система впрыска под давлением для исследования Нейрофармакология обработки информации в Awake Behaving макаки Cortex
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.